秋石斛鈣依賴蛋白激酶基因的克隆及表達分析

林榕燕，鐘淮欽，陳藝荃，方能炎，孔 蘭，葉秀仙*

(1 福建省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所/福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心，福州 350013；2 福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福州 350003)

石斛(Dendrobiumspp.)是蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)多年生附生草本植物，根據(jù)開花時間和花序著生位置常將其分為春石斛和秋石斛[1]。秋石斛在秋季開花，花序著生于假鱗莖頂端，著花數(shù)5～20朵，其花姿優(yōu)雅、花色艷麗、花期長，是觀賞蘭花中的重要切花和盆花，在國際花卉市場上扮演著重要角色[2]。秋石斛原產(chǎn)地為東南亞和西太平洋島嶼等熱帶亞熱帶地區(qū)，其在生長過程中對溫度較為敏感，不適宜的溫度會導致秋石斛花朵的產(chǎn)量與質(zhì)量的下降，甚至停止生長。而在中國大部分地區(qū)，低溫仍是限制秋石斛生長發(fā)育的重要逆境因子之一[3]。因此，提高秋石斛的抗寒性以降低低溫傷害是秋石斛產(chǎn)業(yè)急需解決的主要問題，而獲得高抗寒性的秋石斛品種則是解決該問題的關(guān)鍵。其中開展秋石斛抗寒基因的挖掘與鑒定，是培育高抗寒性秋石斛新品種的一項重要工作。

鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase,CDPK/CPK)是一類在植物中廣泛存在的依賴鈣離子的 Ser/Thr 型蛋白激酶，是一類重要的鈣感受器，在植物的生長發(fā)育、應(yīng)答脅迫反應(yīng)中具有重要作用[4]。目前，模式植物和一些作物的CDPK基因家族成員已經(jīng)被分離和鑒定，擬南芥[5]中存在34個CDPK基因家族成員，玉米[6]中存在40個CDPK基因家族成員。此外，鐵皮石斛[7]、廣東桑[8]和番茄[9]等多種植物中的CDPK基因也陸續(xù)被報道[10-13]。隨著對CDPKs研究的深入，發(fā)現(xiàn)其能通過識別和參與細胞內(nèi)Ca2+信號轉(zhuǎn)導來響應(yīng)低溫、干旱、高鹽等多種逆境脅迫的生物學功能，如過表達BnCPK5能增強油菜的干旱脅迫耐受性[14]；玉米ZmCDPK6被證實不僅相應(yīng)高溫脅迫，還受到鹽脅迫和低溫脅迫誘導表達[15]；蝴蝶蘭PaCDPK1在應(yīng)答低溫、機械損傷和病原菌侵染時的轉(zhuǎn)錄水平提高[16]。

鑒于CDPK基因在植物響應(yīng)逆境脅迫中的重要性，特別是在應(yīng)對低溫脅迫方面，推測秋石斛CDPK中可能有相似的生物學功能。因此，本研究中通過克隆秋石斛CDPK基因，對其生物信息學進行分析，并對其在低溫脅迫下的表達情況進行研究，有助于后續(xù)秋石斛CDPK基因的功能驗證，為探明秋石斛抗寒的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

以生長狀況良好的秋石斛品種‘水芙蓉’為供試材料，取適量葉片于液氮速凍后進行RNA提取，用于CDPKs基因克隆。分別取‘水芙蓉’的根、莖、葉、花用于CDPKs基因的組織表達分析；分別取長勢相近的4個秋石斛品種(‘三亞陽光’、‘四面佛’、‘水芙蓉’及D128)葉片用于基因的表達分析和相對電導率的測定。取長勢相近的‘水芙蓉’分別于0 ℃和8 ℃條件下處理12 h，以置于資源圃常規(guī)條件(25 ℃)下的植株作為對照，于相應(yīng)時間點取葉片用于檢測低溫脅迫下基因的表達情況及相對電導率變化情況。

表1 秋石斛CDPK基因克隆及熒光定量PCR所用引物

1.2 試驗方法

1.2.1 秋石斛總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成參照林榕燕等[17]的方法，采用通用植物總RNA提取試劑盒(BioTeke)進行秋石斛總RNA提取，采用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa)進行cDNA 第一鏈的合成。

1.2.2 秋石斛CDPK基因cDNA序列擴增從NCBI上下載大花蕙蘭、鐵皮石斛的CDPK基因序列，根據(jù)同源克隆的原則設(shè)計了CDPK基因序列特異引物CDPK-F/CDPK-R(表1)，以合成的cDNA第一鏈為模板，進行PCR擴增。擴增體系為25 μL，包含了2×PCR buffer for KOD Fx 12.5 μL、2.0 mmol/L dNTP 5 μL，1 U/μL KOD Fx 0.5 μL，ddH2O 4 μL，100 ng/μL cDNA模板1 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL。PCR擴增程序：98 ℃預(yù)變性 2 min；98 ℃變性 30 s，53 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min 30 s，共35個循環(huán)；68 ℃延伸7 min。PCR擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖(1%)電泳進行檢測后，回收目的片段，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化，挑選陽性克隆送至測序公司測序完成。

1.2.3 生物信息學分析將測序獲得的序列翻譯成氨基酸序列后，利用ExPASy、CBS Prediction Servers、WoLF PSORT、Conserved Domain Search、SOPMA、DNAMAN、MEGA5.0等軟件進行CDPKs 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、亞細胞定位、保守結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)、序列多重比對分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。

1.2.4 秋石斛DenCDPKs基因定量表達分析以秋石斛不同品種不同處理材料的cDNA為模板，以Actin為內(nèi)參基因，利用引物(表1)，采用TB Green Premix Ex TaqTM試劑盒在7500 Real-Time PCR System儀(美國ABI公司)上檢測DenCDPKs基因在不同材料中的表達情況。qRT-PCR反應(yīng)體系為10 μL，包含TB Green Premix Ex Taq 5 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.2 μL，上、下游引物0.4 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 3 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 1 min；95 ℃變性 5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，共40個循環(huán)。每個反應(yīng)設(shè)3次重復(fù)，采用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進行定量分析。

1.2.5 秋石斛葉片相對電導率測定以秋石斛不同品種不同處理條件下的葉片為材料，對其相對電導率進行測定，具體方法參照徐新娟等[18]的方法，并做適當修改。先測量材料處于室溫下浸泡24 h后的電導率(E1)，而后將其置于100 ℃ 沸水浴中20 min，待冷卻至室溫后，再次測量電導率(E2)，相對電導率(REC/%)=E1/E2×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Execl 2007軟件進行分析，顯著性分析采用SPSS 20.0軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋石斛CDPK基因序列的獲得

經(jīng)PCR擴增，分別得到約2 000、2 000和2 300 bp左右的特異性條帶(圖1)。測序完成后，將結(jié)果提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫進行在線Blast，發(fā)現(xiàn)獲得的序列與鐵皮石斛的CDPK1、CDPK2、CDPK3基因序列的一致性分別達96.64%、95.89%和94.49%，說明所得片段序列為秋石斛CDPK1、CDPK2、CDPK3基因序列，命名為DenCDPK1(GenBank登錄號為MZ322902)、DenCDPK2(GenBank登錄號為MZ322903)、DenCDPK3(GenBank登錄號為MZ322904)。DenCDPK1基因片段大小為1 934 bp，包含一個長度為1 605 bp的完整開放閱讀框(219～1 823)，編碼534個氨基酸。DenCDPK2基因片段大小為1 971 bp，包含一個長度為1 626 bp的完整開放閱讀框(220～1 845)，編碼541個氨基酸。

M. DL2000；1. DenCDPK1；2. DenCDPK2；3. DenCDPK3圖1 秋石斛CDPK基因的克隆Fig.1 Cloning of CDPK gene in Dendrobium spp.

DenCDPK3基因片段大小為2 302 bp，包含一個長度為1 611 bp的完整開放閱讀框(410～2 020)，編碼536個氨基酸。

2.2 秋石斛DenCDPK蛋白質(zhì)生物信息學分析

秋石斛DenCDPK1、DenCDPK2、DenCDPK3蛋白質(zhì)的理論分子量分別為59.59、60.49和60.44 kD，等電點分別為6.03、6.14和6.62，分子式分別為C2643H4182N714O808S22、C2648H4222N764O806S26和C2680H4269N747O803S20，總平均疏水指數(shù)(GRAVY)分別為-0.447、-0.480和-0.509，說明三者均為親水蛋白質(zhì)，且三者均不具有跨膜結(jié)構(gòu)。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，三者二級結(jié)構(gòu)均以α-螺旋(44.01%、47.87%和45.34%)和無規(guī)則卷曲(36.70%、34.57%和36.38%)為主，β-轉(zhuǎn)角(10.30%、9.61%和9.51%)和延伸鏈(8.99%、7.95%和8.77%)所占比率較低。

此外，DenCDPK1中Lys所占比重較大，比例達8.2%，Trp含量最低，僅為0.7%；定位于葉綠體的可能性最大；該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為42.55，表明它是一個不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。DenCDPK2中Gly所占比重較大，比例達9.2%，Trp含量最低，僅為1.1%；定位于細胞質(zhì)的可能性最大；該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為44.88，表明它是一個不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。DenCDPK3中Lys所占比重較大，比例達9.7%，Trp含量最低，僅為0.9%；定位于細胞質(zhì)的可能性最大；該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為35.18，將其歸為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.3 秋石斛DenCDPK蛋白質(zhì)序列一致性比對與進化分析

Blast比對結(jié)果顯示，DenCDPK1氨基酸序列與鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale，AGA83664.1)的一致性為97%，與桃紅蝴蝶蘭(Phalaenopsisequestris，XP_020577380.1)的一致性為92%，與深圳擬蘭(Apostasiashenzhenica，PKA45643.1)的一致性為84%。DenCDPK2氨基酸序列與鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale，XP_020684921.1)的一致性為99%，與桃紅蝴蝶蘭(Phalaenopsisequestris，XP_020594551.1)的一致性為96%，與深圳擬蘭(Apostasiashenzhenica，PKA50602.1)的一致性為91%。DenCDPK3氨基酸序列與鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale，AGI21023.1)的一致性為97%，與桃紅蝴蝶蘭(Phalaenopsisequestris，XP_020574779.1)的一致性為94%，與深圳擬蘭(Apostasiashenzhenica，PKA49856.1)的一致性為87%。利用DNAMAN軟件進行序列多重比對分析，發(fā)現(xiàn)不同植物的CDPK之間具有較高的一致性，且這些序列都具有 CDPK 家族特有的保守結(jié)構(gòu)域，從氨基末端開始有STKc_CAMK結(jié)構(gòu)域(Ser/Thr蛋白激酶區(qū))和4個EF-hand結(jié)構(gòu)域(圖2)。

Den.秋石斛；Do.鐵皮石斛；As.深圳擬蘭；虛線為Ser/Thr蛋白激酶區(qū)；實線為4個 EF-hand 結(jié)構(gòu)圖2 秋石斛與其他植物CDPK氨基酸序列多重比對Den. Dendrobium spp.; Do. Dendrobium officinale; As. Apostasia shenzhenica; Dotted lines indicate Ser/Thr protein kinase domain; Solid lines indicate four EF-hand structuresFig.2 Multiple alignment of the amino acid sequences of CDPK among Dendrobium spp. and other plants

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載擬南芥的34個CDPK蛋白質(zhì)序列及鐵皮石斛的3個CDPK蛋白質(zhì)序列，采用MEGA5.0軟件構(gòu)建CDPK系統(tǒng)進化樹(圖3)。參照洪旭升等[19]的研究報道，將構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹分為4個組，其中DenCDPK1先與DoCPK1聚為一類，并于AtCDPK9和AtCDPK33的親緣關(guān)系較近，位于第Ⅱ組；DenCDPK2先與DoCDPK3聚為一類，并與AtCDPK13的親緣關(guān)系較近，DenCDPK3先與DoCPK3聚為一類，并與AtCDPK14和AtCDPK32的親緣關(guān)系較近，且DenCDPK2和DenCDPK3位于第Ⅲ組。

Den.秋石斛；Do.鐵皮石斛；At.擬南芥圖3 DenCDPK系統(tǒng)進化樹Den. Dendrobium spp.; Do. Dendrobium officinale; At. Arabidopsis thalianaFig.3 Phylogenetic tree of DenCDPK

2.4 秋石斛CDPK基因表達分析

以秋石斛‘水芙蓉’根、莖、葉、花的cDNA為模板，通過實時熒光定量PCR分析DenCDPKs基因的表達水平(圖4)。DenCDPK1和DenCDPK3基因的相對表達量表現(xiàn)為葉>根>花>莖，DenCDPK2基因的相對表達量表現(xiàn)為葉>莖>根>花，三者在葉中的相對表達量均顯著高于在其他組織中的相對表達量，其中DenCDPK3基因在葉中的相對表達量是其在莖中的10倍。

不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)，下同圖4 秋石斛DenCDPK在不同組織中的相對表達量Different normal letters represented significant difference (P<0.05); the same as belowFig.4 Expression levels of DenCDPK in different tissues of Dendrobium spp.

以秋石斛不同品種‘水芙蓉’、‘三亞陽光’、D128和‘四面佛’葉片的cDNA為模板，通過實時熒光定量PCR分析DenCDPKs基因的表達水平(圖5)。DenCDPK1基因的相對表達量表現(xiàn)為‘水芙蓉’>‘四面佛’>‘三亞陽光’>D128，其中‘水芙蓉’葉片中該基因的相對表達量是D128的12倍。DenCDPK2基因的相對表達量表現(xiàn)為‘水芙蓉’>D128>‘三亞陽光’>‘四面佛’，其中‘水芙蓉’葉片中該基因的表達量是‘四面佛’的100倍。DenCDPK3基因的相對表達量表現(xiàn)為‘四面佛’>D128>‘水芙蓉’>‘三亞陽光’，其中‘四面佛’葉片中該基因的表達量是‘三亞陽光’的88倍。

圖5 秋石斛DenCDPK在不同品種中的相對表達量Fig. 5 Expression levels of DenCDPK in different varieties of Dendrobium spp.

以秋石斛‘水芙蓉’在常規(guī)條件(25 ℃，對照組)和低溫處理(8 ℃、0 ℃)12 h后的葉片cDNA為模板，通過實時熒光定量PCR分析DenCDPKs基因的表達水平(圖6)。DenCDPK1和DenCDPK2基因的相對表達量隨著處理溫度的降低表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，在處理溫度為8 ℃時，基因的相對表達量顯著高于對照組和0 ℃處理組。DenCDPK3基因的相對表達量隨著處理溫度的降低表現(xiàn)為不斷上升的趨勢，在處理溫度為8 ℃時，DenCDPK3基因的相對表達量顯著高于對照組；在處理溫度為0 ℃時，DenCDPK3基因的相對表達量顯著高于對照組和8 ℃處理組。

圖6 秋石斛DenCDPK在不同條件下的相對表達量Fig.6 Expression levels of DenCDPK under different conditions of Dendrobium spp.

2.5 不同條件下秋石斛葉片中相對電導率的比較

通過比較秋石斛不同品種葉片在常溫下的相對電導率(圖7)，發(fā)現(xiàn)相對電導率在4個品種中的大小依次為‘四面佛’、‘三亞陽光’、D128和‘水芙蓉’，且各品種間的相對電導率呈顯著差異。

圖7 不同品種秋石斛葉片的相對電導率Fig.7 Relative electrical conductivity of leaves in different varieties of Dendrobium spp.

通過比較秋石斛‘水芙蓉’在常規(guī)條件(25 ℃，對照組)和低溫處理(8 ℃、0 ℃)12 h后葉片的相對電導率(圖8)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)低溫處理12 h后，葉片中的相對電導率均顯著提高，且隨著處理溫度的降低，葉片的相對電導率呈上升趨勢，在處理溫度為0 ℃時，顯著高于對照組和8 ℃處理組。

圖8 不同處理條件下秋石斛葉片的相對電導率Fig.8 Relative electrical conductivity of leaves under different conditions in Dendrobium spp.

3 討 論

鈣依賴蛋白激酶(CDPK)作為鈣結(jié)合蛋白之一，是植物細胞信號轉(zhuǎn)導途徑中的重要一環(huán)。近年來，越來越多的植物CDPKs基因被分離鑒定，并被報道廣泛參與植物的生長發(fā)育和抵抗逆境脅迫的調(diào)控反應(yīng)[20-22]。本研究在秋石斛‘水芙蓉’葉片中克隆獲得了3個CDPK基因，將其命名為DenCDPK1、DenCDPK2和DenCDPK3，分別編碼534、541和

536個氨基酸。分析3個基因編碼氨基酸的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)三者的基本理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)特征極為相似，均為親水蛋白質(zhì)，且存在STKc_CAMK結(jié)構(gòu)域，這與報道的鐵皮石斛[23]、青花菜[24]等植物的序列結(jié)構(gòu)特征一致。三者的差異在于DenCDPK1定位于葉綠體的可能性最大，而DenCDPK2、DenCDPK3定位于細胞質(zhì)的可能性最大，這與在細胞膜、細胞質(zhì)、線粒體、葉綠體、染色體和細胞核中均有 CDPKs存在的現(xiàn)象相符[25]。

CDPKs基因的表達存在組織特異性，辣椒CaCDPK09、CaCDPK18等基因在各組織中均有較高表達量，CaCDPK28、CaCDPK04則在各組織表達量都很低，而CaCDPK02、CaCDPK03等基因只在花芽和花中表達，CaCDPK07、CaCDPK14等只在根、莖、葉中高表達[26]。本研究中DenCDPKs在根、莖、葉、花中均有表達，DenCDPK1和DenCDPK3基因在葉中高表達，在莖中低表達；DenCDPK2基因同樣在葉中高表達，但在花中低表達。

CDPKs基因表達還受溫度、鹽脅迫、植物激素等的影響，羊草LcCDPK在高濃度鹽堿處理條件下上調(diào)表達[27]；朝鮮淫羊藿EkCDPK在干旱脅迫后15 h內(nèi)表達量顯著高于對照組[28]；馬鈴薯StCDPK基因的表達量在4℃處理12 h時出現(xiàn)峰值[29]。本研究中，DenCDPK1、DenCDPK2和DenCDPK3基因分別在處理溫度為8 ℃、8 ℃和0 ℃時相對表達量顯著高于對照組，說明了DenCDPKs受到低溫誘導表達，推測DenCDPKs基因參與到秋石斛低溫脅迫響應(yīng)過程。

有研究表明，相對電導率在一定程度上反映了膜脂的損傷程度，與抗寒性呈負相關(guān)，可在一定程度上體現(xiàn)植物的抗寒性[30]。本研究中葉片的相對電導率隨溫度降低呈上升趨勢，在0℃時相對電導率最大，這一變化趨勢與DenCDPK3基因在低溫處理下的表達模式一致，說明DenCDPK3基因可能參與秋石斛低溫脅迫的應(yīng)激反應(yīng)。研究還發(fā)現(xiàn)相對電導率在4個品種中的大小為‘四面佛’>‘三亞陽光’>D128>‘水芙蓉’，初步判斷4個秋石斛品種的抗寒性大小為‘水芙蓉’>D128>‘三亞陽光’>‘四面佛’，這一結(jié)果與前期通過LT50評價法和隸屬函數(shù)分析法綜合評價的秋石斛抗寒性大小一致[31]，也與DenCDPK2基因在不同品種葉片的表達模式相符，說明DenCDPK2基因的表達與秋石斛的抗寒性有一定的相關(guān)性。此外，系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，DenCDPK2與AtCDPK13的親緣關(guān)系較近，而前人的研究證實了AtCDPK13在擬南芥保衛(wèi)細胞中的過表達抑制了光誘導的氣孔開放，推測DenCDPK2可能有相似功能[32]。

以上結(jié)果均表明，本研究克隆獲得的DenCDPKs是可能參與秋石斛低溫脅迫應(yīng)對的鈣依賴型蛋白激酶，特別是DenCDPK2可能在秋石斛抗寒過程中發(fā)揮著重要作用，但其在低溫脅迫下的調(diào)控機制和功能還需進一步研究，后續(xù)將通過分子生物學手段調(diào)節(jié)CDPK基因的表達，分析下游基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示CDPK基因的作用機理，進而為研究秋石斛抗寒機制奠定基礎(chǔ)，同時也為今后的品種創(chuàng)新提供基因資源。