HIV-1原發(fā)性耐藥國內外研究進展*

曹旭健 綜述,曹 靜，祁 慧，余維維，曾紫微，彭勇權,王 敏△ 審校

(1.南華大學衡陽醫(yī)學院/長沙市第一醫(yī)院研究生協(xié)作培養(yǎng)基地，湖南 衡陽 421001； 2.長沙市第一醫(yī)院艾滋病研究所，湖南 長沙 410000)

獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的一種慢性傳染性疾病。HIV通過攻擊人體免疫系統(tǒng)CD4+T淋巴細胞，導致其數(shù)量減少和功能缺陷，使機體逐漸喪失免疫功能，引起各種機會性感染及惡性腫瘤。截至2020年底全球共存活3 770萬HIV感染者/AIDS患者(HIV/AIDS)，其中2 750萬人正在接受聯(lián)合抗逆轉錄病毒治療(cART)[1]。cART可最大限度地抑制病毒復制，重建患者免疫功能，從而延緩病程進展，提高患者生活質量，大幅降低了患者病死率[2]。

自從2006年“四免一關懷”政策在我國實行以來，越來越多的HIV/AIDS接受了正規(guī)檢測與治療，cART覆蓋范圍逐漸擴大。該政策極大地降低了我國AIDS患者病死率，對我國AIDS防治工作帶來巨大幫助。然而，隨著抗病毒治療不斷推廣應用，原發(fā)性耐藥(PDR)也不斷增加。現(xiàn)將HIV-1 PDR產(chǎn)生機制、檢測技術、現(xiàn)況、對治療結局的影響、患者管理策略等研究進展綜述如下。

1 HIV-1 PDR產(chǎn)生機制

HIV包括HIV-1和HIV-2，二者均屬于HIV組，在進入細胞后的復制機制、傳播方式、臨床結局(最終發(fā)展成為AIDS)等基本相同[3]。然而HIV-1毒株在世界廣泛傳播，而HIV-2的流行主要局限于西非及某些歐洲國家(葡萄牙、法國)[4]。因此，學者主要針對HIV-1 PDR情況進行了研究。

HIV-1耐藥性是在病毒自身因素及抗病毒藥物選擇壓力作用產(chǎn)生的[5]。HIV-1作為RNA病毒具有高度遺傳變異性，進入細胞后需要在逆轉錄酶作用下將RNA逆轉錄為cDNA，而參與HIV-1復制的逆轉錄僅具有DNA聚合酶的合成功能，缺少校正功能，因此，HIV-1復制具有易錯傾向，平均每輪復制每個基因組約產(chǎn)生0.2個堿基變異[6-7]，并且HIV-1具有高復制率，每天能產(chǎn)生1010～1012個新病毒[8]，導致產(chǎn)生的堿基變異快速累積和放大。另一方面，隨著cART的普及，在藥物的選擇壓力作用下野生毒株與耐藥毒株失去平衡，耐藥毒株成為優(yōu)勢毒株，最終對抗病毒藥物產(chǎn)生耐藥。病毒復制程度及抗病毒藥物的選擇壓力均可導致耐藥突變(DRM)的產(chǎn)生和累積[9]，發(fā)生耐藥的HIV-1毒株可在人群中傳播，導致新確診的HIV-1感染者在進行抗病毒治療前就存在了耐藥毒株感染，即PDR,又稱為傳播性耐藥。而獲得性耐藥(ADR)是指在患者治療過程中藥物選擇壓力作用下病毒基因突變導致的耐藥。據(jù)文獻報道，PDR可導致抗病毒治療失敗，加重治療負擔[10-11]。PDR的發(fā)生會降低抗病毒藥物療效并限制cART方案的選擇；對患者而言，一旦出現(xiàn)PDR，所負擔的治療費用及病死率均將增加；對社會而言，PDR毒株的傳播不利于HIV/AIDS疫情防控。因此，《中國艾滋病診療指南(2021年版)》[12]及《Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Adults and Adolescents with HIV》[13]均推薦在抗病毒治療前為患者進行基因型耐藥檢測(GDRAs)，以指導抗病毒方案的選擇。

2 HIV-1 PDR檢測技術

HIV耐藥檢測技術包括表型耐藥檢測(PDRAs)和GDRAs，二者均存在一定優(yōu)勢及技術限制，GDRAs技術簡單、成本更低，因此，目前針對新診斷HIV-1感染者治療前耐藥檢測通常采用GDRAs。

2.1PDRAs技術 PDRAs的原理是基于體外培養(yǎng)技術，通過檢測待檢樣本中抑制病毒生長所需的抗病毒藥物濃度，與敏感參考株進行比較，得到病毒株的耐藥情況[14]。其方法之一是運用逆轉錄-聚合酶鏈反應(PCR)擴增患者的基因片段(蛋白酶、整合酶及逆轉錄酶等)，并將其植入野毒株內以獲得重組病毒，通過重組病毒進行耐藥檢測[15]。一個關于PDRAs的關鍵指標是抑制50%病毒復制需要的抗病毒藥物濃度(IC50)。若將患者感染病毒株的IC50與藥物敏感參考毒株的IC50進行比較即可得出倍數(shù)變化值。由于PDRAs技術需要更高的成本和更長的檢測時間，目前僅用于藥物開發(fā)、耐藥相關研究及多次抗病毒治療失敗的臨床病例中[16]。

2.2GDRAs技術 GDRAs是對患者所感染的HIV-1基因組序列進行分析并與已知的針對抗逆轉錄病毒耐藥的病毒序列譜進行比較[14]。實際方法是提取HIV-1感染者血漿中的病毒RNA，采用逆轉錄-PCR方法擴增與耐藥性密切相關的基因片段并且進行序列測定后根據(jù)已建立的耐藥性突變位點數(shù)據(jù)庫(如斯坦福大學HIV耐藥數(shù)據(jù)庫https://hivdb.stanford.edu)進行耐藥位點分析。該方法的優(yōu)點是簡單、快速及價格較低。但也存在數(shù)據(jù)庫信息不足、耐藥程度難以評價及無法對新型抗病毒藥物耐藥進行評價等問題[17]。GDRAs依賴于高質量、標準化的手段檢測出患者的DRM，目前，GDRAs最主要的方法是Sanger測序，Sanger測序操作簡單，是HIV-1耐藥檢測的“金標準”[18-19]。另外一種二代測序方法(NGS)的檢測結果與Sanger測序的結果具有高度一致性，但當突變株比例小于20%時NGS具有更高的靈敏度[20]。HIV/AIDS應該在抗病毒治療前、治療失敗后及病毒載量下降不理想時進行耐藥檢測。這種檢測在發(fā)達國家是常規(guī)進行的，而在發(fā)展中國家由于成本等因素耐藥檢測難以推廣應用，一項使用羅氏454焦磷酸測序系統(tǒng)進行的GDRAs調查結果顯示，相較于Sanger測序，該方法靈敏度高4倍，并且在一次運行期間可檢測至少48例患者樣本(比Sanger測序多4倍)，該方法可降低3～5倍成本，有望在發(fā)展中國家廣泛使用[21]。NGS進行HIV耐藥檢測的步驟：(1)對樣本進行核酸提??；(2)對目標HIV基因進行PCR擴增；(3)文庫構建；(4)測序；(5)結果分析。由于NGS易受外界影響、測序結果的分析處理系統(tǒng)不完善及對技術人員操作水平要求更高，因此，在其廣泛用于臨床耐藥檢測前仍需進行優(yōu)化改進[22]。

3 PDR現(xiàn)況

3.1世界各地PDR現(xiàn)況 在歐美一些發(fā)達國家PDR率呈下降趨勢[23]，與其日益更新的強效抗病毒藥物有關。來自法國的一項關于PDR的研究結果顯示，法國PDR率為10.8%，其中多數(shù)是(4.0%)對非核苷酸類逆轉錄酶抑制劑(NNRTIs)產(chǎn)生的耐藥，存在PDR的患者最常見的病毒亞型為B亞型，但同時重組亞型(如毒性更強的CRF02_AG毒株)也在增加，提示HIV-1在不斷進化重組[24]。而在美國，PDR率高達18%，其發(fā)現(xiàn)PDR在男性、20～29歲、男男性行為人群、CD4+T淋巴細胞計數(shù)大于或等于200個/μL者中更為常見[25]。在巴西一項針對596例HIV/AIDS進行的調查結果顯示，PDR率為10.9%，并且發(fā)現(xiàn)根據(jù)GDRAs檢測結果調整cART方案能獲得更高的病毒學抑制率[26]。疫情最嚴重的撒哈拉以南非洲地區(qū)生活著全球70%以上的HIV/AIDS及近90%的兒童HIV/AIDS，有研究表明，該地區(qū)PDR率為5.6%，并且在該地推行抗病毒治療時間越長的國家PDR率越高[27]。一項關于我國PDR現(xiàn)況的meta分析結果顯示，我國PDR率為3.6%[28]?？共《局苿鞍酌敢种苿⒑塑账犷惸孓D錄酶抑制劑(NRTIs)、NNRTIs耐藥率分別為1.1%、1.3%、1.6%，但未統(tǒng)計關于整合酶抑制劑(INSTIs)耐藥情況。目前，我國PDR仍是針對NRTIs及NNRTIs耐藥，原因在于這兩類藥物基因屏障低、抗病毒治療推行時間長，然而我國指南仍推薦2種NRTI及1種NNRTI作為成人及青少年初治方案之一，因此，完善治療前耐藥檢測有助于為患者制定個性化抗病毒方案?！禘ACS Guidelines》[29]建議，如需要在沒有GDRAs檢測結果的情況下啟動cART，含INSTIs的方案可迅速降低病毒載量。同時，INSTIs也具有耐藥屏障高的優(yōu)點，但鄧雪媚等[30]于2015—2016年云南省進行的治療前耐藥檢測的513例有效基因序列中仍發(fā)現(xiàn)9例(1.7%)對INSTIs PDR。提示盡管INSTIs具有較高的基因屏障，其可能仍然并非是一種完全活性的抗病毒藥物，也需要注意對該類抗病毒藥物的耐藥情況進行監(jiān)控。

3.2國內各地PDR現(xiàn)況 盡管我國PDR率處于世界衛(wèi)生組織(WHO)報告的低水平耐藥流行預警行列(<5%)，但我國各地區(qū)PDR率仍存在一定差異。廣西壯族自治區(qū)PDR率為7.21%[31]。寧夏回族自治區(qū)PDR率為12.1%，高于我國浙江省(11.1%)、黑龍江省(8.3%)、北京市(3.4%)和上海市(2.7%)[32-36]。江蘇省PDR率為2.8%，盡管該省PDR率暫時處于WHO報告的低水平耐藥流行預警行列，但亞型分析結果顯示，該省CRFs和URFs大量出現(xiàn)，導致該省亞型結構明顯改變，亞型結構改變提示HIV-1感染者人口特征變化，以及病毒不斷突變、重組等，因此，需進一步加大對HIV/AIDS疫情的防控[37]。我國各地PDR率分布見圖1。

圖1 我國各地PDR率分布

4 PDR對治療結局的影響

在治療前完善GDRAs只能提示患者體內病毒可能有PDR，判斷PDR還需根據(jù)患者臨床表現(xiàn)、病毒學指標及免疫學指標。一旦出現(xiàn)PDR，患者治療結局：(1)病毒學抑制，規(guī)律cART 24周以上HIV RNA≤20或50 copy/mL；(2)病毒學失敗，通常指持續(xù)cART 24周后血漿病毒載量持續(xù)大于或等于200 copy/mL或出現(xiàn)病毒學反彈，即在達到病毒完全抑制后又出現(xiàn)病毒載量大于或等于200 copy/mL[12]。而PDR對病毒學失敗是否存在影響仍存在爭議。

2007—2009年Pharmacess非洲耐藥監(jiān)測研究隊列選取了2 733例HIV/AIDS進行相關研究，結果顯示，與不存在PDR患者比較，存在PDR并接受部分活性cART患者第12個月病毒抑制率顯著下降，病毒學失敗風險顯著增高，ADR風險顯著增高，但存在PDR并接受完全活性cART患者無上述差異，并且存在PDR患者在隨訪期間CD4+T淋巴細胞計數(shù)上升更少[38]。同樣來自非洲的一項對82例兒童的隊列研究結果顯示，在為期24個月的抗病毒治療期間58.3%存在PDR的兒童出現(xiàn)了治療失敗，而在無PDR的兒童中僅24.6%存在治療失敗，表明PDR使治療失敗的概率增加了7.5倍[39]。而一項來自非洲6個國家的隊列研究結果顯示，對成人HIV/AIDS在使用一線cART方案的12個月內PDR同樣與治療失敗有關[40]。相較于成人，母嬰傳播的兒童具有更高的PDR率及基線病毒載量，并且兒童二線抗病毒藥物選擇較成人更少，需要更加注意對兒童進行治療前耐藥檢測。這與某些研究結果相悖，國外的一項隊列研究結果顯示，119例HIV/AIDS患者的PDR率為17.5%，使用一線cART方案隨訪12個月后未發(fā)現(xiàn)PDR與治療失敗及更高的病死率有關[41]。

上述研究結果的不同可能與研究地區(qū)差異(如當?shù)亟?jīng)濟水平、耐藥情況及cART方案選擇等)、個體化差異(如基線病毒載量、基線CD4細胞計數(shù)及服藥依從性等)有關；另外，cART過程中出現(xiàn)ADR也是造成治療失敗的重要原因。由于隨訪難度大、治療前難以完善耐藥檢測，目前，我國已發(fā)表的關于PDR的報告主要展示各地區(qū)HIV-1感染者PDR情況，關于PDR與治療結局的研究甚少見，二者關系尚需進一步探究。

5 PDR管理策略

PDR在臨床工作中常被忽視，其管理需要患者、管理者積極參與及合理的cART方案的制定。在抗病毒藥物管理方面用藥應考慮cART方案的效能及抗病毒藥物的基因屏障。此外也需注意抗病毒藥物的藥代動力學特點，如藥物生物利用度、半衰期及針對單藥發(fā)生DRM時對方案其他抗病毒藥物的影響。另外，一旦發(fā)生耐藥需更換2種以上有活性的抗病毒藥物，最好是3種[12]。由于個體的服藥依從性及個體基因組的差異可影響藥物血藥濃度導致耐藥，如依非韋倫血藥濃度與CYP2B6、CYP2A6、UGT2B7、ABCB1/MDR1等編碼其主要代謝酶或轉運受體的基因密切相關[42]，因此，應該對患者進行個體化用藥，監(jiān)測血藥濃度，必要時調整抗病毒藥物用量。若患者同時服用其他藥物，還應該考慮不同藥物的相互作用，也需注意患者合并其他感染(乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒)的情況。管理者應盡量要求患者完善治療前耐藥檢測，了解當?shù)馗鞣N抗病毒藥物PDR現(xiàn)況，以優(yōu)化cART方案。

綜上所述，隨著抗病毒治療的普及，HIV-1在藥物選擇壓力作用下不斷變異，PDR不斷增多。Sanger測序目前仍是GDRAs的“金標準”，而NGS作為一種靈敏度更高的檢測手段在用于臨床之前仍需優(yōu)化改進。國內外目前PDR現(xiàn)況及趨勢有所不同，由于推行抗病毒治療時間更長，當前國外PDR率更高，但隨著強效抗病毒藥物的日益更新，其趨勢逐漸下降，我國目前尚處于WHO低水平耐藥預警行列，但各地PDR率存在一定差異，且多是針對NNRTIs耐藥，而目前我國指南仍推薦NNRTIs為一線抗病毒藥物，因此，對HIV/AIDS應提倡完善治療前耐藥檢測。管理者應該根據(jù)耐藥檢測結果選擇合理的cART方案，使患者獲得更好的抗病毒療效及遠期預后，阻斷耐藥毒株在人群中的傳播。