基于鐵死亡基因結(jié)腸癌分子預(yù)后模型的建立與分析

黃 奔，孫姍姍，王 潔，趙 鴻△

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1.檢驗(yàn)學(xué)部；2.放射科，江蘇 南京 210009)

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)第三大常見惡性腫瘤，據(jù)預(yù)計(jì)至2030年全球?qū)⒂谐^220萬新發(fā)病例和110萬死亡病例[1]。有學(xué)者指出，轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者5年生存率僅為14%[2]。腫瘤患者的治療決策和預(yù)后預(yù)測主要依賴于TNM分期系統(tǒng)[3]。然而TNM分期對患者預(yù)后的評估存在局限性，如即使患者處于同一分期，其預(yù)后結(jié)局可能明顯不同[4]。因此，分子預(yù)后便受到了研究者的關(guān)注。

鐵死亡是區(qū)別于細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡的一種新型細(xì)胞死亡形式，是一種鐵依賴性和活性氧(ROS)依賴性細(xì)胞死亡[5]。有研究表明，在多種生理?xiàng)l件和病理應(yīng)激下均可引發(fā)鐵死亡，在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[5]。DU等[6]指出，HSPA4、ISG20L2、NRAS、IL17D、NDRG1、ACSL4、G6PD 7個鐵死亡基因在預(yù)測肝細(xì)胞癌預(yù)后方面可能比傳統(tǒng)臨床病理因素更穩(wěn)定、可靠。胡文龍等[7]利用癌癥基因圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了基于5個鐵死亡相關(guān)基因的肺鱗癌預(yù)后模型，對肺鱗癌患者的個體化治療提供了參考。因此，鐵死亡相關(guān)基因的分子預(yù)后模型被許多研究者認(rèn)為可作為癌癥患者預(yù)后決策[8-9]。本研究通過利用TCGA結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集，分析鐵死亡相關(guān)基因在結(jié)腸癌中的分子作用機(jī)制，構(gòu)建了基于鐵死亡基因結(jié)腸癌分子預(yù)后模型，旨在為結(jié)腸癌提供新型分子預(yù)后標(biāo)志物，為結(jié)腸癌的診療及預(yù)后評估提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料來源 在TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下載結(jié)腸癌轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)和患者臨床信息。共有結(jié)腸癌組織473份，正常組織41份。從文獻(xiàn)中檢索鐵死亡相關(guān)基因，并在鐵死亡數(shù)據(jù)庫FerrDb(http://www.zhounan.org/ferrdb/)下載鐵死亡相關(guān)基因的數(shù)據(jù)集文件，包括驅(qū)動基因、抑制基因和基因標(biāo)志物，將鐵死亡基因與患者基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行合并，獲取患者鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.2方法

1.2.1功能富集分析 以|log2FC|>1，F(xiàn)DR<0.05為條件，使用R 4.1.0軟件中的“l(fā)imma”程序包對鐵死亡相關(guān)基因進(jìn)行差異表達(dá)分析，使用“clusterProfiler”程序包對差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析，了解鐵死亡相關(guān)基因的生物學(xué)功能。

1.2.2COX回歸分析 根據(jù)鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)，結(jié)合患者臨床信息中的生存數(shù)據(jù)，使用單因素和多因素COX回歸分析，篩選與患者預(yù)后有關(guān)的鐵死亡基因。

1.2.3模型的建立 根據(jù)多因素COX回歸分析篩選的基因構(gòu)建基于鐵死亡基因結(jié)腸癌分子預(yù)后模型。根據(jù)文獻(xiàn)報道的公式建立風(fēng)險預(yù)后方程，即風(fēng)險評分=β1×mRNA1EXP + β2×mRNA2EXP+……+βn×mRNAnEXP。β為相應(yīng)mRNA的多因素回歸系數(shù)，mRNAnEXP為相應(yīng)mRNA的表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用R 4.0.1軟件和SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Wilcoxon非參數(shù)秩和檢驗(yàn)分析腫瘤組織和正常組織鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)的差異；COX回歸分析鐵死亡相關(guān)基因與患者生存率的相關(guān)性；Kaplan-Meier法分析高、低風(fēng)險組生存率的差異；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用R 4.1.0軟件的“survminer”程序包繪制高、低風(fēng)險組患者總體生存率的生存曲線圖；采用受試者工作特征曲線曲線評價基于鐵死亡基因結(jié)腸癌分子預(yù)后模型的靈敏度和特異度。

2 結(jié) 果

2.1鐵死亡相關(guān)基因分析 在結(jié)腸癌中共篩選到72個差異表達(dá)的鐵死亡相關(guān)基因。見表1。其中上調(diào)表達(dá)47個，下調(diào)表達(dá)25個。差異基因表達(dá)的火山圖和表達(dá)熱圖見圖1。差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、氧化應(yīng)激的反應(yīng)及ROS代謝過程等生物學(xué)過程中；富集在細(xì)胞頂端、基底外側(cè)質(zhì)膜、脂滴等細(xì)胞學(xué)成分；富集在有機(jī)陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、抗氧化活性、氧化還原酶活性等分子功能。見圖2A。差異表達(dá)基因主要參與鐵死亡、癌相關(guān)的中心碳代謝、P53信號途徑以及與腫瘤相關(guān)的信號通路。見圖2B。

表1 差異表達(dá)的鐵死亡相關(guān)基因

A：鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)火山圖，綠色代表下調(diào)基因，紅色代表上調(diào)基因；B：鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)熱圖。圖1 差異鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)分析

A：鐵死亡相關(guān)基因GO富集分析圖；B：鐵死亡相關(guān)基因KEGG信號通路富集分析圖。圖2 GO和KEGG功能富集分析

2.2COX回歸分析 6個鐵死亡相關(guān)基因與結(jié)腸癌患者預(yù)后相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。DRD4、TFAP2C、ENPP2、CAV1 4個鐵死亡相關(guān)基因可參與模型的構(gòu)建。見表3。

表2 COX回歸分析

表3 多因素COX回歸分析

2.3模型分析 根據(jù)風(fēng)險評分=0.377×DRD4EXP+0.115×TFAP2C EXP+0.058×ENPP2EXP+0.014×CAV1EXP計(jì)算TCGA數(shù)據(jù)集中每例結(jié)腸癌患者的風(fēng)險評分并分為高風(fēng)險分組和低風(fēng)險分組。高風(fēng)險組患者總體生存率明顯低于低風(fēng)險組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

A：高低風(fēng)險組患者生存曲線圖；B：風(fēng)險評分的分布圖；C：4個鐵死亡相關(guān)基因在高、低風(fēng)險組的表達(dá)熱圖；D：TCGA結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集中患者總體生存率和風(fēng)險評分的分布圖。圖3 模型分析

2.4影響患者預(yù)后的臨床因素 患者年齡、Stage分期、T分期、N分期、M分期、風(fēng)險預(yù)測因子均與患者預(yù)后相關(guān)(P<0.05)；患者年齡和風(fēng)險預(yù)測因子為患者預(yù)后的不良因素(HR=1.041、1.144,95%CI:1.019～1.063、1.072～1.221，P=0.001)。見圖4。風(fēng)險預(yù)測因子和其他臨床特征預(yù)測患者生存率的列線圖見圖5。

A：單因素COX回歸分析的森林圖；B：多因素COX回歸分析的森林圖。圖4 COX回歸分析

圖5 列線圖

2.5模型評價 基于鐵死亡基因結(jié)腸癌分子預(yù)后模型預(yù)測患者1、3、5年生存率的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.714、0.750、0.759。見圖6A。預(yù)測患者3、5年生存率的AUC均大于相應(yīng)TNM分期系統(tǒng)的AUC。見圖6B、C。表明基于鐵死亡基因結(jié)腸癌分子預(yù)后模型預(yù)測性能具有良好的靈敏度和特異度。

A：預(yù)測患者生存率的ROC曲線圖；B：預(yù)測患者1年生存率的ROC曲線圖；C：預(yù)測患者3年生存率的ROC曲線圖；D：預(yù)測患者5年生存率的ROC曲線圖。圖6 ROC曲線

2.6功能分析 高、低風(fēng)險組患者NRP1、TIGIT、PD-L1、CD44、TNFSF4免疫檢查點(diǎn)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖7A、B。高、低風(fēng)險組患者YTHDC2、YTHDF2、YTHDC1、RBM15、FTO、WTAP、METTL14、HNRNPC等m6A相關(guān)基因表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖7C。高、低風(fēng)險組患者免疫細(xì)胞共抑制、免疫細(xì)胞共刺激、免疫檢查點(diǎn)、免疫T淋巴細(xì)胞、促炎癥作用比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖7D。表明高、低風(fēng)險組患者免疫相關(guān)功能存在一定差異。

A、B：高、低風(fēng)險組免疫檢查點(diǎn)比較；C：高、低風(fēng)險組m6A相關(guān)基因比較；D：高、低風(fēng)險組免疫相關(guān)功能比較。與低風(fēng)險組比較，aP<0.05。圖7 高、低風(fēng)險組患者免疫相關(guān)功能比較

3 討 論

鐵死亡是一種非凋亡的、鐵依賴的調(diào)控細(xì)胞死亡形式，其標(biāo)志為鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物的積累[10]。多數(shù)腫瘤處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)，為防止發(fā)生氧化損傷，腫瘤細(xì)胞需增強(qiáng)清除ROS的能力，因此，多數(shù)腫瘤細(xì)胞均易受到鐵死亡的影響[11]。鐵死亡通過去除環(huán)境中缺乏關(guān)鍵營養(yǎng)素或因感染或環(huán)境壓力而受損的細(xì)胞，在腫瘤發(fā)生中具有關(guān)鍵作用[5]。近年來，許多研究揭示了鐵死亡相關(guān)基因在腫瘤中的作用機(jī)制，也使鐵死亡相關(guān)基因的分子預(yù)后價值受到了關(guān)注。

本研究通過生物信息學(xué)的分析，首次構(gòu)建了基于鐵死亡相關(guān)基因的結(jié)腸癌分子預(yù)后模型，差異表達(dá)分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中有72個失調(diào)表達(dá)的鐵死亡相關(guān)基因，主要參與了鐵死亡、癌相關(guān)的中心碳代謝、P53信號途徑以及其他與腫瘤相關(guān)的信號通路，提示這些失調(diào)表達(dá)的鐵死亡相關(guān)基因可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生與進(jìn)展。本研究構(gòu)建的基于鐵死亡基因結(jié)腸癌分子預(yù)后模型基于4個鐵死亡相關(guān)基因，即DRD4、TFAP2C、ENPP2和CAV1。這些基因在鐵死亡相關(guān)信號途徑中發(fā)揮了重要的作用。JIANG等[12]發(fā)現(xiàn)，TFAP2C基因在轉(zhuǎn)錄水平增加列腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1 (PCAT1)表達(dá)，PCAT1可減少鐵積累和氧化損傷反應(yīng)激活SLC7A11表達(dá)，從而抑制鐵死亡。機(jī)制分析結(jié)果顯示，TFAP2C可誘導(dǎo)PCAT1 通過原癌基因MYC編碼的轉(zhuǎn)錄因子/微小RNA-25-3p/SLC7A11信號阻斷鐵死亡促進(jìn)癌細(xì)胞耐藥。ENPP2是一種參與脂質(zhì)代謝的脂質(zhì)激酶，ENPP2基因表達(dá)可調(diào)節(jié)其他鐵死亡相關(guān)基因——GPX4、ACSL4、NRF2的表達(dá)，從而增強(qiáng)了細(xì)胞中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶存活信號保護(hù)心肌細(xì)胞免受Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡[13]。LU等[14]指出，CAV1基因表達(dá)水平與ROS呈負(fù)相關(guān)，因此,CAV1是鐵死亡途徑的重要抑制因子之一。CAV1 在頭頸癌組織中過表達(dá)抑制了鐵死亡過程，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲性表型[14]。表明這些基因在與鐵死亡相關(guān)的癌癥途徑中均發(fā)揮了重要作用，可作為潛在的分子標(biāo)志物。

本研究將結(jié)腸癌患者分為高、低風(fēng)險組，兩組患者差異基因均主要富集于免疫相關(guān)通路中，在免疫檢查點(diǎn)和m6A相關(guān)基因方面存在明顯差異。有研究表明，在鐵死亡過程中SLC7A11 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮了重要作用[15]。免疫檢查點(diǎn)，如CD44基因則可通過增強(qiáng)SLC7A11的穩(wěn)定性表達(dá)，從而降低癌細(xì)胞對氧化應(yīng)激和鐵死亡的敏感性[15]。在TYRO3表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中，TYRO3基因可協(xié)同調(diào)節(jié)鐵死亡基因——SLC3A2的表達(dá)，抑制抗 PD-1/PD-L1引發(fā)的鐵死亡，并降低 M1/M2巨噬細(xì)胞比率，促進(jìn)腫瘤微環(huán)境的發(fā)展[16]。本研究高風(fēng)險組患者顯示著免疫檢查點(diǎn)的高評分。有學(xué)者認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞能利用被激活的免疫檢查點(diǎn)通路實(shí)現(xiàn)免疫逃避，促進(jìn)腫瘤的惡化[8]。在分子途徑方面，免疫檢查點(diǎn)分子，如CTLA4、PD-1均可向T淋巴細(xì)胞發(fā)送信號，調(diào)節(jié)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。T淋巴細(xì)胞可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡消除腫瘤細(xì)胞[17]。T淋巴細(xì)胞衍生的γ-干擾素可通過調(diào)節(jié)鐵死亡基因——ACSL4的表達(dá)改變腫瘤細(xì)胞脂質(zhì)代謝，并與花生四烯酸結(jié)合誘導(dǎo)免疫原性腫瘤鐵死亡，作為CD8+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)腫瘤殺傷的一種作用方式[18]。本研究結(jié)果也表明了鐵死亡與m6A修飾存在重要聯(lián)系。SHEN等[19]研究表明，暴露于鐵死亡誘導(dǎo)劑后由于甲基化酶METTL4水平明顯上調(diào)，去甲基化酶FTO明顯下調(diào)，肝細(xì)胞中m6A修飾的水平明顯增加。機(jī)制分析結(jié)果顯示，m6A修飾上調(diào)BECN1 mRNA增強(qiáng)了自噬性鐵蛋白降解，并最終導(dǎo)致鐵死亡。XU等[20]指出，METTL3介導(dǎo)的m6A修飾可穩(wěn)定SLC7A11轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)其翻譯，從而抑制細(xì)胞鐵死亡，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。此外，微小RNA -4443可通過調(diào)節(jié)FSP1 m6A修飾介導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡，誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞產(chǎn)生順鉑耐藥的表型[21]。因此，鐵死亡與免疫檢查點(diǎn)和m6A修飾均存在重要的聯(lián)系。有學(xué)者認(rèn)為，調(diào)節(jié)鐵死亡可能是一種潛在的腫瘤治療策略[22]。本研究結(jié)果還分析了鐵死亡相關(guān)基因與其他多種免疫基因表達(dá)的關(guān)系，雖然尚缺乏文獻(xiàn)報道，但需大樣本實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

本研究高風(fēng)險組患者總體預(yù)后較差，或許是由于高、低風(fēng)險組鐵死亡基因表達(dá)的差異，引起上述多種免疫檢查點(diǎn)和免疫相關(guān)基因的差異表達(dá)所致。此外，在ssGESA分析中還發(fā)現(xiàn)，高、低風(fēng)險組患者免疫細(xì)胞刺激/抑制狀態(tài)、免疫T淋巴細(xì)胞效應(yīng)方面均存在差異，可能由于鐵死亡基因的表達(dá)不同，通過調(diào)節(jié)體內(nèi)激活劑或抑制劑進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的鐵死亡，也導(dǎo)致了患者預(yù)后的差異[23]。

綜上所述，成功構(gòu)建了基于鐵死亡基因結(jié)腸癌分子預(yù)后模型。與TNM分期比較，具有較好的預(yù)測患者3、5生存率的能力，有望為結(jié)腸癌患者個性化治療和預(yù)后評估提供新參考。DRD4、TFAP2C、ENPP2、CAV1 4個鐵死亡相關(guān)基因有望成為結(jié)腸癌的新型預(yù)后分子標(biāo)志物。