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      基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接研究夏枯草治療乳腺囊性增生病的藥理作用機(jī)制*

      2023-01-04 06:31:20何天翼杜佳尚何志賢
      現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生 2022年24期
      關(guān)鍵詞:夏枯草囊性靶點(diǎn)

      鐘 想,尹 旭,何天翼,杜佳尚,何志賢△

      (1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院甲乳外科/南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 南通 226000;2.南京醫(yī)科大學(xué),江蘇 南京 210000;3.南通大學(xué)附屬醫(yī)院甲乳外科,江蘇 南通 226000)

      乳腺囊性增生病又稱為乳腺增生病,是一種內(nèi)分泌紊亂所致的乳腺疾病,屬于乳腺外科最常見疾病[1]。乳腺囊性增生病好發(fā)年齡為25~45歲,發(fā)病率為50%~70%[2]。目前,乳腺囊性增生病的主要病因及具體發(fā)病機(jī)制尚不明確,一般認(rèn)為,主要是由于在周期性月經(jīng)、妊娠、青春期及更年期間女性體內(nèi)發(fā)生內(nèi)分泌功能紊亂導(dǎo)致乳腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞增生及復(fù)舊不全所致[3]。乳腺囊性增生病患者主要臨床表現(xiàn)為乳房腫塊及周期性疼痛[4]。乳腺囊性增生病具有反復(fù)發(fā)作、遷延不愈等特征,很大程度上降低了患者生活質(zhì)量。另外,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,該病與乳腺癌的發(fā)生具有一定相關(guān)性,乳腺囊性增生病患者發(fā)生乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)比普通人增加了4倍左右[5]。目前,針對(duì)乳腺囊性增生病西醫(yī)主要采取密切隨訪、藥物治療及手術(shù)干預(yù)等治療措施[6]。而中醫(yī)在治療乳腺囊性增生病方面也發(fā)揮著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),可在提高臨床療效的同時(shí)減少西醫(yī)用藥劑量,改善機(jī)體免疫功能。

      夏枯草別名“乃東”,最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有辛、苦、寒、無毒等特征[7]。關(guān)于夏枯草的功效,《本草分經(jīng)》[8]記載:“解內(nèi)熱,散結(jié)氣,消癭,治目珠夜痛,久服傷胃?!毕目莶葑鳛橐晃稓v史悠久的中藥材,入肝經(jīng),是散結(jié)止痛的好藥。中藥理論認(rèn)為,乳腺囊性增生病屬“乳癖”范疇,因肝郁氣滯所致,故夏枯草對(duì)治療此病具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。李杰茹等[9]臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示,夏枯草對(duì)乳腺囊性增生病具有明顯的療效。雖然夏枯草藥已廣泛用于臨床治療,但其治療乳腺囊性增生病的藥理分子作用機(jī)制尚未明確。目前,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已成為研究中藥藥理作用機(jī)制的熱門方法,主要涉及中藥活性成分篩選、通路作用機(jī)制闡述及中藥配伍機(jī)制的探索等方面[10]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過生物信息技術(shù)構(gòu)建疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物互作網(wǎng)絡(luò),闡述藥物對(duì)疾病干預(yù)的藥理作用機(jī)制。本研究聯(lián)合運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)分析了夏枯草活性成分,預(yù)測(cè)了夏枯草治療乳腺囊性增生病的作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路,進(jìn)一步闡述了夏枯草治療乳腺囊性增生病的相關(guān)分子機(jī)制,旨在為后期的臨床試驗(yàn)提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

      1 資料與方法

      1.1研究對(duì)象 將通過美國(guó)TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索夏枯草中有效成分信息及其對(duì)應(yīng)的作用研究靶點(diǎn),運(yùn)用GeneCards、OMIM、PharmGkb、DrugBank數(shù)據(jù)庫獲取相關(guān)乳腺囊性增生病的臨床疾病靶點(diǎn)作為研究對(duì)象。

      1.2方法

      1.2.1收集中藥成分及靶點(diǎn) 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmspw.com/tcmspsearch.php)[11]檢索夏枯草活性成分。根據(jù)毒藥物動(dòng)力學(xué)原理設(shè)定2個(gè)篩選條件,即口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18,進(jìn)一步篩選夏枯草活性成分,利用所得到的潛在活性成分在該數(shù)據(jù)庫中檢索其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。通過Perl軟件將所得的蛋白名轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的基因名,整理得到夏枯草有效成分的所有靶點(diǎn)。

      1.2.2獲取乳腺囊性增生病相關(guān)疾病靶點(diǎn) 采用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)[12]、DurgBank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca)[13]、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org)[14]、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(https://www.pharmgkb.org)[15],并以breast cystic hyperplasia為關(guān)鍵詞檢索其在數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)疾病靶點(diǎn),將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel16.0軟件,取去交集刪除重復(fù)靶點(diǎn),得到乳腺囊性增生病的疾病靶點(diǎn)。以human為主要篩選條件,通過Uniprot數(shù)據(jù)庫將所得乳腺囊性增生病的疾病靶點(diǎn)的蛋白名轉(zhuǎn)化為基因名。

      1.2.3構(gòu)建疾病-中藥活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型 為探究夏枯草中活性成分作用于乳腺囊性增生病的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn),通過Perl語言分析得到乳腺囊性增生病疾病靶點(diǎn)與夏枯草活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn),并繪制韋恩圖;再將此中藥的活性成分與相互作用的交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件構(gòu)建疾病-中藥活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行進(jìn)一步的拓?fù)浞治觯匝芯肯目莶莼钚猿煞种委熑橄倌倚栽錾〉乃幚碜饔脵C(jī)制。

      1.2.4構(gòu)建核心基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI) 將乳腺囊性增生病的相關(guān)疾病靶點(diǎn)與夏枯草活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)交集數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫[16],按multiple proteins及Homo sapiens檢索,并隱藏游離節(jié)點(diǎn),得到PPI。下載STRING數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作的tsv格式文件,將所篩選的蛋白節(jié)點(diǎn)建立對(duì)應(yīng)關(guān)系并整理在Excel16.0軟件中,利用Cytoscape3.9.0 軟件進(jìn)行可視化,用CytoNCA插件篩選核心靶點(diǎn),基于核心基因構(gòu)建相應(yīng)的PPI。

      1.2.5基因本體(GO)富集分析及京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 利用R語言對(duì)疾病和藥物的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析及KEGG通路富集分析,分別選取前10、20個(gè)條目,繪制氣泡圖和柱狀圖,得到夏枯草治療乳腺囊性增生病所參與的生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞成分及影響的主要信號(hào)通路。

      1.2.6中藥關(guān)鍵活性成分與疾病核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證 運(yùn)用PubChem數(shù)據(jù)庫下載中藥活性成分的3D結(jié)構(gòu),并通過Chem3D軟件實(shí)現(xiàn)中藥活性成分能量最小化。在PDB數(shù)據(jù)庫檢索獲取靶點(diǎn)的蛋白3D結(jié)構(gòu)。利用SYBYL-X 2.0軟件進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)處理和分子對(duì)接。

      2 結(jié) 果

      2.1中藥有效活性成分及靶點(diǎn) 最終得到11個(gè)活性成分。見表1。將所得蛋白靶點(diǎn)通過perl語言轉(zhuǎn)化為186個(gè)基因靶點(diǎn)。

      表1 夏枯草中藥活性成分情況

      2.2乳腺囊性增生病相關(guān)疾病靶點(diǎn)篩選 共得到2 699個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)。見圖1。

      圖1 各數(shù)據(jù)庫中乳腺囊性增生病的相關(guān)靶點(diǎn)

      2.3疾病-中藥活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 共得到交集基因靶點(diǎn)141個(gè),是夏枯草治療乳腺囊性增生病的作用靶點(diǎn)。見圖2?;赑erl語言,分析141個(gè)交集基因與夏枯草11個(gè)活性成分,導(dǎo)入Cytoscape3.9.0軟件并構(gòu)建“疾病-中藥活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。見圖3。共有152個(gè)節(jié)點(diǎn)和252條邊。與該點(diǎn)連接的邊的數(shù)量、度值越大,顏色越深,三角形的形狀越大,表示該節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)作用越廣泛,在該網(wǎng)絡(luò)中夏枯草有11種活性成分,分別為仙人掌黃素(Vulgaxanthin-I,MOL006767)、β-谷甾醇(beta-sitosterol,MOL000358)、7-豆甾烯酸(stigmast-7-enol,MOL006774)、菠菜甾醇(Spinasterol,MOL004355)、豆甾醇葡萄糖苷(poriferasterol monoglucoside,MOL006772)及木犀草素(luteolin,MOL000006)等。預(yù)測(cè)夏枯草是通過這11種活性成分對(duì)乳腺囊性增生病起療效的。

      圖2 疾病與中藥共同靶點(diǎn)韋恩圖

      圖3 疾病-中藥活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

      2.4夏枯草治療乳腺囊性增生病PPI及核心基因 將141個(gè)交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫獲得PPI信息,應(yīng)用Cytoscape3.9.0軟件將初始PPI可視化。見圖4。初始PPI共141個(gè)節(jié)點(diǎn),2 420個(gè)條邊。節(jié)點(diǎn)代表夏枯草有效成分治療乳腺囊性增生病的基因靶點(diǎn),靶點(diǎn)間的相互度值越大則顏色越深,表明該節(jié)點(diǎn)越重要。進(jìn)一步利用CytoNCA插件篩選核心靶點(diǎn),取24種算法的交集基因。見圖5。獲得最終的核心靶點(diǎn)NFKBIA、VEGFA、CCND1、MYC等,說明夏枯草是可能通過這些乳腺囊腫增生病對(duì)應(yīng)的疾病靶蛋白發(fā)揮治療作用的。

      圖4 交集蛋白PPI

      圖5 核心靶蛋白獲取

      2.5GO富集分析 通過R語言將疾病和中藥交集靶點(diǎn)按P值<0.05、Q值<0.05進(jìn)行GO富集分析得到生物過程、分子功能及細(xì)胞組成的前10條目繪制氣泡圖。見圖6。其中生物學(xué)過程中主要涉及異源刺激過程、脂多糖代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、化學(xué)應(yīng)激反應(yīng)等;在細(xì)胞成分中主要涉及膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞器外膜等;在分子功能中主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、類泛素蛋白連接酶及核受體活性等。

      圖6 中藥與疾病交集靶點(diǎn)GO富集分析(前10條目)

      2.6KGEE富集分析 通過R語言將疾病和中藥的交集靶點(diǎn)按P值<0.05、Q值<0.05進(jìn)行KEGG富集分析得到前20通路進(jìn)而繪制條形圖。見圖7。與乳腺囊性增生病密切相關(guān)的通路有晚期糖化終末產(chǎn)物-晚期糖化終末產(chǎn)物受體(AGE-RAGE)信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17(IL-17)信號(hào)通路等。選取KEGG富集中與乳腺囊性增生病密切相關(guān)的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)通路映射作用靶點(diǎn)。見圖8。表明夏枯草可能是通過上述通路對(duì)乳腺囊性增生病起治療作用的。

      圖7 中藥與疾病交集靶點(diǎn)KEGG信號(hào)通路富集分析(前20)

      圖8 cAMP信號(hào)通路(紅框代表共同基因)

      2.7分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)中藥活性成分和疾病靶點(diǎn)結(jié)合能力 利用SYBYL-X 2.0軟件將疾病-中藥活性成分-交集靶點(diǎn)所得到的的夏枯草治療乳腺囊性增生病的11個(gè)活性成分與NFKBIA、VEGFA、CCND1及MYC等24個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,其中對(duì)接前4的活性成分與主要核心蛋白對(duì)接的總分結(jié)果見表2。這4組蛋白與中藥活性成分對(duì)接的總分均大于7分,表明夏枯草與其有較強(qiáng)的結(jié)合能力。其中仙人掌黃素與靶蛋白結(jié)合效果最佳,絲/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)是能與夏枯草中活性成分結(jié)合的最優(yōu)靶蛋白。AKT1受體蛋白與仙人掌黃素(總分為8.35分,與氨基酸殘基A/ARG25、A/ARG23、A/ARG86、A/ASN53、A/LYS14有5個(gè)氫鍵連接)見圖9A。絲裂原激活蛋白激酶8(MAPK8)受體蛋白與仙人掌黃素(總分為7.59分,與氨基酸殘基A/SER34、A/LYS55、A/ASP169、A/ASN114有4個(gè)氫鍵連接)見圖9B。環(huán)加氧酶2(PTGS2)受體蛋白與豆甾醇葡萄糖苷(總分為8.32分,與氨基酸殘基A/GLN457、A/HIS214、A/GLN454有3個(gè)氫鍵連接)見圖9C。酪氨酸激酶受體2(ERBB2)受體蛋白與β-谷甾醇(總分為7.88分,B/ASN697、B/ARG696、B/GLU698、B/ARG716)見圖9D。上述配體化合物均能良好地包埋在受體靶蛋白的活性口袋中。

      表2 夏枯草治療乳腺囊性增生的11個(gè)活性成分與主要核心蛋白分子對(duì)接得分(分)

      A.仙人掌黃素與ATK1;B.仙人掌黃素與MAPK6;C.豆甾醇葡萄糖苷與PTGS2;D.β-谷甾醇與ERBB2。圖9 夏枯草中關(guān)鍵活性成分與PPI核心靶蛋白分子對(duì)接情況

      3 討 論

      中醫(yī)對(duì)乳腺囊性增生病的研究有很長(zhǎng)的歷史淵源,早在戰(zhàn)國(guó)時(shí)期的《中藏經(jīng)》中就已有記載[17]。之后明朝時(shí)期的《外科活人定本》首次提出了“乳癖”這一概念,并且明確了其與乳房腫塊的關(guān)系。目前,依據(jù)中醫(yī)學(xué)臟腑經(jīng)絡(luò)理論及臨床治療經(jīng)驗(yàn)將乳腺囊性增生病的發(fā)病機(jī)制主要?dú)w結(jié)于以下方面,即肝氣郁結(jié)、肝郁脾虛、腎元?dú)鈸p及沖任失調(diào)[18]。夏枯草是一味藥理作用廣泛且歷史悠久的中藥,在明代時(shí)期的《滇南本草》就已有關(guān)于夏枯草作為常用中藥材的記載[19]。目前,有研究表明,夏枯草具有清肝瀉火、明目、散結(jié)消腫等功效,時(shí)常被用于乳腺囊性增生病的治療[20]。國(guó)內(nèi)在研究夏枯草治療乳腺囊性增生病的過程中發(fā)現(xiàn)其可以明顯提高三苯氧胺的療效,降低西藥不良反應(yīng),減輕患者心理及生理負(fù)擔(dān)[21]。然而,目前國(guó)內(nèi)外尚未見有關(guān)夏枯草治療乳腺囊性增生病的活性成分、作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路等具體作用機(jī)制的文獻(xiàn)報(bào)道。所以,本研究旨在揭示夏枯草治療乳腺囊性增生病的藥理分子作用機(jī)制。

      本研究通過聯(lián)合采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)分析其作用機(jī)制,結(jié)果顯示,夏枯草共有11個(gè)活性成分對(duì)乳腺囊性增生病具有關(guān)鍵治療作用,如仙人掌黃素、β-谷甾醇、7-豆甾烯酸、豆甾醇葡萄糖苷及木犀草素等;186個(gè)作用基因靶點(diǎn)。搜索得到乳腺囊性增生疾病靶點(diǎn)共2 699個(gè);經(jīng)分析獲得141個(gè)交集靶點(diǎn)基因。進(jìn)而構(gòu)建了疾病-有效成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),分析了有效成分與靶點(diǎn)、靶點(diǎn)與疾病的相互作用關(guān)系,為闡述夏枯草對(duì)乳腺囊性增生病治療機(jī)制提供了參考依據(jù)。

      疾病-有效成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)顯示,仙人掌黃素、β-谷甾醇、槲皮素、木犀草素及山柰酚相配對(duì)的靶點(diǎn)較多,可看作是夏枯草治療乳腺囊性增生病的主要活性成分。β-谷甾醇是一種植物甾醇,具有抗炎、抗氧化衰老及抗癌等功效[22]。有研究表明,β-谷甾醇可通過影響磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B (PI3K/Akt)信號(hào)通路抑制乳腺癌細(xì)胞增殖[23]。而本研究結(jié)果顯示,夏枯草在治療乳腺囊性增生病的過程中PI3K/Akt信號(hào)通路也處于抑制狀態(tài),表明很有可能是夏枯草中的β-谷甾醇通過影響PI3K/Akt信號(hào)通路從而達(dá)到對(duì)乳腺囊性增生病的治療效果。仙人掌黃素具有抗炎的作用,可抑制細(xì)胞色素C氧化酶5活性及表達(dá),進(jìn)而阻斷花生四烯酸代謝過程,發(fā)揮抗炎作用[24]。槲皮素是具有多種生物學(xué)功能的一類黃酮類化合物,可抗腫瘤、抗炎、抗氧化應(yīng)激等[25]。有研究表明,槲皮素在治療乳腺疾病方面也有較好的效果[26]。說明夏枯草中的活性成分可能通過抗炎、抗氧化、抗腫瘤及抑制增生發(fā)揮治療乳腺囊性增生病的療效。

      本研究通過CytoCNA插件對(duì)PPI中交集靶點(diǎn)篩選得到有AKT1、PTGS2、MAPK8及TP53等24個(gè)核心靶點(diǎn)。預(yù)測(cè)其可能是夏枯草治療乳腺囊性增生病的主要靶點(diǎn)。AKT1是PI3K下游的一個(gè)重要靶蛋白,可促進(jìn)乳管上皮細(xì)胞增殖,抑制其凋亡[26]。MAPK8可提高成纖維細(xì)胞增殖能力[27]。在乳腺囊性增生病的發(fā)病進(jìn)程中MAPK8可能參與了乳腺的不全修復(fù)。細(xì)胞色素C氧化酶2/PTGS2通過生成前列腺素發(fā)揮調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵作用,一些研究已表明,炎癥刺激可明顯提高PTGS2表達(dá)水平[28-29]。上述靶點(diǎn)的明確揭示了夏枯草治療乳腺囊性增生病的作用機(jī)制,也為今后新藥的制作提供科學(xué)的理論依據(jù)。

      本研究通過KEGG信號(hào)通路富集分析顯示,夏枯草可通過影響AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路發(fā)生對(duì)乳腺囊性增生病的療效。很多種生物學(xué)過程與AGE-RAGE信號(hào)通路有關(guān),如炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激及纖維化等[30]。夏枯草治療乳腺囊性增生病主要涉及氧化應(yīng)激這一生物過程。本研究結(jié)果顯示,夏枯草的有關(guān)活性成分可通過AKT1和MAPKs影響AGE-RAGE信號(hào)通路,進(jìn)而抑制正常乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)。目前,對(duì)AGE-RAGE信號(hào)通路的研究一般局限于糖尿病及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化等,所以,對(duì)乳腺疾病,此信號(hào)通路還有很大的探索空間。TNF是一種促炎性細(xì)胞因子,也是其他細(xì)胞因子的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,如IL-1β、IL-6、IL-8等。TNF主要參與炎癥急性期反應(yīng)的誘導(dǎo)和趨化[31]。有研究表明,夏枯草可能通過IL-1β、MAPK8、肉瘤病毒癌基因同源物、AKT1等核心靶點(diǎn)影響正常乳腺細(xì)胞中的TNF信號(hào)通路,進(jìn)而發(fā)揮其對(duì)乳腺增生的抑制作用。IL-17信號(hào)通路也是一條參與炎性反應(yīng)的明星通路[32]。核心靶點(diǎn)中的PTGS2可阻斷IL-17信號(hào)通路的傳導(dǎo),發(fā)揮抗炎作用。通過上述信號(hào)通路分析顯示,在夏枯草治療乳腺囊性增生病過程中主要作用機(jī)制是抗炎及緩解自身氧化應(yīng)激反應(yīng)。

      綜上所述,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)揭示了夏枯草治療乳腺囊性增生病的藥理作用機(jī)制。夏枯草中的仙人掌黃素、β-谷甾醇、7-豆甾烯酸、豆甾醇葡萄糖苷、木犀草素等活性成分可通過AKT1、MAPK8、PTGS2、ERBB2、IL-1β等核心靶點(diǎn)對(duì)AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路進(jìn)行干預(yù),提高正常乳腺上皮細(xì)胞抗炎和應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激能力,進(jìn)而在一定程度上達(dá)到抑制乳腺增生的效果。然而,本研究?jī)H在理論上探討了夏枯草治療乳腺囊性增生病的藥理作用機(jī)制,尚有待于后期研究進(jìn)一步證明。

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