拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα蛋白在青年女性乳腺癌中的表達(dá)及其預(yù)后的關(guān)系*

林鳳村，李藝江，林延宗，黃建麗

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院腫瘤放療科，福建 漳州 363000；2.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科，福建 廈門 361000)

世界衛(wèi)生組織下屬的國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)發(fā)布的《2020全球癌癥報(bào)告》顯示，乳腺癌一躍成為全球第一大癌，并且呈年輕化趨勢。第15屆St.Gallen國際乳腺癌大會提出根據(jù)乳腺癌患者的臨床病理特征和分子分型，對個(gè)體治療方案進(jìn)行相應(yīng)的“增和減”，從而最大限度避免治療不足或治療過度，實(shí)現(xiàn)“量體裁衣”的個(gè)體化治療，從而提高乳腺癌的治療效果[1]。目前，中國女性乳腺癌的發(fā)病率呈顯著上升且日益年輕化的趨勢，加強(qiáng)對乳腺癌分子水平研究，尋找預(yù)后分子至關(guān)重要[2]。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα(TopoⅡα)在DNA的復(fù)制、重組和轉(zhuǎn)錄等過程中發(fā)揮重要作用。既往研究證實(shí)，TopoⅡα與乳腺癌患者對蒽環(huán)類藥物的反應(yīng)性有關(guān)，其蛋白高表達(dá)的患者對蒽環(huán)類藥物更敏感，療效更好[3]。然而，在蒽環(huán)類藥物廣泛使用的背景下，TopoⅡα對青年乳腺癌患者的預(yù)后影響尚存爭議。國內(nèi)外相關(guān)臨床研究十分有限，并且缺乏長期隨訪報(bào)道。因此，本研究納入50例<35歲的青年乳腺癌患者，檢測其癌組織中TopoⅡα蛋白的表達(dá)，通過10余年的長期隨訪，分析其與患者無病生存期(DFS)、總生存期(OS)之間的關(guān)系，為預(yù)測青年乳腺癌患者的預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2004年8月至2009年1月福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院診治的青年(<35歲)乳腺癌患者共131例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)2位高年資病理科醫(yī)師分別閱片后確診為原發(fā)性乳腺癌；(2)施行過根治手術(shù)，包括乳腺癌根治術(shù)和改良根治術(shù)；(3)完整的術(shù)后病理資料，免疫組織化學(xué)檢測項(xiàng)目包括激素受體(HR)、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長因子受體2(HER-2)、增殖細(xì)胞核抗原Ki67、TopoⅡα蛋白；(4)術(shù)前未行放化療及內(nèi)分泌治療；(5)術(shù)后符合2017版NCCN指南要求進(jìn)行輔助化療6～8 周期，具體化療方案以蒽環(huán)為主或聯(lián)合紫杉醇的方案(包括AC，EC，TAC，AC-T等)，無法耐受蒽環(huán)類的心臟毒性者選用不含蒽環(huán)類的聯(lián)合化療方案(包括TC，CMF等)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)確診時(shí)即已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；(2)局部復(fù)發(fā)病例、雙側(cè)乳腺癌、病理結(jié)果為DCIS；(3)失訪病例；(4)術(shù)后未符合2017版NCCN指南的要求進(jìn)行輔助化療。

經(jīng)篩選，最終納入50例患者進(jìn)行研究，患者中位年齡32歲。其中，浸潤性導(dǎo)管癌31例，浸潤性小葉癌9例，單純癌5例，髓樣癌3例，黏液癌2例。腫瘤分期方面，I期患者8例，Ⅱ期患者26例，Ⅲ期患者 16例。收集的臨床病理資料包括腫瘤大小(T分期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N分期)、TNM分期、HR、ER、PR、HER-2、Ki67和分子分型。主要研究終點(diǎn)為DFS，定義為確診日期起至復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或由于疾病進(jìn)展導(dǎo)致患者死亡的時(shí)間間隔；次要研究終點(diǎn)為OS，定義為確診日期起至死亡或末次隨訪時(shí)間(2020年11月19日)；中位隨訪時(shí)間為159個(gè)月(131～195個(gè)月)。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2免疫組織化學(xué)檢測

1.2.1HR、ER、PR、HER-2表達(dá)及分子分型的判斷標(biāo)準(zhǔn) (1)HR、ER、PR表達(dá)：以ER或PR表達(dá) < 10%為(-)，≥ 10%為(+)[4]，ER或PR其中一個(gè)陽性，即為HR陽性；(2)HER-2表達(dá)：由于大部分患者未進(jìn)行Fish檢測，故定義HER-2 +或-為HER-2表達(dá)(-)，HER-2呈2+和3+為HER-2表達(dá)(+)[5]；(3)Ki67表達(dá)：≤ 14%定義為低表達(dá)，> 14%定義為高表達(dá)[6]；(4)分子分型：根據(jù)St Gallen共識分為luminal A、luminal B、HER-2過表達(dá)和三陰性乳腺癌。

1.2.2TopoⅡα蛋白測定 將所有標(biāo)本固定于甲醛中，以石蠟包埋，連續(xù)切片并脫蠟水化，PBS液洗滌。置于緩沖液中，持續(xù)加熱，冷卻后用抗原修復(fù)。用PBS液沖洗后滴加稀釋的一抗，并采用PBS代替一抗作為陰性對照，相同條件下已知陽性切片作陽性對照。PBS液洗滌后滴加二抗并孵育。棄去PBS液，滴加新鮮配制的 DAB 顯色液，進(jìn)行閱片。TopoⅡα單克隆抗體購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。結(jié)果判定：TopoⅡα蛋白位于細(xì)胞核上，呈黃棕色顆粒狀。隨機(jī)計(jì)數(shù)視野中500個(gè)癌細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。定義著色癌細(xì)胞 < 25%為低表達(dá)，≥ 25%為高表達(dá)[7-8]。

1.2.3隨訪 50例患者均經(jīng)密切隨訪，無失訪病例。2年內(nèi)每間隔3個(gè)月隨訪1次，之后每間隔6個(gè)月隨訪1次。隨訪方式包括調(diào)取來診記錄、影像材料和電話隨訪等。末次隨訪日期為2020年11月19日。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用χ2檢驗(yàn)(Pearson法、連續(xù)性校正法及Fisher確切概率法)分析TopoⅡα蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，相關(guān)性分析采用Spearman分析法。采用Kaplan-Meier法繪制患者生存曲線，用log-rank檢驗(yàn)分析各亞組之間生存率的差異。多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1TopoⅡα蛋白在青年女性乳腺癌組織中的表達(dá) 50例患者中，42例患者TopoⅡα蛋白表達(dá)呈陽性，其中I期8例，Ⅱ期20例，Ⅲ 期14例；浸潤性導(dǎo)管癌25例，浸潤性小葉癌9例，單純癌4例，髓樣癌3例，黏液癌1例。

2.2TopoⅡα蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 TopoⅡα蛋白表達(dá)僅與增殖細(xì)胞核抗原Ki67呈正相關(guān)(r=0.533，P=0.002)，與患者腫瘤大小(T分期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分子分型、ER、PR、HER-2均無關(guān)(P>0.05)，見表1。

表1 TopoⅡα蛋白表達(dá)與青年女性乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

續(xù)表1 TopoⅡα蛋白表達(dá)與青年女性乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移情況 隨訪至2020年11月19日，50例患者中有23例發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移部位依次為骨、肺、肝、腦。其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、HR狀態(tài)、ER、PR、分子分型、TNM分期和TopoⅡα蛋白表達(dá)均與DFS有關(guān)(P=0.014，P=0.002，P=0.001，P=0.020，P=0.001，P=0.026，P=0.003)，見表2，即TopoⅡα蛋白陽性、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER或PR陽性、病理類型為luminal A型、I/Ⅱ期患者的DFS較長。

表2 青年女性乳腺癌患者DFS的單因素分析

2.4TopoⅡα蛋白表達(dá)與DFS和OS的關(guān)系 TopoⅡα蛋白表達(dá)與患者的DFS顯著相關(guān)(χ2=9.105，P=0.003)，見圖1。TopoⅡα蛋白陽性者與陰性者相比DFS更優(yōu)，其1、3、5、10年DFS分別為95.2%：87.5%、76.2%：37.5%、66.7%：12.5%、64.3%：12.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.105；P=0.003)。見表2。

圖1 青年女性乳腺癌患者TopoⅡα蛋白表達(dá)的無病生存曲線

2.5TopoⅡα蛋白陽性者與陰性者比較 TopoⅡα蛋白陽性者與陰性者1、3、5、10年OS分別為97.6%：100%、81.0%：62.5%、73.8%：50.0%、73.8%：50.0%，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.652,P=0.199)。見圖2、表3。

圖2 青年女性乳腺癌患者TopoⅡα蛋白表達(dá)的總生存曲線

表3 青年女性乳腺癌患者OS的單因素分析

續(xù)表3 青年女性乳腺癌患者OS的單因素分析

2.6多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析 將單因素生存分析中影響DFS(P<0.05)的因素(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、激素受體、分子分型、TNM分期、TopoⅡα蛋白表達(dá))納入多因素COX回歸模型進(jìn)一步分析，結(jié)果表明：TopoⅡα蛋白陰性、HR陰性、TNM分期較晚(Ⅲ期)是影響青年乳腺癌患者DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[風(fēng)險(xiǎn)比(HR)=0.272,95%CI:0.110～0.674,P=0.005；HR=0.225,95%CI:0.090～0.567,P=0.002；HR=3.027,95%CI:1.280～7.157,P=0.012]。見表4。

表4 青年女性乳腺癌患者DFS的多因素分析

2.7青年女性乳腺癌患者OS的多因素分析 將單因素中影響OS(P<0.05)的因素(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HR、分子分型、TNM分期)納入多因素COX回歸模型進(jìn)一步分析，結(jié)果表明：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HR陰性、TNM分期較晚(Ⅲ期)是影響OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素 (HR=5.531,95%CI:1.149～26.620,P=0.033；HR=0.135,95%CI:0.042～0.431,P=0.001；HR=4.856,95%CI:1.596～14.771,P=0.005)。見表5。

表5 青年女性乳腺癌患者OS的多因素分析

3 討 論

乳腺癌已經(jīng)成為全球發(fā)病人數(shù)最多的惡性腫瘤，在中國惡性腫瘤中發(fā)病率與病死率均位居前列[9]。20世紀(jì)70年代以來，蒽環(huán)類藥物在乳腺癌化療領(lǐng)域展現(xiàn)出的優(yōu)勢已受到學(xué)者們的重視，時(shí)至今日仍作為乳腺癌經(jīng)典化療方案的重要組成部分。但隨著研究的深入，乳腺癌分子層面的差異對蒽環(huán)類化療效果的影響越來越受關(guān)注[10]。其中，不得不提的就是TopoⅡα蛋白。它是一種存在于細(xì)胞核內(nèi)，可調(diào)節(jié)DNA空間變化的關(guān)鍵酶，其通過改變核酸上磷酸骨架的構(gòu)象，使得DNA雙螺旋中的1條或2條鏈暫時(shí)斷裂，從而完成了超螺旋狀態(tài)與解旋狀態(tài)之間的相互轉(zhuǎn)換[11]。蒽環(huán)類藥物插入TopoⅡα與DNA 結(jié)合處，干擾DNA斷端的重新連接，使其無法修復(fù)，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞分裂增殖的作用。TopoⅡα蛋白表達(dá)缺失常常引起蒽環(huán)類藥物耐藥，而高表達(dá)者則對蒽環(huán)類藥物敏感[12]。

謝閔等[13]報(bào)道，TopoⅡ在三陰性乳腺癌中陽性率高達(dá)91.30%，而在非三陰性乳腺癌中陽性率為71.40%。李梅芳等[14]研究發(fā)現(xiàn)，青年組乳腺癌患者的TopoⅡα蛋白表達(dá)較中年組和老年組患者高，青年乳腺癌患者(≤ 40歲)、中年組(42～64歲)和老年組(≥ 65 歲)的TopoⅡα蛋白陽性率分別為51.6%、36.9%和33.7%。李鐵靈等[15]則報(bào)道了在青年乳腺癌(<40歲)患者中，TopoⅡα蛋白陽性表達(dá)率為45.2%?？v觀以上幾項(xiàng)研究結(jié)果，受檢測儀器、觀察人員、陽性界值、實(shí)驗(yàn)操作流程等因素的影響，TopoⅡα蛋白表達(dá)率存在一定的差異。在本研究中，TopoⅡα蛋白陽性表達(dá)率高達(dá)84.0%。相較中老年患者而言，青年患者TopoⅡα蛋白呈高表達(dá)趨勢[16]，這可能與TopoⅡα蛋白大多表達(dá)于細(xì)胞增殖分裂期，而青年患者癌細(xì)胞增殖迅速有關(guān)。Ki-67亦與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，被認(rèn)為是一種能有效評估腫瘤細(xì)胞增殖活性的重要分子[17]。國外研究發(fā)現(xiàn)，TopoⅡα蛋白表達(dá)與Ki-67顯著相關(guān)，TopoⅡα蛋白表達(dá)增高的腫瘤更具增殖潛能[18-20]。況麗平等[21]認(rèn)為，乳腺癌患者的TopoⅡα蛋白和 Ki-67在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中具有相互協(xié)同的作用，可作為判斷乳腺癌預(yù)后的重要指標(biāo)。本研究中，TopoⅡα蛋白與Ki-67表達(dá)呈顯著正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了兩者之間的聯(lián)系。乳腺癌患者，尤其是癌細(xì)胞增殖更加旺盛的青年患者中，TopoⅡα蛋白與Ki-67共同反映細(xì)胞增殖活躍程度。因此，對TopoⅡα蛋白高表達(dá)患者進(jìn)行術(shù)后輔助化療，殺滅更多處于增殖期的腫瘤細(xì)胞，使其快速進(jìn)入G0期，理論上能達(dá)到更好的腫瘤控制。此外，筆者認(rèn)為青年女性乳腺癌患者TopoⅡα蛋白表達(dá)與其他臨床病理特征(腫瘤大小、TNM分期、激素狀態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等)并不相關(guān)，這與國內(nèi)王云翔等[12]的報(bào)道一致，預(yù)示著TopoⅡα蛋白并未通過產(chǎn)生不良的腫瘤生物學(xué)行為從而影響患者預(yù)后。

本研究發(fā)現(xiàn),HR陰性、TNM分期較晚的青年乳腺癌患者更容易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，這一現(xiàn)象在所有年齡段患者中普遍存在。而TopoⅡα蛋白表達(dá)對青年患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的影響具有其特殊性：一方面，TopoⅡα蛋白高表達(dá)的青年患者細(xì)胞增殖旺盛，理論上更容易發(fā)生腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；另一方面，高表達(dá)TopoⅡα蛋白的乳腺癌組織對蒽環(huán)類化療藥具有更高的反應(yīng)性，可取得更好的化療效果。綜合來看，在蒽環(huán)類化療藥物廣泛應(yīng)用的背景下，TopoⅡα蛋白的表達(dá)對乳腺癌患者的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移到底產(chǎn)生怎樣的影響，目前仍存在爭議。中山大學(xué)腫瘤中心一項(xiàng)最新研究發(fā)現(xiàn)：在434例luminal型早期乳腺癌患者中，TopoⅡα蛋白過表達(dá)患者無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期縮短，進(jìn)一步亞組分析表明缺少輔助化療是TopoⅡα蛋白過表達(dá)者預(yù)后變差的危險(xiǎn)因素之一[4]。NIELSEN等[22]研究了在接受蒽環(huán)類化療的乳腺癌患者中，TopoⅡα基因過表達(dá)患者復(fù)發(fā)率、病死率明顯下降，而表達(dá)缺失患者預(yù)后不良；SCHINDLBECK等[23]則通過免疫組織化學(xué)檢測乳腺癌患者(118例均接受EC、EC-CMF、FAC/FEC等含蒽環(huán)類方案化療)TopoⅡα蛋白的表達(dá)，中位隨訪42個(gè)月，結(jié)果提示TopoⅡα蛋白表達(dá)陽性者的OS比陰性者長(P=0.033)；還有部分學(xué)者認(rèn)為TopoⅡα蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系和乳腺癌分子分型有關(guān)，即在HER-2過表達(dá)型乳腺癌中，TopoⅡα蛋白陽性組較陰性組5年DFS和OS均明顯延長；而在三陰性乳腺癌中，結(jié)果恰恰相反，TopoⅡα蛋白陽性組5年DFS率低于陰性組(P=0.044)[12]。在涉及青年乳腺癌患者的研究中，李鐵靈等[15]報(bào)道：62例年齡<40歲乳腺癌患者在輔助蒽環(huán)類化療下，其TopoⅡα表達(dá)陽性者OS和DFS均長于 TopoⅡα陰性者，研究者認(rèn)為蒽環(huán)類化療藥物的使用，可以改善TopoⅡa陽性青年乳腺癌患者的生存。一項(xiàng)針對256例浸潤性乳腺癌患者的研究則顯示，TopoⅡα高表達(dá)患者雖然OS和DFS有所縮短，但與低表達(dá)者相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[24]。本研究長期隨訪(中位隨訪期達(dá)159個(gè)月)結(jié)果表明，TopoⅡα陽性表達(dá)的青年乳腺癌患者，其DFS較陰性者明顯延長。同時(shí)，多因素分析也提示TopoⅡα表達(dá)是影響DFS的獨(dú)立預(yù)后因素。因而，對腫瘤細(xì)胞增生活躍的青年乳腺癌患者，術(shù)后使用蒽環(huán)類化療，可以在一定程度上降低TopoⅡα蛋白陽性患者的局部復(fù)發(fā)率，延長DFS，提高患者的生活質(zhì)量。而在OS方面，TopoⅡα蛋白表達(dá)的高低對患者的OS沒有產(chǎn)生影響，意味著TopoⅡα蛋白表達(dá)狀態(tài)不影響青年乳腺癌患者的遠(yuǎn)期預(yù)后，這也與SHEEN-CHEN等[25]的結(jié)論相符。他們對94例乳腺癌患者進(jìn)行研究后，發(fā)現(xiàn)TopoⅡα蛋白表達(dá)與患者5年生存率無關(guān)，無法成為乳腺癌OS的預(yù)測因素。筆者認(rèn)為，影響OS的主要因素還是取決于腫瘤的臨床病理狀態(tài)。淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移、HR陰性、TNM分期較晚的患者OS大大縮短，這些均是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而TopoⅡα蛋白表達(dá)與這些因素未顯示出相關(guān)性。因此，它對OS的影響也就十分有限。

在乳腺癌治療中，TopoⅡα蛋白表達(dá)能否影響乳腺癌的預(yù)后一直存在爭議，并且針對青年乳腺癌患者這一特殊群體，TopoⅡα表達(dá)的研究數(shù)據(jù)也十分有限。本研究嚴(yán)格篩選了50例年齡<35歲的青年女性乳腺癌患者，通過免疫組織化學(xué)進(jìn)行TopoⅡα蛋白的檢測，經(jīng)過長達(dá)10余年的隨訪，得出結(jié)論：TopoⅡα高表達(dá)的青年乳腺癌患者有更長的DFS，而OS不受其表達(dá)高低的影響。揭示了TopoⅡα蛋白在青年女性乳腺癌患者行蒽環(huán)類化療時(shí)的重要預(yù)測作用，能夠更好地指導(dǎo)臨床用藥，從而造福更多的青年患者。本研究同樣存在一定的不足，例如：樣本量較少；未檢測基因擴(kuò)增及mRNA表達(dá)；未對HER-2進(jìn)行FISH檢測，研究結(jié)果有待于大樣本前瞻性實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步證實(shí)。相信對TopoⅡα的深入研究，將會為青年乳腺癌患者的個(gè)體化治療開辟新的途徑并帶來新的希望。