酶解褐藻寡糖對扇貝肌原纖維蛋白體外消化特性的影響

叢海花，常珂欣，朱嘉雯，逯曉燕，周 倩，耿文豪，楊 天*

（1.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品科技學(xué)院，江蘇 蘇州 215008；2.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點實驗室，遼寧省水產(chǎn)品分析檢驗及加工科技服務(wù)技術(shù)中心，遼寧 大連 116023；3.山東省單縣自然資源和規(guī)劃局，山東 菏澤 274300）

我國貝類養(yǎng)殖產(chǎn)量占比巨大，達1 498.7 萬t[1]。以貝類為來源的蛋白質(zhì)約為人均總動物蛋白質(zhì)攝入量的15%[2]。在貝類中，蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）具有生長速度快、營養(yǎng)豐富、口感細嫩、味道鮮美等特性，倍受消費者青睞[3]。海洋蛋白因其高營養(yǎng)價值和良好的功能特性日益受到關(guān)注[4]。因此，了解扇貝的理化和功能特性以及在人體內(nèi)的消化情況變得尤為重要。

目前褐藻寡糖的制備主要分為化學(xué)法和酶解法2 種方法，但化學(xué)法的操作過程具有反應(yīng)進程控制難度大、產(chǎn)物不純等問題，降解過程更易控制且產(chǎn)率更高的酶解法逐漸成為主流提取方法[5]。研究表明，酶解褐藻寡糖（enzymatic hydrolysate of alginate oligosaccharides，EAO）是由褐藻膠酶促降解產(chǎn)生，具有許多生物活性[6]，如促進海洋微藻的生長[7]、抑菌[8]、抗腫瘤[9]、促進腸上皮細胞恢復(fù)進而提升小腸健康功能[10]、增強凍藏期間蝦肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性[11]、促進植物根莖生長[12]等。褐藻寡糖也具備一些物理化學(xué)特性，例如，Urtuvia等[13]研究發(fā)現(xiàn)，褐藻寡糖可以形成穩(wěn)定的黏稠溶液，具備優(yōu)良的保水性和乳化性，還可以被用作傷口愈合材料來加速骨骼肌的再生[14]。Zhang Bin等[15]研究發(fā)現(xiàn)，褐藻寡糖對蛋白的修飾作用可以降低蝦肌原纖維蛋白的降解，增強蛋白的穩(wěn)定性，防止其出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損傷。褐藻寡糖對魚糜的穩(wěn)定性也有改善作用，可以改變其極性結(jié)構(gòu)，使蛋白結(jié)構(gòu)更加聚集、緊密[16]。添加褐藻寡糖后和肌原纖維蛋白之間發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，對蛋白的熱穩(wěn)定性和低溫環(huán)境下的抗凍性均有保護作用[17]。

隨著人們對食品營養(yǎng)成分的不斷重視，建立消化模型研究食物在人體內(nèi)吸收情況的技術(shù)也發(fā)展的越來越成熟。體內(nèi)消化可以更詳盡研究物質(zhì)在人體或動物體內(nèi)消化的具體情況，更能展示接近真實的消化過程，但體內(nèi)消化實驗周期長，個體實驗差異大，涉及倫理道德等問題[18]。體外消化更加易于操作也更加穩(wěn)定，被用于判斷食物在人體或動物體內(nèi)的生物利用率等。體外消化模型可以分為靜態(tài)消化模型和動態(tài)消化模型2 種，研究對象和研究目的不同都會影響消化模型的選擇[19]。體外消化模型在當(dāng)今研究中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，例如，劉冬梅等[20]將西藍花凍干粉進行模擬胃腸消化，以此研究不同烹飪方式對西藍花中成分的影響。靜態(tài)體外消化模型也被應(yīng)用于判斷食物營養(yǎng)成分在人體中的生物利用性，例如：大豆蛋白在磷酸化和堿基化處理后對消化性能的影響[21]；南美白對蝦提取物對人體潛在致敏性的研究[22]等。

目前多數(shù)研究集中于褐藻寡糖的功能作用，缺乏褐藻寡糖和蛋白結(jié)合后的相關(guān)結(jié)構(gòu)變化，因而本研究探討在人體消化環(huán)境中EAO對肌原纖維蛋白修飾作用的影響。雖然褐藻寡糖的各項特性得到廣泛關(guān)注，但利用靜態(tài)體外消化模型將褐藻寡糖和扇貝肌原纖維蛋白結(jié)合產(chǎn)生復(fù)合物的報道較少。本研究采用EAO，與團隊前期研究[16-17]對應(yīng)，以此進一步研究消化過程中蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)和寡糖復(fù)合后的相關(guān)變化。將提取自鮮活蝦夷扇貝的肌原纖維蛋白作為研究對象，觀察其與EAO結(jié)合后在各消化階段的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗選用鮮活的蝦夷扇貝，購于大連黑石礁國億生鮮超市，于30 min內(nèi)進行處理，去除扇貝生殖腺及裙邊，保留新鮮的扇貝柱。實驗選用的EAO購于中科榮信生物科技有限公司。

三羥甲基氨基甲烷（Tris）、尿素（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；牛血清蛋白北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉（NaCl） 天津市富宇精細化工有限公司；所有分離用有機溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LDS-1高速組織搗碎機 上海標(biāo)本模型廠；JYL-C93T破壁機 九陽股份有限公司；HR/T20MM立式高速冷凍離心機 湘儀離心儀器有限公司；NEXUS670紅外光譜儀美國PerkinElmer公司；Epoch2酶標(biāo)儀、Synergy H1/H1M酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；F-2700熒光分光光度計日本日立公司；UV-9000雙光束紫外-可見分光光度計日本島津有限公司；PHSJ-4F精密數(shù)顯pH計 山東晨拓科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 扇貝肌原纖維蛋白的提取

根據(jù)Xiong YoulingL.等[23]的方法稍作修改，對鮮活扇貝進行處理，將扇貝柱放入破壁機絞成糜狀，加入樣品體積5 倍的10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2），將處理后的樣品放入離心機中，5 000 r/min離心15 min后取沉淀；向沉淀中加入4 倍體積的含0.6 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液（pH 7.2），4 500 r/min離心20 min后分離所得上清液即為肌原纖維蛋白。

1.3.2 模擬體外消化過程

取51.59 mL提取所得肌原纖維蛋白溶液（質(zhì)量濃度13.56 g/mL），添加EAO，使其質(zhì)量濃度為0.45 g/100 mL。將肌原纖維蛋白溶液和添加EAO的肌原纖維蛋白溶液在40 ℃數(shù)顯電熱水浴鍋中加熱30 min，再升溫至90 ℃后加熱20 min。根據(jù)Calvo-Lerma[24]、Minekus[25]等的研究，進行體外消化。

首先，模擬食物經(jīng)由口腔環(huán)境的過程。在37 ℃條件下，將5 mL樣品與5 mL模擬唾液混合，在水浴恒溫振蕩器中振搖5 s。

使用6 mol/L鹽酸將樣品的pH值調(diào)整至3。在配制的模擬胃液中加入胃蛋白酶溶液，使酶活力達到2 000 U/mL。模擬人體胃部消化過程，分別在消化時間為0、0.5、1.0、2.0 h 4 個階段取樣。

在模擬胃部消化結(jié)束后使用1 mol/L氫氧化鈉將樣品pH值調(diào)整至7。向模擬腸液中添加20 mL 0.16 mmol/L膽鹽溶液和40 mL 100 U/mL胰蛋白酶溶液?；旌虾笤谒『銣卣袷幤髦?7 ℃振搖，模擬腸道消化過程，分別在消化時間為0、1、2、3 h 4 個階段取樣。

所有樣品取樣后在4 ℃低溫層析柜中保存。將扇貝肌原纖維蛋白組記為M組，EAO-肌原纖維蛋白組記為EAO組。M組未消化，胃消化0、0.5、1.0、2.0 h，腸消化0、1、2、3 h分別記為對照組，G0、G0.5、G1.0、G2.0，I0、I1、I2、I3組；EAO組未消化，胃消化0、0.5、1.0、2.0 h，腸消化0、1、2、3 h分別記為A0，GA0、GA0.5、GA1.0、GA2.0，IA0、IA1、IA2、IA3組。

1.3.3 消化率測定

根據(jù)Cao Yungang等[26]的方法，稍作修改。取1 mL消化樣品與1 mL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液均勻混合，4 ℃、10 000×g離心10 min，棄上清保留沉淀。在離心管中加入1 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，使用雙縮脲法在540 nm波長處測定吸光度，肌原纖維蛋白體外消化率按式（1）計算。

式中：ρs0為未消化組（對照組）的肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρt為三氯乙酸沉淀后各組肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.4 內(nèi)源性熒光光譜測定

與Cao Yungang等[27]的方法相似，并作適當(dāng)修改。將肌原纖維蛋白稀釋至1 mg/mL，設(shè)置激發(fā)波長為280 nm，掃描范圍290～310 nm，使用熒光分光光度計對樣品進行檢測。

1.3.5 紫外吸收光譜測定

參考Huang Xiaoqin等[28]的方法，稍作修改，設(shè)置圖譜掃描速率為10 nm/s，掃描波長區(qū)間為200～400 nm。使用Origin軟件對樣品掃描后的數(shù)據(jù)進行處理，得到紫外二階導(dǎo)數(shù)后計算并得到紫外二階r值。

1.3.6 活性巰基含量測定

根據(jù)Yarnpakdee等[29]的方法，取0.25 mL肌原纖維蛋白樣液與2.25 mL Tris-HCl混合（含0.2 mol/L Tris-HCl、10 mmol/L乙二胺四乙酸，pH 6.8），再加入0.25 mL 10 mmol/L 5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)溶液，在4 ℃下反應(yīng)1 h，測定412 nm波長處的吸光度。活性巰基含量按式（2）計算。

式中：A為樣品的吸光度；A0為對照組樣品的吸光度；n為稀釋倍數(shù)；ρ為肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.7 表面疏水性測定

參考Benjakul等[30]的方法。將肌原纖維蛋白溶液稀釋成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL，取上述溶液2 mL與10 μL 8-苯胺-1-萘磺酸（pH 7.5）混勻，避光冷藏靜置20 min。使用酶標(biāo)儀將激發(fā)波長設(shè)置為375 nm，發(fā)射波長為485 nm，增益為50，測定表面疏水性。

1.3.8 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）測定

根據(jù)Ma Ying等[31]的方法稍作修改，使用12%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE分析。上樣量10 μL。凝膠用0.1 g/100 mL考馬斯亮藍R-250染色，將凝膠放入含50%甲醇和10%乙酸的溶液中進行脫色處理，對比標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker以確定各條帶的分子質(zhì)量。

1.3.9 氫鍵含量測定

根據(jù)李德陽等[32]的方法稍作修改，配制10 mL 0.6 mol/L NaCl溶液和0.6 mol/L NaCl與1.5 mol/L尿素混合溶液，取2 mL樣品分別與上述2 種溶液混合，在4 ℃下靜置1 h后放入轉(zhuǎn)速為8 000 r/min的離心機中離心10 min。0.25 g/100 mL考馬斯亮藍溶液和上清液按體積比5∶1混合，靜置5 min后在595 nm波長處測定吸光度，氫鍵含量參考李德陽等[32]的方法計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗中各指標(biāo)均進行3 次平行實驗，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Origin 2018軟件和Microsoft Excel 2010軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，通過IBM SPSS Statistics 23.0統(tǒng)計分析軟件進行各組間的差異顯著性分析，P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 EAO對蝦夷扇貝肌原纖維蛋白體外消化率的影響

由表1可知，EAO組比M組具有更高的消化率，可能是由于EAO的添加暴露了蛋白中的疏水基團導(dǎo)致的。同時，2 組樣品也基本呈現(xiàn)消化率上升的趨勢。在胃消化階段，EAO組比M組具有更高的消化率（P＜0.05）。隨著消化時間的延長，樣品在腸消化階段消化率的變化基本不大，在腸消化1 h時再次出現(xiàn)顯著性變化（P＜0.05），腸消化3 h時顯著升高（P＜0.05）。Wan Jin等[33]在斷奶仔豬的飼料中添加褐藻寡糖測定仔豬消化率的變化，發(fā)現(xiàn)褐藻寡糖的添加提高了仔豬的消化率，可以作為有效的飼料添加劑，推測EAO的添加可能是提高蛋白消化率的有效手段，由此可以解釋本實驗中EAO組消化率更高的現(xiàn)象。

表1 EAO對蝦夷扇貝肌原纖維蛋白體外消化率的影響Table 1 Effect of EAO on digestibility of scallop myofibrillar protein%

2.2 EAO對蝦夷扇貝肌原纖維蛋白內(nèi)源性熒光光譜的影響

不同種類的蛋白質(zhì)有不同的色氨酸發(fā)光最大值，這是分析蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的一種方法，導(dǎo)致色氨酸熒光光譜發(fā)生變化的主要原因是色氨酸微環(huán)境的改變[34]。由圖1A可知：隨著消化時間的延長，扇貝肌原纖維蛋白熒光強度逐漸降低，并發(fā)生輕微藍移；腸道消化3 h后熒光強度最低。這可能是由于肌原纖維蛋白在消化過程中發(fā)生變性或結(jié)構(gòu)展開，使得更多的色氨酸殘基暴露，最終導(dǎo)致熒光強度降低，這一現(xiàn)象和Zhang Longteng等[35]研究結(jié)果一致。由圖1B可知，添加0.45 g/100 mL EAO后，各消化階段的EAO-扇貝肌原纖維蛋白復(fù)合物的熒光強度發(fā)生明顯變化。在298 nm處，肌原纖維蛋白的熒光強度為223.9，A0組熒光強度為160.3，降低28.4%，推斷EAO的添加對蛋白的變性和折疊有一定影響，使更多的芳香族氨基酸暴露出來，降低了整體的熒光強度。此外，肌原纖維蛋白的氧化也有可能引起結(jié)構(gòu)產(chǎn)生聚集，部分氨基酸熒光被猝滅，進而成為降低熒光強度的原因[36-37]。

圖1 扇貝肌原纖維蛋白（A）與EAO-扇貝肌原纖維蛋白復(fù)合物（B）內(nèi)源熒光光譜Fig.1 Intrinsic fluorescence spectra of scallop myofibrillar protein in the absence (A) and presence (B) of EAO

2.3 EAO對蝦夷扇貝肌原纖維蛋白紫外吸收光譜的影響

由于紫外光譜本身具有獨特的能力，可用于檢測涉及芳香族氨基酸微環(huán)境的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，現(xiàn)已被證明是一種有效的分析工具[38]。由圖2可知，扇貝肌原纖維蛋白消化后的最大吸收波長約為280 nm，經(jīng)過EAO修飾后，紫外吸收光譜趨勢基本不變且最大吸收峰沒有顯著變化，消化各時間節(jié)點的紫外吸光度大小也基本無變化，但最大吸光度有輕微增大，這可能是由于EAO和肌原纖維蛋白結(jié)合后引起分子間相互作用，使更多的氨基酸基團被暴露在外[39]。

圖2 扇貝肌原纖維蛋白（A）與EAO-扇貝肌原纖維蛋白復(fù)合物（B）紫外吸收光譜Fig.2 UV absorption spectra of scallop myofibrillar protein in the absence (A) and presence (B) of EAO

為了進一步研究EAO對肌原纖維蛋白構(gòu)象的影響，處理得到紫外二階導(dǎo)數(shù)吸收光譜圖。由圖3可知，在203、205、206、208 nm波長處得到4 個吸收峰，并出現(xiàn)輕微紅移。

圖3 扇貝肌原纖維蛋白（A）與EAO-扇貝肌原纖維蛋白復(fù)合物（B）紫外二階導(dǎo)數(shù)圖譜Fig.3 Second-order derivative UV absorption spectra of scallop myofibrillar protein in the absence (A) and presence (B) of EAO

紫外二階導(dǎo)數(shù)r值的大小受酪氨酸在環(huán)境中暴露程度的影響。由表2可知，隨著消化時間的延長，M組和EAO組r值呈現(xiàn)整體降低的趨勢。與對照組相比，扇貝肌原纖維蛋白在胃消化過程中r值顯著降低（P＜0.05），腸消化過程中與對照組相比也存在顯著差異（P＜0.05）。隨著體外消化的進行，與對照組相比，EAO-扇貝肌原纖維蛋白復(fù)合物r值并無顯著變化，但腸道消化3 h時顯著降低（P＜0.05）。

表2 扇貝肌原纖維蛋白與EAO-扇貝肌原纖維蛋白復(fù)合物紫外二階導(dǎo)數(shù)r值Table 2 Second-order derivative UV absorption r value of scallop myofibrillar protein in the absence and presence of EAO during simulated digestion

橫向?qū)Ρ确治?，與M組相比，添加EAO后，r值并無顯著變化，胃消化1 h時r值最大，說明這一時刻酪氨酸的暴露量達到最大[40]。M組胃消化過程中G0、G0.5、G1.0組間均無顯著差異，但胃消化時間延長至2 h，r值顯著降低（P＜0.05）。EAO組胃消化各階段、腸消化各階段的r值均無顯著差異。由以上結(jié)果可知，EAO的加入會改變蛋白微環(huán)境，使更多的酪氨酸暴露于有機溶劑中[6]。本研究也證實了酶解后的產(chǎn)物會有更高含量的疏水性氨基酸，如酪氨酸等，這一發(fā)現(xiàn)也和Najafian等[41]的結(jié)論一致。

2.4 EAO對蝦夷扇貝肌原纖維蛋白活性巰基含量的影響

活性巰基對于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)有重要作用[42]，同時，可以有效反映蛋白質(zhì)的氧化程度，活性巰基含量越低，表示蛋白的氧化程度越高[43]。由圖4可知：M組和EAO組初始活性巰基含量分別為7.83、9.26 mol/105g；進行胃部消化后，活性巰基含量顯著降低（P＜0.05），M組下降約77.62%、EAO組下降約82.60%；樣品在進入腸道消化后活性巰基含量也略有降低，于腸消化2 h后逐漸趨于穩(wěn)定狀態(tài)。但樣品消化時間的延長并不會引起樣品活性巰基含量的顯著變化。由于胃相本身是一個變化復(fù)雜多樣的環(huán)境，胃酸的不斷分泌會保持胃內(nèi)的pH值始終處于較低狀態(tài)，而胃蛋白酶在低pH值環(huán)境下可以促使蛋白變性[44]，上述2 種情況的結(jié)合促使扇貝肌原纖維蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，更多的巰基被暴露出來，引起活性巰基含量降低，這和陳啟航等[45]研究發(fā)現(xiàn)蝦夷扇貝在超高壓下巰基含量顯著降低的結(jié)論一致。肌原纖維蛋白中添加卡拉膠寡糖后，巰基含量均顯著下降且呈現(xiàn)添加量依賴性，添加量0.6%卡拉膠寡糖具有更好的抗冷凍氧化作用[46]。推測本研究中EAO具有一定的抗氧化能力，因此可以減緩肌原纖維蛋白活性巰基含量的下降[47]。

圖4 扇貝肌原纖維蛋白與EAO-扇貝肌原纖維蛋白復(fù)合物活性巰基含量Fig.4 Reactive sulfhydryl content of scallop myofibrillar protein in the absence and presence of EAO during simulated digestion

2.5 EAO對蝦夷扇貝肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

構(gòu)成蛋白質(zhì)的多數(shù)非極性氨基酸側(cè)鏈分布在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，進而可以形成疏水內(nèi)核，疏水基團也會顯露出來，這是蛋白質(zhì)分子具有疏水性的原因[48]。蛋白質(zhì)分子表面暴露出越多的疏水基團，對應(yīng)的表面疏水性也就越高，蛋白質(zhì)變性程度也就越大[49]。由圖5可知：M組開始消化后表面疏水性顯著降低（P＜0.05），相比于對照組降低47.29%，在胃消化2 h時達到最小值，在進入腸道消化1 h后，表面疏水性略有上升但不顯著，在腸道消化2 h后開始顯著升高（P＜0.05）；EAO組的表面疏水性顯示了基本相似的變化，同樣表現(xiàn)為進入消化環(huán)境后與對照組相比出現(xiàn)顯著變化（P＜0.05）；但略有不同的是，EAO的添加使EAO-扇貝肌原纖維蛋白復(fù)合物的表面疏水性高于未添加組，4 組胃消化樣品和對照組相比分別升高95.06%、75.81%、84.67%、37.65%。以上現(xiàn)象說明，酸性的胃環(huán)境導(dǎo)致肌原纖維蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，隨著消化時間的延長不斷展開，這與巰基的變化一致。進入腸道消化后，pH值再次發(fā)生改變，隨著pH值不斷接近等電點范圍，表面疏水性逐漸升高，使得分子間結(jié)合更加緊密[50]。相似的結(jié)果在周心雅等[51]的研究結(jié)果中也得到證實。EAO作為一種低聚糖具有良好的抗消化性，因此也可能更容易改變蛋白的結(jié)構(gòu)[52]，因此相比于M組，EAO組的表面疏水性更高。

圖5 扇貝肌原纖維蛋白與EAO-扇貝肌原纖維蛋白復(fù)合物的表面疏水性Fig.5 Surface hydrophobicity of scallop myofibrillar protein in the absence and presence of EAO during simulated digestion

2.6 肌原纖維蛋白的SDS-PAGE圖譜

由圖6可知：隨著消化時間的延長，各條帶逐漸消失，低分子質(zhì)量的條帶顏色逐漸加深，這些現(xiàn)象和劉楚怡等[53]研究發(fā)現(xiàn)一致；褐藻寡糖-蝦夷扇貝肌原纖維蛋白復(fù)合物和扇貝肌原纖維蛋白的條帶沒有明顯差異，并且在48 kDa附近的條帶基本完全消失，但在消化過程中EAO組（A0、GA2、IA1、IA3）在5 kDa分子質(zhì)量附近的條帶顏色要略深于M組（對照、G2、I1、I3），這可能是由于EAO的添加進一步提高了復(fù)合物中蛋白酶解程度[54]。3 條顏色較深的條帶分別集中在17～35 kDa、11 kDa附近和5 kDa附近。還有2 條顏色較淺的條帶分布在75 kDa附近。結(jié)果表明，樣品在胃和腸消化期間消化完全，蛋白也被大量分解，同時樣品中含有少量α-乳白蛋白（14.2 kDa）和β-乳球蛋白（18.4 kDa）[55]。這和任方林等[56]發(fā)現(xiàn)大豆乳清蛋白在模擬消化過程中可以被胃液溶解，但在后續(xù)消化過程中基本不變的現(xiàn)象相符。

圖6 扇貝肌原纖維蛋白與EAO-扇貝肌原纖維蛋白復(fù)合物的SDS-PAGE圖Fig.6 SDS-PAGE pattern of scallop myofibrillar protein in the absence and presence of EAO during simulated digestion

2.7 EAO對蝦夷扇貝肌原纖維蛋白氫鍵含量的影響

pH值的改變對于EAO-蛋白復(fù)合物的影響本身就較為復(fù)雜，再結(jié)合復(fù)雜的胃腸消化環(huán)境致使氫鍵變化更加復(fù)雜，因此圖7只呈現(xiàn)2 組樣品在胃消化期間的氫鍵含量變化。周心雅等[51]通過調(diào)節(jié)酸堿度的變化深入研究兔肉肌原纖維蛋白功能特性時發(fā)現(xiàn)，氫鍵含量會隨著pH值的升高而增大。張超等[57]研究發(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合材料的主要作用力之一是氫鍵，并且pH值的降低使這種復(fù)合材料具有更穩(wěn)定的溶液體系。由圖7可知：EAO組樣品胃消化0.5 h后氫鍵含量較對照組顯著下降（P＜0.05），隨著消化時間的延長，氫鍵含量略有上升但各組間差異不顯著，EAO的添加使氫鍵的含量變化比M組顯著（P＜0.05）。這些變化可能是由于樣品進入低pH值環(huán)境下氫鍵穩(wěn)定性急劇下降，但同時隨著消化的進行，蛋白持續(xù)展開，增加了氫原子的結(jié)合位點，使EAO-肌原纖維蛋白復(fù)合物的氫鍵含量升高，氫鍵作用力也隨之增強[58-59]。

圖7 扇貝肌原纖維蛋白與EAO-扇貝肌原纖維蛋白復(fù)合物樣品消化后氫鍵的含量Fig.7 Hydrogen bond content of scallop myofibrillar protein in the absence and presence of EAO during simulated digestion

3 結(jié) 論

本研究通過測定提取的蝦夷扇貝肌原纖維蛋白和經(jīng)EAO修飾后的EAO-肌原纖維蛋白復(fù)合物在消化過程中結(jié)構(gòu)的變化，探究在消化環(huán)境中EAO的添加對蝦夷扇貝肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的影響。

胃和腸消化是一個存在劇烈酸堿度變化、十分復(fù)雜的過程。隨著消化的進行，肌原纖維蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，隨之發(fā)生變性；消化的進行也使蛋白被大量分解，肌原纖維蛋白在消化過程中持續(xù)發(fā)生氧化；同時，表面疏水性和氫鍵含量的變化結(jié)果也相符。添加EAO后，改變了肌原纖維蛋白微環(huán)境，使肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響了肌原纖維蛋白的折疊。EAO的修飾作用使肌原纖維蛋白具有更好的分子間作用力（氫鍵含量更高），抑制了肌原纖維蛋白的氧化，同時改變了原始肌原纖維蛋白的消化特性，形成的EAO-肌原纖維蛋白復(fù)合物在人體消化有一定改善的作用，可以被更好地消化吸收。

本研究結(jié)果表明，EAO可以成為扇貝肌原纖維蛋白的改良劑，為EAO和扇貝肌原纖維蛋白的結(jié)合以及后續(xù)扇貝和EAO相關(guān)高質(zhì)量、高營養(yǎng)產(chǎn)品的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。