女貞花水提物對牛蛙心臟和骨骼肌的影響

謝婷婷，沙愛龍

(1.重慶三峽學院 生物與食品工程學院，重慶，404120；2.重慶三峽學院 教師教育學院，重慶，404120)

女貞(LigustrumlucidumAit.)是木犀科女貞屬植物，又名冬青，在我國長江流域及以南地區(qū)等地常作為園林綠化樹種。其果實在中藥里稱為女貞子，化學成分主要有黃酮類、三萜類、苯乙醇類等，實驗研究證明，其具有降血糖血脂、抗衰老、抗炎抑菌、提高免疫功能等藥理作用[1]。目前國內(nèi)外對女貞子的化學成分和藥用價值的研究已經(jīng)相當成熟，而對于女貞花的研究仍有待完善，荊雅峰等發(fā)現(xiàn)金葉女貞花兼具鎮(zhèn)痛和抗炎活性的物質(zhì)主要存在于水提物中，且金葉女貞花的正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物均具有一定的抗炎活性[2]。相關研究表明,女貞花有降血糖功能[3-4]。但女貞花提取物對心臟生理特性和骨骼肌收縮作用的影響尚無文獻報道，本研究采用不同濃度女貞花水提物對牛蛙離體心臟及在體腓腸肌進行相關藥理學實驗，初步探討女貞花水提物對心肌、腓腸肌的影響及作用機制，以期進一步為女貞花的開發(fā)應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物

牛蛙6只(購于重慶市萬州區(qū)五橋永輝超市)，雌雄不限，體重200～260 g。

1.2 藥品與儀器

女貞花于2019年6月采于重慶市重慶三峽學院校園內(nèi)，由課題組鑒定為女貞的花。任氏液、電子天平為上海民橋精密科學儀器有限公司產(chǎn)品，BL-420F生物信號采集處理系統(tǒng)、FT-100肌張力換能器、斯氏蛙心插管、蛙心夾和引導電極，均為成都泰盟軟件有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 女貞花水提物的制備

取干燥女貞花1 g，置于燒杯中，加入100 mL蒸餾水，過濾，洗滌濾渣，合并濾液于100 mL容量瓶中，得10 mg/mL高劑量女貞花水提物。然后稀釋2次，各稀釋1倍，得5 mg/mL中劑量女貞花水提物和2.5 mg/mL低劑量女貞花水提物。

1.3.2 女貞花水提物對牛蛙離體心臟的影響

利用斯氏蛙心插管法進行離體心臟灌流[5]，保持套管內(nèi)含任氏液1.5 mL左右，蛙心夾夾取少許心尖，通過細線與張力換能器相連，連接好BL-420生物信號采集處理系統(tǒng)。先記錄正常心搏曲線5 min，然后分別加入不同濃度的女貞花水提取溶液，記錄心臟活動的變化。將加樣前后各組心臟的收縮幅度和心率進行比較。

1.3.3 女貞花水提物對牛蛙在體坐骨神經(jīng)腓腸肌的影響

參照文獻[6]制備牛蛙在體坐骨神經(jīng)腓腸肌標本，連接張力換能器，啟動生物信號采集處理系統(tǒng)，設置刺激參數(shù)，刺激強度由低到高，直至肌肉產(chǎn)生最大收縮幅度。操作過程中要時常滴加任氏液，防止標本表面干燥影響興奮性。隨后將標本取下，浸泡在盛有高濃度女貞花水提物的培養(yǎng)皿中10 min，再次連接張力換能器，記錄肌肉出現(xiàn)收縮的最小電壓強度(閾刺激強度)和肌肉出現(xiàn)最大收縮的最小電壓強度(飽和刺激強度)。

1.3.4 數(shù)據(jù)記錄

記錄離體心臟加樣前心臟的收縮幅度和心率、滴加不同濃度女貞花水提物后心臟的收縮幅度和心率。

牛蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本加樣前后的閾刺激強度和飽和刺激強度、肌肉收縮的潛伏期、收縮幅度、收縮時間、舒張幅度、舒張時間，并計算：收縮速率=收縮幅度/收縮時間，舒張速率=舒張幅度/舒張時間。

1.3.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 女貞花水提物對牛蛙離體心臟心率的影響

從圖1和表1可知，低、中濃度女貞花水提物作用于離體蛙心后，心率活動均表現(xiàn)為先短暫降低后上升，與給藥前相比心率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；高濃度女貞花水提物對離體蛙心心率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 女貞花水提物對離體蛙心心率的影響

2.2 女貞花水提物對牛蛙離體心臟心肌收縮力的影響

從圖1和表2可知，加入低濃度女貞花水提物后，心肌收縮力活動表現(xiàn)為前50 s內(nèi)升高，與加藥前相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，隨后50 s逐漸降低至穩(wěn)定狀態(tài)，與加藥前相比差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。加入中濃度女貞花水提物后心肌收縮力逐漸升高，與加藥前相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而后降低，與加藥前相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但具有促進作用。加入高濃度女貞花水提物后，心肌收縮力在前50 s內(nèi)與加藥前相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，隨后50 s收縮力逐漸降低，與加藥前相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但同樣具有促進作用。

表2 女貞花水提物對牛蛙離體心臟心肌收縮力的影響

圖1 女貞花水提物對牛蛙心臟收縮的影響

2.3 女貞花水提物對牛蛙在體坐骨神經(jīng)-腓腸肌閾刺激與最大刺激的影響

由表3可知，浸潤高濃度女貞花水提物后，在體坐骨神經(jīng)腓腸肌閾刺激強度的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而最大刺激強度雖有升高但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這表明高濃度女貞花水提物能在一定程度上降低該標本對外界電刺激的敏感性。

表3 女貞花水提物對牛蛙在體坐骨神經(jīng)-腓腸肌閾刺激和最大刺激的影響

2.4 女貞花水提物對牛蛙在體腓腸肌收縮潛伏期、收縮幅度、收縮速率和舒張速率的影響

由圖2和表4可知，浸潤高濃度女貞花水提物前后，腓腸肌的收縮潛伏期雖降低但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；收縮幅度與收縮速率均表現(xiàn)為明顯降低趨勢，與浸潤前比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；舒張速率呈現(xiàn)降低趨勢，與浸潤前比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 女貞花水提物對牛蛙在體腓腸肌收縮潛伏期、收縮幅度、收縮速率和舒張速率的影響

A-浸潤前；B-浸潤女貞花水提物后

3 討論

女貞子屬木犀科植物女貞的干燥成熟果實，現(xiàn)代藥理學研究表明，女貞子之所以具有抗炎鎮(zhèn)痛[7]、抗骨質(zhì)疏松[8]、保肝護肝[9]、免疫調(diào)節(jié)[10]等功效與其含有萜類(三萜類、環(huán)烯醚萜類)、黃酮類、揮發(fā)油、多糖類等化學成分有關[10]。作為同屬植物的女貞花化學成分復雜，主要含有黃酮類、三萜類、甾醇類和揮發(fā)油等化合物[1]。有研究表明，女貞子提取物可以調(diào)節(jié)大鼠心肌中抗氧化酶活性，對心肌具有很好的保護作用，維護心肌的正常結構和功能，提高運動能力，延緩疲勞發(fā)生[11]。該結果與本研究女貞花水提物可短暫增強心肌收縮能力的結果一致，這可能是因為女貞子與女貞花所含化學成分相似所致。有文獻報道植物黃酮類化合物對心肌細胞具有一定影響，如映山紅花總黃酮(total flavonoids of rhododendra simsiy,TFR)可減緩大鼠心肌細胞的收縮頻率，增強收縮性，孫曉青等[12]認為其作用與降低心肌細胞內(nèi)游離的Ca+含量有關；周曉敏等[13]發(fā)現(xiàn)黃芪總黃酮可以抑制病毒性心肌炎小鼠心室肌細胞Ca2+電流，且通過干擾細胞外Ca+的內(nèi)流影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca+的釋放，松弛心肌。研究表明，部分三萜類化合物通過作用于電壓依賴性鈣通道和受體操縱鈣通道，以抑制細胞內(nèi)Ca+釋放為主，從而具有舒張血管活性和降壓作用[14]。已知肌肉收縮主要與Ca+濃度有關，心肌細胞的肌質(zhì)網(wǎng)中貯存的Ca+量較少，其興奮-耦聯(lián)的過程高度依賴于胞外Ca+的內(nèi)流。本研究結果中，3種不同濃度的女貞花水提物均可使離體蛙心的心肌收縮力在短時間內(nèi)增強，隨后趨于穩(wěn)定，推測女貞花中所含的黃酮類化合物及三萜類化合物可能是引起該現(xiàn)象的主要活性成分，女貞花水提物在一定濃度范圍內(nèi)可增加細胞外Ca2+的內(nèi)流速度但不影響Ca2+總量，因而能在短時間內(nèi)增強心肌收縮能力。

骨骼肌的收縮能力受肌膜內(nèi)外離子活動的影響，Na+、K+等主要離子的濃度發(fā)生變化會影響膜電位的形成，進而影響肌肉的收縮[15]。電壓門控鈉通道在細胞膜中的分布密度、功能狀態(tài)以及細胞外的Ca2+水平是影響閾電位的主要因素，當細胞外Ca2+水平較高時，會使細胞膜對Na+的通透性減小，抬高閾電位，降低興奮性，反之，細胞的興奮性則會升高[16]。本研究結果表明，女貞花水提物可引起牛蛙在體坐骨神經(jīng)-腓腸肌的閾刺激顯著升高而對最大刺激強度無明顯影響。由此推測女貞花提取物作用于膜上電壓門控鈉通道，抑制Na+內(nèi)流速度，從而使得閾電位升高，降低標本的興奮性。在骨骼肌神經(jīng)-肌接頭的興奮傳遞過程中，接頭前膜產(chǎn)生的動作電位可激活前膜的電壓門控鈉離子通道，促進Ca2+內(nèi)流從而觸發(fā)囊泡出胞，因此，興奮的傳遞過程受Ca2+濃度影響[16]。本研究中，女貞花水提物可降低在體腓腸肌標本的收縮潛伏期，顯著降低收縮幅度和收縮速率，這可能與前膜乙酸膽堿(acetyl choline,Ach的釋放受到抑制以及后膜N2型Ach受體陽離子通道受阻有關。女貞花水提物可能通過降低前膜胞外Ca2+濃度來影響其內(nèi)流，抑制Ach受體陽離子通道從而降低腓腸肌標本的收縮幅度和速率，具體機制仍需進一步研究。

綜上所述，女貞花水提物可短暫增強心肌收縮能力而不影響其心率，可能與其所含黃酮類物質(zhì)及三萜類物質(zhì)可加快肌細胞外Ca2+內(nèi)流速度有關。高濃度女貞花水提物能夠引起在體腓腸肌標本的閾電位升高，降低其興奮性，增強骨骼肌收縮能力，可能與接頭前膜Ach的釋放被抑制以及后膜N2型Ach受體陽離子通道受阻有關。