羚羊角藥材鑒別的研究進(jìn)展

劉 慧

羚羊角來源于賽加羚羊的雄性獸角，味咸，性寒，歸肝、心經(jīng)，具有清肝明目、平肝熄風(fēng)、散血解毒的作用[1]。臨床上多用于治療子癇抽搐、神昏驚厥、高熱驚厥、癲癇發(fā)狂、目赤翳障、頭昏眩暈等病癥[2]。羚羊角素有“羚羊仙角”的美譽(yù)，因?yàn)橘惣恿缪蛉斯し庇?/p>

難數(shù)量較少，賽加羚羊被列入中國(guó)一級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物，市場(chǎng)上價(jià)格昂貴，不同偽品和不同級(jí)別的羚羊角屢見不鮮?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》規(guī)定羚羊角需要去掉骨塞制備為羚羊角粉后才能應(yīng)用于臨床治療。為了更好地鑒別羚羊角，本文通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)羚羊角鑒別方法的研究進(jìn)展及特點(diǎn)進(jìn)行綜述。

1 表觀性狀鑒別

性狀特征通過中藥材固有特征通過手摸、眼看、口嘗、鼻嗅等簡(jiǎn)便手段進(jìn)行[3]。羚羊角外形呈長(zhǎng)圓錐形，長(zhǎng)度為15～33 cm，全體呈弓形彎曲，通體光潤(rùn)，顏色多為黃白色或類白色，角基部呈青灰色，對(duì)光透視可見黑色斑紋和“血絲”，光滑如玉無裂痕，老枝生有10～16個(gè)環(huán)脊，間距為2 cm，正好用四指可手握，角基部橫斷面為直徑3～4 cm圓形，橫截面呈鋸齒狀，除去骨塞為半透明，中心隱約可見細(xì)孔，習(xí)稱“通天眼”[4]。

羚羊角具有區(qū)別于其他物種角的性狀特征，可通過觀察性狀以鑒別羚羊角，并且性狀鑒別不需要特殊儀器，適用鑒別整枝羚羊角或主要特性存在的羚羊角制品及切塊，經(jīng)驗(yàn)豐富的鑒定者可進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別[5]。但性狀鑒別方法依靠經(jīng)驗(yàn)，遇到樣本特性缺失或特征不明顯的在鑒定中會(huì)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)偏差。

2 顯微觀察鑒別

在顯微鏡下觀察羚羊角的細(xì)胞性狀、組織構(gòu)造、內(nèi)含物特征。羚羊角橫截面顯微鏡下可觀察到橄欖球狀角束，髓內(nèi)間隙較寬，皮層細(xì)胞均為3～5層，為無色透明的膠質(zhì)細(xì)胞填充，為無色素顆粒，細(xì)胞中存在折光性較強(qiáng)的點(diǎn)[6]。羚羊角縱截面在顯微鏡下可見長(zhǎng)管形髓狀結(jié)構(gòu)，髓細(xì)胞為圓形，排列較松散，縱向存在角質(zhì)細(xì)胞有序排列。羚羊角碎塊呈不規(guī)則性狀，近看無色，可見骨組織、骨陷窩，骨空洞呈現(xiàn)橢圓形、類圓形，骨板環(huán)紋清晰，具有透明感，可見平行排列的空隙，且色素顆粒不易察覺，角質(zhì)細(xì)胞多為角形，在細(xì)胞中央發(fā)亮有線狀物或圓形，碎片均勻分布縱向空隙，空隙以新月形和長(zhǎng)圓形為主[7]。

顯微觀察法具有特殊性，主要鑒別羚羊角的粉末或鎊絲(片)，在鑒定過程中根據(jù)羚羊角角質(zhì)細(xì)胞性狀、核狀物的顯微特性差異，對(duì)樣本進(jìn)行鑒別[8]。本方法對(duì)于羚羊角制品、切塊的鑒別有一定應(yīng)用價(jià)值，但會(huì)對(duì)鑒定樣品造成傷害，在鑒別中應(yīng)多處取樣，防止拼接、摻夾影響鑒定結(jié)果。

3 理化鑒別

通過物理或化學(xué)方法定性或定量分析中藥材所含有效成分以鑒別品質(zhì)[9]。羚羊角角質(zhì)的水煎液中氮磷元素含量高于羚羊角塞中含量，羚羊角塞中水溶性蛋白含量高于羚羊角質(zhì)中含量，并且羚羊角中脂類化學(xué)成分棕櫚酸、油酸、硬脂酸的含量指標(biāo)均較高。羚羊角中含有多種化學(xué)成分包括氨基酸、膽固醇、微量元素、脂肪酸、磷脂、甘油酯等。羚羊角粉在用硫酸水解后分析氨基酸成分多達(dá)18種[10]，包括組氨酸、精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、亮氨酸、丙氨酸。以上理化鑒別特征均可作為鑒別羚羊角的方法。

4 色譜鑒別

4.1 紫外鑒別羚羊角加油醚靜置后超聲萃取，過濾進(jìn)行紫外掃描，波長(zhǎng)為200～400 nm，波普顯示為在210 nm、218 nm、227 nm處各存在一個(gè)吸收峰[11]，該波長(zhǎng)下的吸收峰紫外圖譜特征可鑒別其他偽品。

4.2 薄層鑒別取羚羊角粉末加石油醚加熱回流1.5 h，濾過并將石油醚揮發(fā)后加乙醇回流，濾過蒸干，殘?jiān)? ml乙醇，進(jìn)行薄層檢驗(yàn)，展開劑為正丁醇-冰醋酸-水(3∶1∶1)，以茚三酮試液顯色，加熱后斑點(diǎn)清晰[12]。薄層層析結(jié)果說明羚羊角中含有磷脂酰絲氨酸、腦磷脂、卵磷脂、神經(jīng)鞘磷脂、磷脂酰肌醇等多種磷脂成分?？捎糜阼b別鎊片、鎊絲或粉末極為相似，很難區(qū)分，可采用薄層鑒別方法。通過展開劑和顯色方法不同能夠很好地區(qū)別羚羊角和其他物種角磊，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)實(shí)驗(yàn)，薄層鑒別方法可與其他檢驗(yàn)工作相結(jié)合。

4.3 電泳鑒別按照電泳圖譜物質(zhì)涌動(dòng)距離分為快速區(qū)、中速區(qū)、慢速區(qū)，圖譜上顯示按照譜帶、涂黑、斜線、打點(diǎn)分別為3級(jí)、1級(jí)帶、2級(jí)帶、3級(jí)帶。羚羊角來源不同電泳圖譜不同，譜帶的位置、條數(shù)、深淺度也存在差異，羚羊角正品共有6條譜帶，在3級(jí)均有譜帶[13]，電泳圖譜也可作為鑒別羚羊角真?zhèn)蔚姆椒ā?/p>

4.4 紫外熒光分析法紫外熒光分析法通過紫外光照射在物體表面發(fā)生熒光效應(yīng)，以區(qū)分羚羊角成分，對(duì)樣品無加工和破壞過程。羚羊角和其他動(dòng)物的角質(zhì)物在紫外燈的照射下均能夠出現(xiàn)熒光現(xiàn)象，羚羊角熒光多為紫色，而其他動(dòng)物角質(zhì)熒光多為藍(lán)色，其可作為鑒別羚羊角的輔助方法[14]。紫外熒光法指天然骨質(zhì)、角質(zhì)在紫外等照射下存在熒光效應(yīng)，人工仿制品中不含熒光物質(zhì)故無熒光效應(yīng)。紫外熒光法可用于羚羊角切塊、整枝羚羊角、粉末、羚羊角制品、鎊片等樣品，可對(duì)人工仿品進(jìn)行排除。

4.5 衰減全反射紅外光譜法衰減全反射紅外光譜是對(duì)化合物組成和結(jié)構(gòu)檢測(cè)的重要方法，對(duì)混合物的成分通過圖譜的峰形、峰位、峰強(qiáng)體現(xiàn)各種基團(tuán)，不同混合物的化學(xué)成分不同，紅外圖譜也存在不同。羚羊角樣本通過衰減反射紅外法測(cè)定，紅外圖譜相關(guān)系數(shù)在96.6%～99.4%，羚羊角不同位置所含的基團(tuán)種類相同，但在紅外圖譜中的峰強(qiáng)不同。紅外圖譜中存在較為明顯的酰胺吸收譜帶，說明羚羊角中存在蛋白質(zhì)成分，在1641 cm-1、1519 cm-1、1159 cm-1處波峰明顯，主要因?yàn)榱缪蚪侵械慕j(luò)氨酸、絲氨酸、蘇氨酸中的C-O鍵發(fā)生收縮振動(dòng)，2880 cm-1、2965 cm-1為CH收縮振動(dòng)波段，1448 cm-1為CH2基團(tuán)彎曲振動(dòng)形成，以上圖譜具有鑒別價(jià)值[15]。

衰減全反射紅外光譜通過樣本物質(zhì)對(duì)光線的吸收位置和吸收強(qiáng)度不同，以對(duì)樣本進(jìn)行定性和定量分析，可作為羚羊角塊、粉末、制品、鎊絲等樣本鑒別，以區(qū)別其他生物角類，通過原始紅外圖譜、計(jì)算紅外圖譜相關(guān)系數(shù)以進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別。

5 分子生物學(xué)鑒別

選擇細(xì)胞色素b基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，經(jīng)相關(guān)測(cè)序、擴(kuò)增已達(dá)到物種間差異鑒別目的。羚羊角樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增后能夠見到明亮條帶，可提取到濃度較好的DNA，DNA片段長(zhǎng)度約為475 bp，使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)序列對(duì)確定物種來源。通過分子生物學(xué)方法測(cè)序DNA序列能夠鑒定樣本的物種來源，可作為鑒別羚羊角的方法。

分子生物學(xué)方法通過物種遺傳物質(zhì)的獨(dú)特性進(jìn)行鑒別，對(duì)于樣本性狀缺失，無法確定來源部位的，可結(jié)合其他方法進(jìn)行共同鑒別，在操作過程中避免基因污染影響鑒定結(jié)果。

6 小結(jié)

羚羊角的炮制方法最早見于《本草經(jīng)集注》，從梁代收載了羚羊角的炮制方法，到晚清《醫(yī)家四要》中明確了羚羊角可采用鎊、銼、研磨等工藝，或燒灰成粉等方法，為了達(dá)到使整枝堅(jiān)硬的羚羊角變?yōu)榧?xì)粉吞服。但羚羊角并未記載骨塞使用資料。羚羊角的鑒別方法基于準(zhǔn)確性、簡(jiǎn)便性、適應(yīng)性的原則，可選方法包括性狀觀察法、紫外熒光分析法、顯微觀察法、衰減全反射紅外光譜法、電泳鑒別、薄層鑒別、分子生物學(xué)法等。各種鑒別方法存在不同的適用性和局限性，性狀觀察法能夠鑒別完整羚羊角，在外熒光分析法能夠準(zhǔn)確排除不含熒光物質(zhì)的人工仿品，衰減全反射紅外光譜聯(lián)合分子生物學(xué)鑒別方法能夠?qū)α缪蚪俏⒂^結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒別。分子生物學(xué)鑒別方法不可單獨(dú)使用，需要聯(lián)合其他鑒別方法共同發(fā)揮鑒定作用。通過對(duì)羚羊角各種鑒定方法的適應(yīng)性、特點(diǎn)分析，每種鑒定方法均存在一定的適應(yīng)范圍和局限性，實(shí)際工作中鑒別樣本的種類和形式也多種多樣，應(yīng)根據(jù)不同樣本的狀態(tài)，選擇準(zhǔn)確、快速的鑒別方法，單憑其中一項(xiàng)鑒別方法不能做到有效鑒別，應(yīng)選擇多種鑒定方法聯(lián)合應(yīng)用。