干細(xì)胞來源外泌體在急性肝衰竭炎癥驅(qū)動中的應(yīng)用價(jià)值

唐慧昕 張譯之 陳煜

急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)是無基礎(chǔ)肝病的患者2周內(nèi)出現(xiàn)II度及以上肝性腦病并伴乏力、黃疸、凝血功能障礙及肝臟進(jìn)行性縮小等的一組臨床綜合征[1-3]。病因多樣，病理表現(xiàn)為肝內(nèi)彌漫性炎性細(xì)胞浸潤和大量肝小葉壞死，肝細(xì)胞功能障礙發(fā)展迅速[4]，并可進(jìn)一步發(fā)展為腦水腫、敗血癥和多器官衰竭，最終導(dǎo)致死亡。ALF的年發(fā)病率在全球約為1～6例/100萬，死亡率高，治療費(fèi)用昂貴[1,4-5]。目前ALF的治療方案主要是內(nèi)科綜合治療、非生物型人工肝支持治療和肝移植[3]。然而，內(nèi)科治療ALF患者的病死率仍高達(dá)70%以上[6]、人工肝治療肝病人群受限、肝移植供體肝的缺乏、術(shù)后并發(fā)癥的高發(fā)生率以及難以負(fù)擔(dān)的經(jīng)濟(jì)成本限制了目前臨床的治療[1,5]。干細(xì)胞移植治療肝病近年來受到廣泛關(guān)注，它是具有自我更新和自我復(fù)制能力的非終末分化細(xì)胞，具有分化為不同類型組織和細(xì)胞的潛能[7]，可以促進(jìn)肝再生，然而移植后細(xì)胞存活率低、在體外難以擴(kuò)增、易失去肝臟特性并有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)，因此干細(xì)胞的應(yīng)用同樣有限[8-9]。為了彌補(bǔ)目前治療方案的不足，有研究表明，以干細(xì)胞來源外泌體為基礎(chǔ)的治療有望成為一種新的有效的治療策略。

干細(xì)胞來源的外泌體是干細(xì)胞釋放的細(xì)胞外囊泡[10]，大小在30～150 nm之間。其不僅可以通過旁分泌的形式傳遞到其他細(xì)胞執(zhí)行功能，還可以靶向靶細(xì)胞觸發(fā)下游信號，發(fā)揮抗炎、抗凋亡和免疫抑制作用，促進(jìn)組織修復(fù)，提高抗炎細(xì)胞因子水平[11-12]。由于其天然的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)特性和良好的生物相容性，外泌體還可以作為藥物載體促進(jìn)藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收[1]。目前干細(xì)胞來源外泌體在ALF的治療研究中取得了一定進(jìn)展，本文將從ALF與炎癥的關(guān)系及干細(xì)胞來源外泌體對ALF炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等方面作一匯總。

一、急性肝衰竭和炎癥

肝臟的主要功能之一是參與先天性免疫，而模式識別受體(PRRs)是天然免疫系統(tǒng)中的重要分子。它們識別病原微生物表面高度保守的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)和損傷組織與細(xì)胞釋放的損傷相關(guān)分子模式(DAMP)，激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)損傷部位的炎癥細(xì)胞浸潤，促進(jìn)炎癥因子的釋放，進(jìn)一步加劇損傷組織的炎癥狀態(tài)，并驅(qū)動和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)[13]。

越來越多的研究表明，由非感染源介導(dǎo)的損傷可引起炎癥反應(yīng)，而病理性的細(xì)胞死亡是無菌性炎癥的主要原因[14]。細(xì)胞死亡后，細(xì)胞膜對細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)容物通透性增加。當(dāng)細(xì)胞裂解時(shí)，內(nèi)容物被釋放。然后這些分子與Toll樣受體(TLRs)等模式識別受體結(jié)合，從而誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子[如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8]的產(chǎn)生與釋放，導(dǎo)致級聯(lián)性的炎癥反應(yīng)。TNF-α在由病毒感染、脂肪變性、自身免疫和酒精或?qū)σ阴０被?APAP)引起的急性或慢性肝炎的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。IL-1β與早期炎癥反應(yīng)和有毒物質(zhì)有關(guān)，其水平升高激活免疫細(xì)胞合成和釋放許多參與免疫反應(yīng)的炎性細(xì)胞因子，導(dǎo)致炎癥和組織破壞[16]。IL-6刺激參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖、分化，并增強(qiáng)其功能[17]。IL-8水平可反映器官對毒物炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度[18]。機(jī)體暴露于各種肝毒性因素后首先激活TNF-α和IL-1β，誘導(dǎo)TNF-α和IL-1β促進(jìn)IL-6、IL-8等炎性細(xì)胞因子的上調(diào)，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的級聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而加重ALF。

ALF是一個(gè)以炎癥反應(yīng)為主的肝細(xì)胞損傷過程，多種肝毒性因子如刀豆蛋白A(ConA)、對乙酰氨基酚(APAP)和脂多糖(LPS)可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及免疫功能紊亂，導(dǎo)致ALF，而炎癥的級聯(lián)反應(yīng)和免疫應(yīng)答失衡在ALF的發(fā)病和轉(zhuǎn)歸中起著關(guān)鍵作用[19]。研究表明，與健康對照組相比，ALF患者體內(nèi)C3和C5補(bǔ)體水平降低，中性粒細(xì)胞吞噬功能受損，肝內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白(CRP)和促炎因子IL-6水平較高，而抗炎因子IL-5水平較低[20-21]。另外ALF患者中CD8+干擾素-γ+T淋巴細(xì)胞數(shù)量是明顯增加的，細(xì)胞因子如IL-10、TNF-α和IL-12也顯著上調(diào)[20]。因此，迫切需要有效的治療策略來抑制多因素誘導(dǎo)的ALF炎癥反應(yīng)。

二、干細(xì)胞來源外泌體對ALF炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用

干細(xì)胞培養(yǎng)上清液中提取外泌體治療ALF的研究不斷有報(bào)道。目前研究認(rèn)為外泌體主要是通過抑制炎癥因子分泌或阻斷多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的載體等來防止肝臟炎癥、纖維化和器官的進(jìn)一步衰竭，不同干細(xì)胞來源的外泌體對炎癥因子及通路的調(diào)節(jié)有所不同。

(一)不同干細(xì)胞來源外泌體對ALF的炎癥調(diào)節(jié)

1.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體(BMSC-Exos)：BMSC-Exos可顯著降低ALF小鼠血清中的干擾素-γ(IFN-γ)、IL-1β和IL-6水平，明顯升高細(xì)胞因子IL-10的水平。ALF的體外模型顯示[22-23]，BMSC-Exos可誘導(dǎo)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槁褕A形細(xì)胞前體細(xì)胞，并通過補(bǔ)充肝細(xì)胞修復(fù)受損的肝臟。Shuxian Zhao等[24]通過D-氨基半乳糖/脂多糖(D-Gain/LPS)誘導(dǎo)ALF大鼠模型，發(fā)現(xiàn)BMSC-Exos可上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3II和Beclin-1的表達(dá)，促進(jìn)自噬小體的形成。經(jīng)BMSC-Exos處理后，促凋亡蛋白Bax和裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的表達(dá)水平明顯降低，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平上調(diào)。然而，當(dāng)自噬抑制劑3MA存在時(shí)，BMSC-Exos抑制凋亡的作用明顯逆轉(zhuǎn)，自噬相關(guān)蛋白LC3II和抗凋亡蛋白Bcl-2減少，促凋亡蛋白caspase-3增加。此研究證實(shí)，BMSC-Exos可通過激活自噬來減輕D-Gain/LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷和凋亡。

2.人經(jīng)血干細(xì)胞來源外泌體(MenSC-Exos)：有研究使用MenSC-Exos治療D-Gain/LPS誘導(dǎo)的ALF小鼠模型，與對照組相比，MenSC- Exos預(yù)處理的小鼠血清中的ALT和AST水平明顯低于D-Gain/LPS單獨(dú)處理組；顯著下調(diào)了血清及肝組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，抑制了肝細(xì)胞凋亡及caspase-3的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測表明，MenSC-Exos可抑制肝臟炎癥細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞)的募集，減少炎癥細(xì)胞的數(shù)量。此研究表明，MenSC- Exos通過抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生來預(yù)防D-Gain/LPS誘導(dǎo)的ALF，進(jìn)而改善肝功能、降低死亡率[25]。

3.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體(hUCMSC-Exos)：研究表明，hUCMSC-Exos可通過抑制巨噬細(xì)胞活化，顯著降低血清中ALT和AST水平，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖；還可以通過傳遞谷胱甘肽過氧化物酶-1(GPX1)，上調(diào)ERK1/2和Bcl-2水平，下調(diào)IKKB/NF-kB/Casp-9/3通路，抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[26-27]。Wu等[28]研究發(fā)現(xiàn)，hUCMSC-Exos顯著下調(diào)APAP誘導(dǎo)的ALF小鼠肝組織中炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平，且降低了MDA、恢復(fù)了肝臟SOD活性；明顯抑制了肝細(xì)胞凋亡，改善了肝功能，提高了小鼠存活率。Shao等[29]利用LPS誘導(dǎo)ALF小鼠模型，發(fā)現(xiàn)在IL-6刺激下產(chǎn)生了大量富含miR-455-3p的hUCMSC-Exos，這些外泌體可靶向PIK3r1，抑制LPS攻擊的巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子, 改善了肝損傷并維持了系統(tǒng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

4.人子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(HuES9.E1 MSC-Exos)：

HuES9.E1 MSC-Exos通過上調(diào)STAT3和抑制核因子-κB(NF-κB)途徑顯著逆轉(zhuǎn)小鼠ALF。同時(shí)給予HuES9.E1 MSC-Exos可減輕四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的小鼠損傷，外泌體處理組小鼠肝臟NF-κB基因表達(dá)增強(qiáng)。在APAP和過氧化氫(H2O2)處理誘導(dǎo)的ALF小鼠體外模型中，外泌體組上調(diào)了細(xì)胞增殖標(biāo)志物的表達(dá)，表明HuES9.E1 MSC-Exos在急性損傷過程中促進(jìn)了肝細(xì)胞的再生和增殖，其NF-κB和磷酸化STAT3活性恢復(fù)到損傷前的正常表達(dá)水平。此外，HuES9.E1 MSC-Exos還通過上調(diào)Bcl-xL抑制APAP和H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)[30]。

5.人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體(AMSC-Exos)：AMSC-Exos用于治療D-Gain/LPS誘導(dǎo)的ALF，血清中的ALT和AST水平顯著降低。AMSC-Exos可被肝巨噬細(xì)胞攝取，減少血清中炎癥因子(TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6和IL-18)的分泌，并能激活巨噬細(xì)胞中的炎癥復(fù)合體(NLRP3、Caspase-1和Asc)，其中NLRP3炎性小體激活的關(guān)鍵因素是TXNIP，TXNIP的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了AMSC-Exos對LPS刺激的巨噬細(xì)胞炎性小體激活的抑制作用。且AMSC-Exos含有高水平的miR-17家族miRNAs，尤其是miR-17，其可以通過靶向TXNIP和調(diào)節(jié)肝巨噬細(xì)胞中炎性小體的激活，從而改善ALF[31]。

(二)外泌體抑制ALF炎癥中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

1.JNK、NF-κB、STAT3等信號通路：許多研究表明，多條信號通路包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、NF-κB和核苷酸結(jié)合域樣受體蛋白3(NLRP3)在 ALF的炎癥反應(yīng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用[32]。MAPK家族由c-jun-N末端激酶、p38激酶和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶組成，可調(diào)節(jié)COX-2、IL-1β和IL-6等因子的轉(zhuǎn)錄[33]。JNK是一種應(yīng)激和絲裂原激活的蛋白激酶，是促凋亡途徑的關(guān)鍵因子。激活的JNK可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，促進(jìn)肝細(xì)胞死亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。此外，NF-κB含有p50/p65和I-κB蛋白抑制劑，在宿主防御中有著非常重要的作用，并可介導(dǎo)促炎介質(zhì)和細(xì)胞因子的表達(dá)。在巨噬細(xì)胞中，STAT3通過抑制STAT1信號通路，進(jìn)而減少IL-12、IL-27和IFN-γ等細(xì)胞因子的產(chǎn)生。STAT3還可以抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)和TNF-α等細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少。最后，這些細(xì)胞因子以肝細(xì)胞為靶點(diǎn)，促進(jìn)或預(yù)防肝細(xì)胞損傷。NLRP3是一個(gè)多蛋白復(fù)合體，一旦受到LPS等因素的刺激，NLRP3蛋白則會聚并結(jié)合到Asc接頭上，然后促進(jìn)caspase-1的招募并激活成熟形式的IL-1β，最終釋放IL-1β和IL-18，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[34]。

不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體抑制了ALF中相關(guān)信號通路的激活。如上所述的HuES9.E1MSC-Exos通過上調(diào)STAT3和抑制NF-κB途徑顯著逆轉(zhuǎn)小鼠的ALF，使NF-κB(p50和p65)和磷酸化STAT3的活性恢復(fù)到損傷前的正常表達(dá)水平[30]。用質(zhì)譜和抗體陣列分析外泌體中的蛋白質(zhì)成分，發(fā)現(xiàn)IL6ST蛋白通過激活I(lǐng)L-6/STAT3途徑在肝細(xì)胞保護(hù)中發(fā)揮重要作用；CXCL2/MIP-2可通過上調(diào)STAT3促進(jìn)肝細(xì)胞增殖來減輕肝損傷。hUCMSC-Exos則通過上調(diào)ERK1/2和Bcl-2水平，下調(diào)IKKB/NF-κB/Casp-9/3通路，抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[26-27]。AMSC-Exos[31]可激活巨噬細(xì)胞中的炎癥復(fù)合體NLRP3、Caspase-1和Asc，其中NLRP3炎性小體激活的關(guān)鍵因素是TXNIP，AMSC-Exos中含有高水平miR-17，其可以通過靶向TXNIP和調(diào)節(jié)肝巨噬細(xì)胞中炎性小體的激活，從而改善ALF。

2. TNF-α途徑與肝細(xì)胞生長因子/c-蛋氨酸軸(HGF/c-Met)

除了上述主要信號通路外，TNF-α通路在急性炎癥性疾病，包括全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和ALF伴發(fā)急性器官損傷中也起著關(guān)鍵作用。TNF-α功能障礙的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，釋放風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的分子模式因子，激活組織中的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和其他促炎細(xì)胞因子或趨化因子，進(jìn)而招募多形核白細(xì)胞(PMN)進(jìn)入受損組織，加劇級聯(lián)反應(yīng)。此外，TNF-α也是急性創(chuàng)傷后組織修復(fù)的主要調(diào)節(jié)因子之一，其可激活p38MAPK和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化，激活常駐祖細(xì)胞，動員循環(huán)干細(xì)胞促進(jìn)組織再生[35]。TNF-α可啟動肝再生所依賴的NF-κB和IL-6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，啟動G1期的STAT3轉(zhuǎn)錄因子，而經(jīng)HuES9.E1MSC-Exos處理的受損肝細(xì)胞顯著增加了TNF-α激活的NF-κB和STAT3的表達(dá)。IL-6/STAT3通路隨后啟動了從G1期到S期的細(xì)胞周期，這與外泌體處理后細(xì)胞周期蛋白D1和PCNA的上調(diào)是一致的。上調(diào)的基因和蛋白表達(dá)水平共同促進(jìn)細(xì)胞活性的恢復(fù)，這表明外泌體可通過誘導(dǎo)肝細(xì)胞再生來介導(dǎo)ALF的肝修復(fù)。此外，HGF/c-Met軸也與ALF有關(guān)。HGF是肝損傷后肝再生修復(fù)過程中最重要的有絲分裂原，其生物學(xué)效應(yīng)是由單一酪氨酸激酶受體c-Met介導(dǎo)的[36]。肝病患者血清中的HGF水平在一定程度上可反映肝損傷和肝功能障礙，在大鼠肝部分切除(PH)后，HGF蛋白水平及其受體c-Met的活性即刻升高。HGF過表達(dá)或外源性HGF可誘導(dǎo)肝細(xì)胞增殖，加速大鼠PH后的肝再生過程。在體內(nèi)，HGF和c-Met可以沉默RNAi，此時(shí)肝再生受到破壞，許多與細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)的基因表達(dá)模式出現(xiàn)異常。這表明HGF/c-Met信號通路在肝再生中起著至關(guān)重要的作用，而HGF在MSC來源的外泌體中含量豐富。

三、總結(jié)與展望

近年來，干細(xì)胞來源的外泌體在治療肝臟疾病方面取得了一些進(jìn)展。不同干細(xì)胞來源的外泌體在肝臟多種細(xì)胞類型之間的信息傳遞中起著關(guān)鍵作用。它們可以改變靶細(xì)胞的功能，激活不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而抑制肝臟疾病的發(fā)生和發(fā)展，有望為治療和診斷提供新的思路，但目前這一領(lǐng)域仍處于初級階段。隨著對外泌體的深入研究，相信在不久的將來其可以成功應(yīng)用于ALF及其他肝臟疾病的治療。