新煙堿類殺蟲劑對人類及哺乳動物的生殖毒性作用

馬躍，毛亞萍，劉芙，宋月清，柴琳青，王鑫，袁寧，馬明月

（1.沈陽醫(yī)學院2018級本科生；2.公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生檢驗學教研室；3.2019級本科生；4.公共衛(wèi)生學院毒理學教研室）

新煙堿類殺蟲劑（neonicotinoids，NEOs）是一種廣譜殺蟲劑，自1991年第一種NEOs——吡蟲啉（imidacloprid，IMI）開發(fā)以來，已發(fā)展成為世界上使用最廣泛的一類殺蟲劑，常用于農(nóng)業(yè)、園林綠化和家庭寵物中的昆蟲防治［1］。NEOs主要包括IMI、啶蟲脒（acetamiprid，ACE）、噻蟲胺（clothianidin，CLO）、噻 蟲 啉（thiacloprid，THD）、噻蟲 嗪（thiamethoxam，THM）、烯啶蟲胺（nitenpyram，NIT）和呋蟲胺（dinotefuran，DIN）等［2］。其作為激動劑，通過選擇性作用于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)突觸后膜的煙堿型乙酰膽堿受體（nAChRs），使昆蟲異常興奮，最終導致全身痙攣麻痹而死亡［3］。因其對哺乳動物nAChRs親和性較低，該類殺蟲劑對哺乳動物毒性較低，可替代傳統(tǒng)殺蟲劑（有機氯類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類等），且與其不發(fā)生交互抗性［2］。但由于NEOs分子量低，水溶性較高，不容易發(fā)生水解，具有很強的內(nèi)吸性，因此容易在土壤、水體、農(nóng)作物中殘留，并通過飲水、飲食、皮膚接觸等途徑進入人體［4］，從而導致人群的廣泛暴露，對人類健康產(chǎn)生不利影響。流行病學研究的有限數(shù)據(jù)確定了NEOs的急性和慢性健康影響，特別是母親孕期NEOs暴露對后代的影響，包括呼吸道疾病、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以及氧化遺傳損害和先天缺陷等［5］。動物模型研究表明，NEOs暴露可導致遺傳毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性和生殖毒性等［2，4］。本文主要對NEOs暴露對人類及哺乳動物的生殖毒性作用及其機制研究進展進行綜述。

1 NEOs對人類的生殖毒性作用

1.1 NEOs 在人群中的暴露水平 NEOs 的廣泛應用，以及食物、飲水中NEOs的普遍存在，不可避免地導致了人體的累積暴露，特別是農(nóng)民和農(nóng)藥經(jīng)營者。Chen 等［6］根據(jù)第五次（2009-2012 年）和第六次（2015-2018 年） 中國總膳食研究（CTDS）收集的復合飲食樣本（528 個），研究了中國成年人飲食的NEOs 暴露情況，確定了10 種NEOs 水平，其中ACE 和IMI 是最常檢測到的NEOs；總NEOs的平均估計每日攝入量（EDI）分別為598.95 和710.38 ng/kg。鑒于食物中NEOs 的普遍存在，其可能導致的健康風險不容忽視。Zhang 等［7］測定了我國13 個城市共324 名志愿者的 尿 液 樣品 中6 種NEOs （CLO、THM、IMI、DIN、ACE、THD）水平，發(fā)現(xiàn)NEOs檢測率均達92%以上，體現(xiàn)了人群NEOs暴露的普遍性；且男性尿液樣品NEOs水平顯著高于女性。有研究顯示兒童是NEOs暴露的易感人群。Osaka等［8］對日本223 名3 歲兒童的尿液樣本中的7 種NEOs 進行了檢測，檢出率較高的是DIN、THM 和NIT，分別為58%、25%和21%，IMI和ACE的檢出率分別為15.2%和12.1%，夏季尿液樣品中總NEOs 濃度顯著高于冬季。陶燕［9］對河南果園種植區(qū)共617人的尿液中吡蟲啉及其代謝物6-氯煙酸進行檢測，發(fā)現(xiàn)農(nóng)區(qū)居民尿液中目標物濃度均高于城區(qū)居民；農(nóng)區(qū)青少年和老年人暴露濃度相對較高；農(nóng)區(qū)兒童暴露濃度顯著高于城區(qū)兒童，相差3.30～4.49倍，年齡越小的兒童暴露風險越高。以上流行病學研究顯示，NEOs的廣泛應用導致了人群的廣泛暴露，DIN、IMI和ACE等檢測率均較高，農(nóng)民、農(nóng)藥經(jīng)營者及兒童的暴露風險更高。NEOs的長期累積暴露對人體健康的潛在影響不可忽視。

1.2 NEOs 對人類的生殖毒性作用 NEOs 累積暴露對人類健康影響的流行病學研究揭示了其慢性毒性作用。有研究發(fā)現(xiàn)，NEOs暴露與記憶力減退和手指震顫等神經(jīng)癥狀的產(chǎn)生［10］、肺功能障礙［11］等存在相關性。目前NEOs對人類生殖系統(tǒng)的毒性作用，特別是孕期NEOs暴露對后代生殖系統(tǒng)的影響的研究極少。Suwannarin 等［12］對泰國北部143名男性農(nóng)場工人（18～40 歲）的尿液NEOs 及其代謝物進行檢測，發(fā)現(xiàn)超過60%樣本中檢測到NEOs代謝物，線性回歸分析顯示，IMI水平與睪酮、脫氫皮質(zhì)酮和脫氫表雄酮水平呈正相關；吡蟲啉-烯烴和脫氫表雄酮水平呈正相關；THM與脫氫皮質(zhì)酮和脫氧皮質(zhì)酮水平呈負相關；CLO、THM和N-去甲基-啶蟲脒水平與雄烯二酮水平呈正相關，結(jié)果表明，NEOs暴露可影響類固醇的生成。

NEOs對人類的生殖發(fā)育毒性的研究主要體現(xiàn)在孕期NEOs 暴露對后代發(fā)育的影響。Ichikawa等［13］分析了極低出生體重兒的NEOs 暴露情況，在出生后48 h內(nèi)收集的57個尿液樣本中N-去甲基啶蟲脒的檢測率為24.6%，出生后第14天的65個樣本中N-去甲基啶蟲脒的檢測率為11.9%，小于胎齡兒中尿N-去甲基啶蟲脒的檢出率和水平均高于適于胎齡兒（P＜0.05）。Keil等［14］對孤獨癥譜系障礙（ASD）兒童與母親IMI暴露情況的關聯(lián)性進行了研究，研究納入407例ASD兒童和262例健康對照組，發(fā)現(xiàn)ASD 兒童產(chǎn)前IMI 暴露的概率稍高（OR=1.3，95%CI：0.78～2.2）。有研究者對美國加利福尼亞州殺蟲劑應用區(qū)域的出生缺陷發(fā)生風險與妊娠早期殺蟲劑暴露的相關性進行了研究，發(fā)現(xiàn)無耳畸形（OR=3.0，95%CI：1.4～6.6）、肢體橫向缺陷（OR=2.9，95%CI：1.1～7.4）、顱縫早閉癥（OR=3.5，95%CI：1.5～8.3）、無 腦 畸 形（OR=2.9，95%CI：1.0～8.2） 發(fā)生風險與IMI 暴露相關［15-16］，法洛四聯(lián)癥發(fā)生風險與NEOs 暴露相關（OR=2.4，95%CI：1.1～5.1）［17］。

綜上所述，NEOs暴露可對人類健康產(chǎn)生不良影響，與神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、呼吸系統(tǒng)癥狀發(fā)生相關。孕期NEOs暴露與不良出生結(jié)局相關，包括極低出生體重兒，以及ASD、先天性心臟病、先天性無腦畸形等。但NEOs暴露對人類生殖系統(tǒng)毒性作用研究較少，并且NEOs暴露對人類健康不良影響的可能機制仍不明確。

2 NEOs對哺乳動物的生殖毒性作用

目前，NEOs的毒性作用及相關機制主要通過動物模型進行研究，涉及神經(jīng)毒性、肝毒性、生殖毒性等。NEOs可與哺乳動物的神經(jīng)元α7和α4β2 nAChRs結(jié)合，發(fā)揮神經(jīng)毒性作用［18-19］。而哺乳動物nAChRs不僅在神經(jīng)系統(tǒng)中表達，還可在睪丸精子細胞、間質(zhì)細胞、支持細胞、精原細胞、精母細胞、胎盤等中均有表達［20］。目前已有多項研究報告了NEOs暴露對哺乳動物生殖系統(tǒng)的不良影響。

2.1 NEOs 的雄性生殖毒性作用 目前已有多項研究揭示了NEOs 暴露對雄性生殖系統(tǒng)的損害。IMI 和ACE 暴露可導致大鼠和小鼠的體重和生殖器官（睪丸、附睪、精囊、前列腺）的重量顯著下降，睪酮濃度以及精子數(shù)量、活力、頂體完好度顯著降低，精子DNA片段化，促性腺激素釋放激素、促黃體生成素、卵泡刺激素水平升高［21-23］；還可對小鼠精子的受精能力和胚胎發(fā)育產(chǎn)生不利影響［24］。ACE暴露可導致未成熟小鼠睪丸中睪酮代謝基因（Lhr、Star、Cyp11a1、Cyp17a1、Hsd17b1）、nAChRs亞基（α4、β2、α7）基因、細胞增殖相關基因（Ki67、Top2a）表達下降，但不影響垂體中LHβ和FSHβ基因的表達水平；并且可檢測到血清和睪丸中ACE 水平顯著上升［25］。目前關于孕期NEOs 暴露對子代發(fā)育影響的研究較少。Yanai等［26］評估了小鼠孕期和產(chǎn)后早期（GD1～PND14）CLO 暴露［10、50 mg/（kg·d）］對后代雄性生殖毒性的影響，發(fā)現(xiàn)CLO 暴露導致雄性子代睪丸重量和精子數(shù)量降低，但不影響睪丸類固醇的生成水平、睪丸間質(zhì)細胞凋亡數(shù)量和增殖活性。Burke 等［27］評 估 了 小 鼠 孕 期 和 產(chǎn) 后 早 期（GD4～PND21）IMI暴露［0.5 mg/（kg·d）］對子代的影響，發(fā)現(xiàn)IMI暴露降低了母鼠的繁殖力，且成年子代雄鼠運動能力增加，體重降低，但不影響成年雌鼠體重；在母鼠的大腦和肝臟中可檢測到低水平的IMI，而在一些后代中檢測到痕量IMI水平，這表明IMI可以從母鼠轉(zhuǎn)移到幼鼠。

2.2 NEOs 的雌性生殖毒性作用 NEOs 的雌性生殖毒性作用主要表現(xiàn)在其對卵巢的毒理學作用。Kapoor 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，IMI［20 mg/（kg·d）］對雌性大鼠的卵巢產(chǎn)生了明顯不良影響，其表現(xiàn)為卵巢重量減少，卵泡、竇狀卵泡和閉鎖卵泡的病理形態(tài)學變化明顯；增加發(fā)情期持續(xù)時間，從而擾亂發(fā)情周期；促黃體生成素和孕酮水平下降，卵泡刺激素水平上升；同時誘導氧化應激產(chǎn)生。還有研究發(fā)現(xiàn)，雌性大鼠孕期IMI暴露［10 mg/（kg·d）］可導致子代雌二醇和孕酮水平下降，卵巢重量和直徑減少，卵泡數(shù)量減少，子代交配成功率及其胚胎數(shù)量降低，以及DAX1 基因表達降低［29］。

以上結(jié)果表明，NEOs暴露對哺乳動物雌性和雄性生殖系統(tǒng)及胚胎發(fā)育均有損害。目前評估孕期NEOs暴露對后代生殖發(fā)育影響的研究較少，相關調(diào)控機制仍不明確。以動物模型實驗進行作用機制的深入研究，有助于揭示孕期NEOs暴露與潛在的生殖健康效應。

3 NEOs生殖毒性的可能機制

3.1 氧化應激 研究顯示，NEOs 暴露誘導的氧化應激在其對非靶標物種的毒性中起著重要作用。IMI暴露可導致雄性大鼠睪丸中以及雌性大鼠卵巢中脂質(zhì)過氧化物顯著增加，谷胱甘肽水平降低，同時過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶活性降低，導致雄性大鼠睪酮水平以及雌性大鼠促黃體生成素、卵泡刺激素和孕酮水平紊亂［23，28］。IMI 暴露也可導致雌性大鼠肝、腎和腦中產(chǎn)生氧化應激［29］。ACE暴露也可引起氧化應激反應，導致睪丸中丙二醛和一氧化氮水平顯著增加，而過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶含量顯著降低，并激活了p38 MAPK 通路，進而導致睪丸間質(zhì)細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體受損，ATP 和cAMP的產(chǎn)生降低，從而降低了cAMP依賴性蛋白Star、HSD3B、Cyp11a1 的mRNA 和 蛋白表達水平，并影響了類固醇激素的合成［21-22］。研究報道，抗氧化物（維生素C、維生素E、姜黃素等）可改善IMI和ACE誘導的氧化應激損傷［21，23］。

3.2 影響類固醇的生物合成 環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（endocrine disrupting chemicals，EDCs） 可 模擬或拮抗內(nèi)源激素，結(jié)合類固醇激素核受體，干擾相關基因轉(zhuǎn)錄過程，這可能是NEOs 作為EDCs 發(fā)揮生殖毒性作用的一種機制。有研究揭示了NEOs和類固醇激素核受體的相互作用。Zhang 等［30］評估了THD和IMI作為EDCs的潛在作用，發(fā)現(xiàn)在相對較高的濃度下（＞10-4mol/L），IMI 可通過結(jié)合雌激素受體（ERα）誘導劑量依賴的雌激素效應。Yuan等［31］研究發(fā)現(xiàn)，IMI 暴露可導致小鼠睪丸重量顯著降低，睪丸形態(tài)嚴重受損，血清睪酮和雌二醇水平顯著下降，睪丸雄激素受體的表達也顯著下降；血清膽固醇來源減少，膽固醇合成限速酶HMG-CoA合成酶表達顯著降低；分子對接結(jié)果分析表明，IMI成功地對接至雄激素受體的活性位點，且IMI和雄激素受體之間具有穩(wěn)定的結(jié)合；數(shù)據(jù)表明，IMI可通過與雄激素受體相互作用而導致內(nèi)分泌破壞。

芳香化酶是可催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素。NEOs對芳香化酶活性的影響，也可能導致內(nèi)分泌紊亂。在體外胎兒胎盤類固醇生成模型中，IMI處理可誘導芳香化酶（CYP19）活性，并發(fā)現(xiàn)增加雌酮和雌二醇水平，而降低雌三醇水平；還發(fā)現(xiàn)IMI 可誘導CYP3A7 的表達，CYP3A7 通常在胎兒肝臟中表達，是參與雌三醇合成的關鍵酶，IMI可能被CYP3A7 代謝，抑制胎兒硫酸脫氫表雄甾酮的16α-羥基化，進而影響其向雌三醇的轉(zhuǎn)化，這可能是雌三醇減少的原因［32］。在一項評估IMI 對雄性內(nèi)分泌系統(tǒng)的毒性作用研究中，發(fā)現(xiàn)IMI暴露可導致小鼠血清芳香化酶活性顯著降低［33］。NEOs對芳香化酶活性的影響可能是其生殖毒性的重要機制。

綜上所述，NEOs的廣泛應用導致了人群的廣泛暴露，且兒童的暴露風險更高。母親孕期NEOs暴露與呼吸道疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、先天性心臟病和先天性無腦畸形等的發(fā)生相關。但NEOs對人類健康的潛在影響仍不明確，很多尚無肯定的結(jié)論。動物模型和體外實驗結(jié)果揭示了NEOs暴露對哺乳動物雌性生殖系統(tǒng)和雄性生殖系統(tǒng)的損傷，NEOs導致生殖損傷的機制之一是氧化應激，其他可能信號通路研究較少，其毒性作用機制仍不十分明確。目前關于母親孕期暴露對子代生殖系統(tǒng)影響的研究較少，其潛在影響及相關機制仍需深入研究。相關機制的深入研究有助于篩選新的敏感性分子生物標志物，從而能夠評價NEOs對人體健康的不良影響；更有助于探索保護職業(yè)暴露人群（如農(nóng)民和農(nóng)藥經(jīng)營者）免受NEOs毒性作用的方法。