共固定化葡萄糖氧化酶研究進展*

高豐琴，何玉梅，安紅婷，牟 萱

（咸陽師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 咸陽 712000）

葡萄糖氧化酶可催化氧化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸內(nèi)酯，然后水解為葡萄糖酸和H2O2。該方法檢測葡萄糖具有靈敏度高、準確、快速的特點[1]，而且，反應(yīng)中產(chǎn)生的H2O2可以在級聯(lián)酶反應(yīng)中做氧化劑[2]。近年來，葡萄糖氧化酶法已被廣泛用于臨床、食品、生物技術(shù)、化學(xué)合成等行業(yè)中[3]。但游離酶在高溫和強酸強堿等環(huán)境下很容易因失活而導(dǎo)致催化效率降低，且反應(yīng)后難于回收重復(fù)利用。而固定化酶則可以提高酶的操作穩(wěn)定性、在反應(yīng)體系中容易實現(xiàn)與底物或產(chǎn)物的分離，可實現(xiàn)多次重復(fù)使用，從而提高其經(jīng)濟效益，有利于可持續(xù)發(fā)展[4]。與單酶固定化相比，葡萄糖氧化酶的共固定化由于可以將兩種酶的催化特性結(jié)合起來，充分發(fā)揮每一種酶的特點甚至利用級聯(lián)反應(yīng)的協(xié)同作用，而使酶的催化效率得以提高，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景[5]。

1 葡萄糖氧化酶與氯過氧化物酶的共固定化

雙酶共固定化，需要選擇合適的固定化載體，并采用合適的固定化方法來實現(xiàn)雙酶的固定并達到預(yù)期的功能。Yildirim Nimet等[6]在玻璃基板上采用溶膠-凝膠包埋法固定化葡萄糖氧化酶（GOx）和氯過氧化物酶（CPO），并用于檢測一種pH敏感熒光染料。在磷酸鹽緩沖pH值為7.0溶液中，反應(yīng)體系的熒光強度與濃度在1.0～30mM范圍內(nèi)的葡萄糖呈線性相關(guān)。相比游離酶GOx/CPO，溶膠-凝膠包埋酶的檢測靈敏度較高，該研究方法可用于某些飲料中葡萄糖的分析。Campbell Alan S.等[7]以GOx為工作酶、與CPO共固定在羧基功能化的多壁碳納米管（MWNT）上，通過GOx酶促反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2可以進一步作為底物被共固定化的CPO轉(zhuǎn)化為HOCl。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPO-MWNT-GOx（CPO共價、GOx吸附）雙酶反應(yīng)體系中HOCl的速率明顯大于GOx-MWNT-CPO（GOx共價、CPO吸附）雙酶反應(yīng)體系。該雙酶體系設(shè)計根據(jù)特定功能將給定的酶排列到相同的納米載體上，使其在納米生物界面上的連續(xù)酶促反應(yīng)成為生物傳感器應(yīng)用的可行性。

許多工業(yè)生產(chǎn)過程可以是由兩種或兩種以上的酶以級聯(lián)方式協(xié)同工作來催化，但設(shè)計高效的酶級聯(lián)反應(yīng)仍然是一個挑戰(zhàn)。2000年，Velde Fred van de等[8]在聚氨酯薄膜上通過共價鍵與載體相連實現(xiàn)CPO和GOx的共固定，并通過GOx氧化葡萄糖產(chǎn)生的H2O2作氧化劑、CPO做催化劑進行光學(xué)異構(gòu)性反應(yīng)苯硫基甲烷磺化氧化。固定酶的操作穩(wěn)定性較好，催化氧化轉(zhuǎn)化率達到100%，e.e.值達99%。Jung Dirk等[9]將GOx和CPO的交聯(lián)酶聚集體分別固定于大孔-介孔材料MCF中，并通過GOx氧化葡萄糖在線產(chǎn)生的H2O2實現(xiàn)吲哚的氧化反應(yīng)（在CPO催化下）。在固定床反應(yīng)器中，進行的連續(xù)操作條件下的催化試驗證實，與MCF或SBA-15孔中物理吸附的酶相比，在MCF中的交聯(lián)酶不易泄漏。通過調(diào)控十六烷基三甲基溴化銨的用量合成的具有介孔結(jié)構(gòu)的TiO2薄膜，依據(jù)CPO和GOx不同分子大小合理設(shè)計孔徑尺寸以形成有序的“占位”效應(yīng)，可以抑制酶的聚集，避免酶活性的降低[10]。當CPO和GOx共同固定在同一載體上時，與等摩爾的游離酶混合物相比，初始催化效率提高了4倍。此外，根據(jù)動力學(xué)分析，酶對底物結(jié)合的親和力得到了提高。與游離酶相比，TiO2-GOx和CPO復(fù)合材料的熱穩(wěn)定性有了很大提高。TiO2-GOx和CPO復(fù)合材料可以很容易地從反應(yīng)介質(zhì)中分離出來，這有助于其循環(huán)使用。這種高效的固定化雙酶對于固定床酶連續(xù)反應(yīng)操作是一個很有前景的策略，可用于進一步評估預(yù)期的工業(yè)應(yīng)用。

2 葡萄糖氧化酶與辣根過氧化物酶的共固定化

目前，實現(xiàn)活性固定化多酶生物催化劑在體外進行多步級聯(lián)反應(yīng)的實現(xiàn)是一個極具挑戰(zhàn)性的課題。Pitzalis Federica等[11]以3-氨丙基三乙氧基硅烷功能化SBA-15材料為載體，用戊二醛共價法共固定化GOx和辣根過氧化物酶（HRP）。共固定化雙酶體系中，GOx氧化葡萄糖產(chǎn)生H2O2，用HRP催化氧化ABTS反應(yīng)。無論采用何種固定化策略，結(jié)果表明，只有保持固定化的雙酶生物催化劑保持濕潤，才能保持催化活性。濕潤的HRP@SBA-15和干燥的GOx@SBA-15在循環(huán)使用6次后活性損失較高，濕潤的GOx/HRP@SBA-15生物催化劑可循環(huán)使用14次仍保持良好的催化活性。用雙酶生物催化劑對農(nóng)業(yè)廢水中的兩種酚類污染物（咖啡酸和阿魏酸）進行了氧化試驗，生物催化劑在15min內(nèi)轉(zhuǎn)化率可達70%。

Ahmad Raneem等[12]將GOx和HRP共固定化于金屬有機物骨架（MOF）UiO-66和UiO-66-NH2，并用于鄰苯三酚的氧化反應(yīng)。選擇兩種MOF作為固定化酶載體，主要研究MOF連接體的修飾如何影響酶/MOF界面的穩(wěn)定性和酶體系的后續(xù)活性。結(jié)果顯示，兩種酶/MOF體系的催化活性增強，表明金屬有機骨架固定化酶可以提高協(xié)同體系反應(yīng)活性。與HRP/GOx@UiO-66相比，在HRP/GOx@UiO-66-NH2中的偶聯(lián)劑功能化提高了酶的固載量、活性和穩(wěn)定性。酶固載量和穩(wěn)定性的增加可能是由于胺基增加了MOF表面的靜電吸引力。這項研究從結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系分析，為更好地設(shè)計生物催化劑提供了理論研究基礎(chǔ)。

將GOx和HRP雙酶被包埋在聚乙烯亞胺（PEI）中，然后固定于碳納米管和芘硼酸組成的基底上[13]。這種結(jié)構(gòu)被認為是葡萄糖生物燃料電池（GBFC）的陰極催化劑。通過對催化劑性能的評價，發(fā)現(xiàn)PEI中的雙酶包埋良好，基底通過形成π-π堆積和縮短電子轉(zhuǎn)移路徑來促進電子轉(zhuǎn)移，從而提高了氧還原反應(yīng)的催化活性。當采用該催化劑操作膜GBFC時，可獲得較高的功率密度、良好的儲存穩(wěn)定性和較高的葡萄糖消耗率。可見，雙基底共固定化酶陰極催化劑對提高GBFC的催化活性和性能起到了主導(dǎo)作用，而且GOx-HRP-PEI的復(fù)雜結(jié)構(gòu)防止了酶分子的變性。

Alim Samiul等[14]報道了一種新型的葡萄糖生物傳感器，該傳感器將GOx和HRP與SnO2聚合多孔納米纖維共同固定在殼聚糖玻碳電極上。以具有高比表面積和良好導(dǎo)電性的錫前驅(qū)體為原料，采用靜電紡絲法制備了SnO2多孔納米纖維，并與聚苯胺進行了聚合。聚合后的納米纖維在促進固定化酶的電活性中心與電極表面之間的直接電子轉(zhuǎn)移方面起著重要作用。所制備的生物傳感器的安培響應(yīng)與葡萄糖濃度呈長程線性關(guān)系，而且生物傳感器響應(yīng)速度快、檢測限低、具有長期穩(wěn)定性和重復(fù)性。聚合的多孔納米纖維SnO2有望成為生物傳感器中一種很有前景的納米材料。通過將GOx和HRP共固定在Ketjen Black修飾電極上，Xia Hongqi[15]等構(gòu)建了一個雙酶電極，將GOx的氧化酶反應(yīng)與HRP作用下的H2O2的直接電子轉(zhuǎn)移型生物電催化還原耦合起來，葡萄糖的安培檢測靈敏度高、檢測限低，而且對于生物燃料電池中的生物陰極，固定化雙酶非常具有優(yōu)勢。

可穿戴電化學(xué)生物傳感器以非侵入性的方式測量生物流體中生物化學(xué)小分子的濃度，仍然是人們迫切需要的。Xia Hongqi等[16]利用導(dǎo)電柔性碳納米管-乙烯-醋酸乙烯酯薄膜的層狀結(jié)構(gòu)，在酶電極界面成功地實現(xiàn)了HRP的直接電子轉(zhuǎn)移。通過將GOx和HRP共同固定在這種多孔CNT-EVA薄膜上，進一步制備了具有（270±10）μA·（mM·cm2）-1超高靈敏度的無介質(zhì)可穿戴葡萄糖生物傳感器。由于其高導(dǎo)電性和與皮膚的良好相容性，因此，具有較高的信號背景靈敏度。實驗結(jié)果表明，該傳感器能夠同時監(jiān)測汗液葡萄糖和表面肌電信號，為今后健康監(jiān)測、早期診斷和臨床研究提供多種生理信號。

3 葡萄糖氧化酶與其他酶的共固定化

張柳[17]以Cu3（PO4）2為無機組份，通過結(jié)合GOx的催化專一性和脂肪酶的催化非專一性，構(gòu)建了一種GOx和脂肪酶雙酶納米花共固定化酶，并將固定化雙酶用于催化烯烴類化合物環(huán)氧化反應(yīng)。由于納米花這種特殊的固定化酶方式，GOx和脂肪酶雙酶負載率可達100%。與游離雙酶相比，納米花共固定化雙酶具有更高的催化活性、穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性。

惠明等[18]制備出一種HNO3-H2SO4法改性的碳纖維（CF）優(yōu)良固定化酶載體，并用于共固定化GOx和過氧化氫酶（CAT）。雙酶配比GOx∶CAT活力比1∶2、戊二醛交聯(lián)劑體積分數(shù)0.2%、交聯(lián)時間15min，固定化雙酶的酶活回收率為30.6%。固定化酶的性能如熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、貯藏穩(wěn)定性等均有顯著提高。重復(fù)使用性方面，連續(xù)使用10次后固定化酶殘留酶活為初始酶活的72.4%。該研究反應(yīng)條件溫和，為固定酶生產(chǎn)葡萄糖酸鹽工業(yè)應(yīng)用提供了新思路。

Long Jie[19]采用溶膠-凝膠包埋法對GOx和β-呋喃果糖苷酶進行了共固定化，并對其后續(xù)的蔗糖生產(chǎn)效率進行了研究。共固定化后，酶活力保持85.39%，且固定化雙酶具有良好的操作穩(wěn)定性，連續(xù)重復(fù)使用15次后，其初始活性保持在78.5%以上。在優(yōu)化的條件下，固定化雙酶法合成的蔗糖收率提高到160.8g·L-1，比文獻報道的要高。溶膠-凝膠共固定化GOx和β-呋喃果糖苷酶具有穩(wěn)定性高、可重復(fù)使用等優(yōu)點，在連續(xù)蔗糖生產(chǎn)中顯示出巨大的工業(yè)應(yīng)用潛力。

4 展望

共固定化雙酶反應(yīng)體系以實現(xiàn)偶聯(lián)反應(yīng)為契機，可以根據(jù)固定化雙酶的催化性能和分子結(jié)構(gòu)等特點，設(shè)計固定高效、性能穩(wěn)定、協(xié)同催化的固定化雙酶載體，以期達到精準共固定化葡萄糖氧化酶和其他酶。此外，共固定化葡萄糖氧化酶的工藝技術(shù)也需進一步優(yōu)化，以擴大固定化雙酶的應(yīng)用領(lǐng)域。