高寒地區(qū)栽培牧草化感效應(yīng)緩解初探

全小龍, 陳夢(mèng)詞, 段中華, 梁 軍, 喬有明

(青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青海 西寧 810016)

世界上眾多草原類型的生態(tài)學(xué)過程均被證明受到化感效應(yīng)的調(diào)控?；行?yīng)會(huì)對(duì)草地群落的結(jié)構(gòu)和功能，如群落的物種組成和群落的演替過程產(chǎn)生影響[1-2]。國(guó)內(nèi)外對(duì)此開展了大量的研究，如張寶琛等[3]開展了化感效應(yīng)對(duì)高寒草甸群落演替過程的影響研究，結(jié)果表明垂穗披堿草的化感效應(yīng)抑制了自身的種子萌發(fā)，卻促進(jìn)了細(xì)葉亞菊(Ajaniatenuifolia)的種子萌發(fā)，而細(xì)葉亞菊的化感效應(yīng)則抑制了垂穗披堿草的種子萌發(fā)，這種化感效應(yīng)的不同使細(xì)葉亞菊在退化高寒草甸占據(jù)了群落的優(yōu)勢(shì)地位。Greer等[4]的溫室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明入侵植物白羊草(Bothriochloaischaemum)通過抑制本土植物的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)而在北美中南部草原成功占據(jù)生態(tài)位。羅馬尼亞低地草原的研究結(jié)果也表明美麗針茅(Stipapulcherrima)占據(jù)群落優(yōu)勢(shì)地位的原因之一在于其釋放的化感物質(zhì)強(qiáng)烈地抑制了群落中其他物種的幼苗更新[5]。假高粱(Sorghumhalepense)通過分泌化感物質(zhì)抑制北美高草草原群落優(yōu)勢(shì)種北美小須芒草(Schizachyriumscuparium)的生長(zhǎng)和繁殖過程，促使其成功入侵北美高草草原并占據(jù)群落優(yōu)勢(shì)地位[6]。

化感效應(yīng)不僅存在于植物之間，也涉及植物與微生物間的相互作用。土壤微生物參與養(yǎng)分循環(huán)及植物競(jìng)爭(zhēng)，影響物質(zhì)分解，是植物化感效應(yīng)重要的決定因子[7-8]。當(dāng)毒雜草入侵健康草地時(shí)，向土壤中釋放化感物質(zhì)，破壞土壤穩(wěn)定性，降低土壤活力，加速有害物質(zhì)的積累，抑制土壤酶及微生物活性，造成病原體及害蟲等有害生物大量發(fā)生，導(dǎo)致土壤的微生物區(qū)系發(fā)生變化，土壤微生物與土壤因子的自然平衡遭到損壞，形成養(yǎng)分分解和供應(yīng)障礙，加劇土壤病害蔓延[9-10]。土壤中微生物通過以代謝、降解與利用等方式改變化感物質(zhì)，同時(shí)根系通過分泌各種次生代謝物質(zhì)對(duì)根際微生物的種類、數(shù)量和分布產(chǎn)生影響[11]。沒有微生物存在下的化感物質(zhì)活性的評(píng)價(jià)可能不具有生態(tài)相關(guān)性。因此，植物化感效應(yīng)機(jī)制的深入研究必須建立在充分了解化感物質(zhì)與微生物互作關(guān)系的基礎(chǔ)上，驗(yàn)證生物入侵中化感效應(yīng)時(shí)有必要考慮土壤微生物的影響[12-13]，才能使后續(xù)的研究更有意義。

草地生態(tài)系統(tǒng)化感效應(yīng)的研究集中在化感效應(yīng)的識(shí)別、化感效應(yīng)對(duì)受體植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的室內(nèi)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)及化感物質(zhì)的分離和鑒定等方面[3-6,9]，對(duì)于微生物對(duì)化感效應(yīng)的緩解研究還未見報(bào)道。鑒于此，本研究以青藏高原常見毒雜黃帚橐吾(Ligulariavirgaurea)、甘肅馬先蒿(Pediculariskansuensis)和細(xì)葉亞菊集中分布區(qū)域土壤為化感物質(zhì)來源，以冷地早熟禾(Poacrymophila)和垂穗披堿草(Elymusnutans)生長(zhǎng)旺盛區(qū)域土壤為優(yōu)良牧草生長(zhǎng)基質(zhì)，測(cè)定種子發(fā)芽率及幼苗生長(zhǎng)狀況，研究土壤微生物對(duì)化感物質(zhì)作用效果的緩解潛力。將化感物質(zhì)的微生物降解研究納入化感效應(yīng)的生物測(cè)定中，把化感效應(yīng)和土壤因素結(jié)合起來，以期結(jié)果更能反映實(shí)際情況，揭示人工植被退化現(xiàn)象背后的本質(zhì)，為高寒地區(qū)退化草地的恢復(fù)、重建，以及管理和新技術(shù)研發(fā)提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究土壤樣品于2020年9月下旬在青海省黃南藏族自治州河南蒙古族自治縣(34°41′N,101°46′E)采集。采集地屬于典型的高寒草甸型草地，土壤類型以黑鈣土為主，主要優(yōu)勢(shì)種為冷地早熟禾和垂穗披堿草，伴生有鵝絨委陵菜(Potentillaanserina)、矮嵩草(Kobresiahumilis)、瓣蕊唐松草(Thalictrumpetaloideum)、金露梅(Potentillafruticosa)和高原毛茛(Ranunculustanguticus)等，零散分布有黃帚橐吾、甘肅馬先蒿和細(xì)葉亞菊等。選擇毒雜草相對(duì)分布集中的區(qū)域土壤制備水浸液，以模擬自然條件下化感物質(zhì)進(jìn)入環(huán)境的方式，采集時(shí)用直徑為3.5 cm的土鉆，取10 cm上層土壤，裝入自封袋中，記為土壤A低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室備用。為保存維持優(yōu)良牧草正常生長(zhǎng)的原有微生物，選擇冷地早熟禾和垂穗披堿草生長(zhǎng)旺盛區(qū)域，將所有土樣混合后分裝標(biāo)記為土壤B放入-18℃冰箱，帶回實(shí)驗(yàn)室用于準(zhǔn)備發(fā)芽與生長(zhǎng)基質(zhì)。供試土壤信息如表1所示。

表1 供試土壤基本信息Table 1 Main chemical properties of the soil tested

2019年8月下旬種子收獲時(shí)期，于青海省牧草良種繁殖場(chǎng)(海南藏族自治州同德縣；35°15′N,100°38′E)采集供試牧草種子，種子經(jīng)干燥、清選后，裝入種子袋低溫保存?zhèn)溆谩７N子信息如表2所示。

表2 供試牧草種子基本信息Table 2 Forage seeds for testing

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

土壤A去除殘根及雜質(zhì)后制備水浸液，用于澆灌噴施基質(zhì)。按照新鮮土壤與蒸餾水(質(zhì)量比) 1∶2比例，20℃溫度下以200r·min-1在旋轉(zhuǎn)搖床中震蕩24 h制備根土水浸液。所得土壤水溶液分別通過定性濾紙和0.45 μm水系濾膜過濾，獲得每毫升含0.5 g土壤中化感物質(zhì)的水浸液，分裝試劑瓶后4℃保存待用。

將土壤B過2 mm篩后，分成兩部分，一部分在高壓滅菌鍋115℃下20 min，滅菌1次，記為SS；另一份不滅菌，放入光照培養(yǎng)箱中發(fā)芽10 d，去除土壤種子庫(kù)種子，并保留原有微生物，記為US。將未滅菌土與滅菌土按U100(100%US)，U75(75%US +25%SS)，U50(50%US +50%SS)，U25(25%US +75%SS)和U0(100%SS)比例配制種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)基質(zhì)，每盆使用土壤200 g，將U0即完全滅菌土壤作為對(duì)照(CK)。

種子發(fā)芽試驗(yàn)中，將供試種子在0.5%次氯酸鈉溶液中浸泡10 min，并用蒸餾水沖洗，完成種子表面消毒。每盆挑選籽粒飽滿的供試種子50粒，放入裝有基質(zhì)的小花盆中，輕翻基質(zhì)，使種子完全覆在基質(zhì)中，按照未滅菌土與滅菌土配比設(shè)置，設(shè)5個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)5次重復(fù)，每種牧草計(jì)25盆，5種供試牧草總計(jì)125盆。幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)中，按照種子發(fā)芽試驗(yàn)要求先進(jìn)行種子預(yù)發(fā)芽，待種子發(fā)芽5 d后，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移栽至小花盆中，每盆移植10株，3盆作為一個(gè)重復(fù)；同樣設(shè)U100，U75，U50，U25和U0共5個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每種牧草計(jì)45盆，5種供試牧草總計(jì)225盆。在光周期為12 h/12 h，溫度為 20℃/16℃，光照為3 000 lx的培養(yǎng)箱中進(jìn)行試驗(yàn)，每盆每隔兩日澆化感物質(zhì)水浸液20 mL，如遇干旱則噴灑蒸餾水保持土壤潤(rùn)濕。發(fā)芽試驗(yàn)連續(xù)記錄15 d，以胚芽超出基質(zhì)作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，記錄后去除已發(fā)芽種子。幼苗生長(zhǎng)數(shù)據(jù)測(cè)定在移植生長(zhǎng)15 d后進(jìn)行，將植物幼苗從小花盆中取出，洗凈根部附著的基質(zhì)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取10株測(cè)量根長(zhǎng)(Root length,RL;單位：cm)和苗高(Shoot length,SL;單位：cm)。測(cè)量后將10株植株裝入紙袋，于65℃下烘干至恒重，稱重獲得10株植株干重(Dry weight,DW;單位：mg)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

種子發(fā)芽率(Germination percentage，GP)、化感效應(yīng)指數(shù)(Allelopathic response index，RI)和綜合促進(jìn)率(Comprehensive effect promotion rate，CE)按照以下公式計(jì)算：

CE(%)=
RI(%)GP+RI(%)RL+RI(%)SL+RI(%)DW

其中，下標(biāo)GP，RL，SL和DW依次代表發(fā)芽率(%)、根長(zhǎng)(cm)、苗高(cm)和干重(mg)相對(duì)應(yīng)的數(shù)值，CE(%)的絕對(duì)值大小表示綜合促進(jìn)率的強(qiáng)弱。

采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著性差異法(LSD)比較不同處理間差異顯著性。SPSS 21.0(SPSS Inc.,Chicago,Illinois,USA)進(jìn)行方差分析，Origin 2018(OriginLab Inc.,Northampton,Massachusetts,USA)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基質(zhì)組成對(duì)種子發(fā)芽的影響

土壤微生物調(diào)節(jié)下的種子發(fā)芽率如圖1所示，5種栽培牧草種子發(fā)芽率表現(xiàn)出隨滅菌土壤量的增加而逐漸降低趨勢(shì)。垂穗披堿草種子發(fā)芽率在U100，U75，U50和U25處理下無顯著性差異，但這四種處理與U0存在顯著性差異(P<0.05)。與U100相比，在U0處理下老芒麥和中華羊茅受到抑制，且與U100差異顯著(P<0.05)，但這兩種處理與U75，U50和U25處理間差異不顯著。草地早熟禾和冷地早熟禾種子發(fā)芽率在5種處理間無顯著性差異，但也呈現(xiàn)出隨未滅菌土壤的減少而降低的趨勢(shì)。

圖1 土壤微生物量影響下的種子發(fā)芽率Fig.1 Germination percentage of tested grass following microbial biomass注：同族不同小寫字母表示不同微生物量U100，U75，U50，U25和U0之間差異顯著(P<0.05)，下同Note:Difference lowercase letters indicate significant difference among treatments in the same grass at 0.05 level,the same as below

2.2 不同基質(zhì)組成對(duì)幼苗苗高的影響

微生物對(duì)栽培牧草幼苗苗高的影響與其對(duì)發(fā)芽率影響趨勢(shì)相似，幼苗苗高隨滅菌土壤量的增加而逐漸降低(圖2)。在U100和U0處理下，垂穗披堿草幼苗苗高表現(xiàn)為差異顯著(P<0.05)，但二者與U75，U50和U25處理間差異不顯著。老芒麥在U100，U75，U50，U25處理間幼苗苗高未表現(xiàn)出顯著差異，而U100，U75與U0差異顯著(P<0.05)。中華羊茅、草地早熟禾和冷地早熟禾幼苗苗高在各組間無顯著性差異。

圖2 土壤微生物影響下幼苗苗高Fig.2 Shoot length of tested grass following microbial biomass

2.3 不同基質(zhì)組成物對(duì)幼苗根長(zhǎng)的影響

土壤微生物對(duì)幼苗根長(zhǎng)的影響表現(xiàn)如圖3所示，在不同土壤微生物影響下不同的牧草表現(xiàn)出一定的差異。垂穗披堿草和冷地早熟禾幼苗根長(zhǎng)變化相似，U25和U0處理間差異不顯著，但與U100處理差異顯著(P<0.05)；而三者與U75和U50處理間差異不顯著。老芒麥和中華羊茅幼苗根長(zhǎng)均表現(xiàn)為U100與其余4組處理間差異顯著(P<0.05)，而其他4組處理之間無顯著性差異。在U100和U0處理下，草地早熟禾幼苗根長(zhǎng)為差異顯著(P<0.05)，但二者與U75，U50和U25間差異不顯著。

圖3 土壤微生物影響下的幼苗根長(zhǎng)Fig.3 Root length of tested grass following microbial biomass

2.4 不同基質(zhì)組成對(duì)幼苗干重的影響

微生物量對(duì)栽培牧草幼苗干重的影響因栽培牧草的不同和處理的差異而表現(xiàn)出不同的變化(圖4)。垂穗披堿草干重在U25和U0處理間差異不顯著，但與U100處理差異顯著(P<0.05)；而三者與U75和U50處理間差異不顯著。老芒麥在U25處理下與其4組無顯著性差異，U100，U75和U50處理間無顯著差異，但同U0間呈顯著性差異(P<0.05)。中華羊茅和草地早熟禾干重受抑制，在U100和U0處理下間差異顯著(P<0.05)，但這兩種處理與U75，U50和U25處理間差異不顯著。冷地早熟禾在U100和U75處理下干重未表現(xiàn)出顯著差異，但與U0差異顯著(P<0.05)。

圖4 土壤微生物影響下的幼苗干重Fig.4 Dry weight of grasses following microbial biomass and fertility

2.5 不同基質(zhì)組成對(duì)栽培牧草的綜合影響

比較未滅菌土壤和滅菌土壤對(duì)栽培牧草的綜合影響，如圖5所示，微生物對(duì)栽培牧草發(fā)芽和生長(zhǎng)的影響因栽培牧草的不同而存在差異。在種子發(fā)芽階段，微生物對(duì)中華羊茅種子發(fā)芽率促進(jìn)作用最為明顯為7.69%，其后依次為垂穗披堿草(7.02%)、冷地早熟禾(5.59%)、老芒麥(5.08%)和草地早熟禾(4.35%)。在生長(zhǎng)階段，微生物對(duì)5種栽培牧草苗高綜合促進(jìn)率平均為9.61%，其中促進(jìn)率最高值為垂穗披堿草11.92%，最低值為中華羊茅8.06%。微生物對(duì)草地早熟禾幼苗根長(zhǎng)的促進(jìn)率高達(dá)16.02%，而對(duì)老芒麥的促進(jìn)率僅為6.13%。在幼苗干重方面促進(jìn)作用差異更為明顯，最高綜合促進(jìn)率的草地早熟禾(17.14%)與中華羊茅(16.58%)，約為老芒麥(3.98%)4倍。

圖5 土壤微生物對(duì)栽培牧草種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的綜合效應(yīng)Fig.5 Comprehensive effects of microbial levels on grass germination and growth

3 討論

土壤微生物量是存在于土壤環(huán)境中對(duì)環(huán)境的變化比較敏感的指標(biāo)，是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。土壤微生物種類繁多，數(shù)量龐大，不僅在土壤發(fā)育形成、基本物質(zhì)循環(huán)和土壤肥力演變中扮演著重要角色，還影響著生態(tài)系統(tǒng)的功能完整性[14]。微生物通過自身代謝活動(dòng)，分泌有機(jī)酸等物質(zhì)黏結(jié)土壤粒子組成土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，促進(jìn)土壤的形成和發(fā)育；部分代謝產(chǎn)物能促進(jìn)礦物質(zhì)分解，以助植物吸收利用[15-17]。研究顯示，土壤微生物量與土壤健康狀況密切相關(guān)，也能指示草地生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)能力強(qiáng)弱，當(dāng)土壤微生物量下降時(shí)，表明土壤微生物活性降低，土壤出現(xiàn)一定程度的退化[18-20]。

本研究中，以U100，U75，U50和U25為基質(zhì)的5種栽培牧草種子發(fā)芽率均高于U0，且隨基質(zhì)中微生物的減少而有類似的遞減規(guī)律，雖對(duì)不同物種的影響存在差異，但也證明了微生物量的增加提高了種子發(fā)芽率。這與Rudgers and Orr研究高羊茅及其內(nèi)生真菌通過土壤中的化學(xué)或生物變化影響樹苗生長(zhǎng)的結(jié)果類似[21]，以及Zhu等人[22]對(duì)土壤生物區(qū)系降低了入侵紫莖澤蘭的化感效應(yīng)的研究結(jié)果一致，均表明土壤微生物具有減輕化感效應(yīng)的重要作用。高小寬等[23]對(duì)禾本科植物小麥的研究表明，根際微生物可有效加快小麥種子的萌發(fā)速度，提高種子的發(fā)芽率結(jié)果也與本研究一致。土壤微生物分解動(dòng)植物殘?bào)w等有機(jī)質(zhì)形成腐殖質(zhì)，改善土壤的結(jié)構(gòu)和耕性，釋放營(yíng)養(yǎng)元素供給植物吸收利用[24-26]。同時(shí)，殘?bào)w分解也伴隨著化感物質(zhì)在土壤中的遷移、轉(zhuǎn)化，進(jìn)入土壤中的化感物質(zhì)，由于溫度、水分、養(yǎng)分等因素與微生物的種類和數(shù)量密切相關(guān)，因此有的化感物質(zhì)可被微生物分解而失活[27]。本研究中，微生物對(duì)種子發(fā)芽率促進(jìn)可能與其分泌的一些激素等有利于種子萌發(fā)的生物活性物質(zhì)有關(guān)；另外，也可能是土壤微生物消耗有機(jī)分子，使化感物質(zhì)不能積累到植物毒性水平，因而受體植物在自然情況下不表現(xiàn)出任何化感效應(yīng)，但究其具體原因還有待于進(jìn)一步研究。

比較U100，U75，U50，U25和U0基質(zhì)下幼苗的生長(zhǎng)狀況，結(jié)果顯示垂穗披堿草、老芒麥和中華羊茅幼苗苗高隨土壤微生物含量的增加而增加，但對(duì)于兩種早熟禾的影響不明顯。這應(yīng)該與幼苗的大小存在聯(lián)系，5種栽培牧草生長(zhǎng)時(shí)間一致，但早熟禾因種子小，出苗時(shí)根與芽生長(zhǎng)相對(duì)較小，在初期生長(zhǎng)階段受微生物的促進(jìn)影響較弱，尚未表現(xiàn)出明顯性狀。研究表明，土壤微生物多樣性越豐富，更適合于植物根系的生長(zhǎng)[28-29]。本研究顯示，在U100處理下，5種栽培牧草幼苗的根長(zhǎng)均高于其他處理組，證明在幼苗生長(zhǎng)階段土壤微生物的多樣性與生物量對(duì)根系生長(zhǎng)至關(guān)重要。對(duì)比以U75，U50，U25和U0為基質(zhì)的實(shí)驗(yàn)組，發(fā)現(xiàn)它們之間變異較小，說明完整的土壤微生物組成更能有效促進(jìn)幼苗根長(zhǎng)。在植物生長(zhǎng)過程中，根系分泌物向土壤微生物提供大量的營(yíng)養(yǎng)與碳源，影響微生物群落結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生有利于種子發(fā)芽和植物生長(zhǎng)的生物活性物質(zhì)，提高了種子發(fā)芽率并促進(jìn)了幼苗生長(zhǎng)[30-31]。本研究中，垂穗披堿草、老芒麥和中華羊茅幼苗干重的變化趨勢(shì)同幼苗苗高一致，幼苗干重可能受幼苗苗高影響更為突出。這可能是垂穗披堿草、老芒麥和中華羊茅種子，種子萌發(fā)時(shí)胚乳營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備充裕，滿足了萌發(fā)后幼苗快速生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求。

種子的萌芽測(cè)試因方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，易于控制，成為化感潛力分析中最重要和最廣泛的方法之一。幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)是對(duì)受體幼苗生長(zhǎng)和發(fā)育指標(biāo)的測(cè)定，通常以根長(zhǎng)、苗高、干鮮重等指標(biāo)來判斷化感效應(yīng)。一般認(rèn)為，幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)比種子萌芽測(cè)試更為敏感，化感潛力是研究化感效應(yīng)不可缺少的部分，種子萌發(fā)測(cè)試和幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)是最常見的化感潛力分析方法[32]。綜合對(duì)比研究結(jié)果，基質(zhì)對(duì)5種栽培牧草的平均促進(jìn)率為38.72%，其中對(duì)冷地早熟禾、中華羊茅與草地早熟禾的促進(jìn)作用較大，依次為46.74%，46.56%和45.49%，且主要表現(xiàn)在根系生長(zhǎng)和幼苗干重方面。對(duì)垂穗披堿草和老芒麥，兩種披堿草屬的栽培牧草相對(duì)較小，這可能與物種的進(jìn)化史有關(guān)。

4 結(jié)論

以U100，U75，U50，U25 和U0為基質(zhì)的5種栽培牧草種子發(fā)芽率呈逐漸降低趨勢(shì)，土壤微生物能緩解化感效應(yīng)提高種子發(fā)芽率，但對(duì)不同物種的影響存在差異。比較U100，U75，U50，U25和U0處理下幼苗苗高的生長(zhǎng)狀況，結(jié)果顯示垂穗披堿草、老芒麥和中華羊茅幼苗苗高隨土壤微生物含量的增加而增加，但對(duì)于兩種早熟禾的影響不明顯。在U100處理下，5種栽培牧草幼苗的根長(zhǎng)均高于其他處理，表明在幼苗生長(zhǎng)階段土壤微生物對(duì)根系生長(zhǎng)至關(guān)重要。幼苗干重的變化趨勢(shì)同幼苗苗高相似，可能受幼苗苗高影響更為突出?；|(zhì)的微生物對(duì)冷地早熟禾、中華羊茅與草地早熟禾的促進(jìn)作用較大，依次為46.74%，46.56%和45.49%，且主要表現(xiàn)在根系生長(zhǎng)和幼苗干重方面。