60Co-γ射線輻照對粉黛亂子草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

姜恒越, 高毓翎, 李媚晴, 陳志龍, 莊黎麗, 楊志民, 張夏香

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 江蘇 南京 210095)

輻射誘變育種是利用γ射線、β射線、X射線、中子、紫外線、激光等物理誘變源，誘發(fā)植物DNA變異和染色體畸變，引起植物形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化等多方面的變異，從而創(chuàng)制新種質(zhì)的方法[1-4]。其中，γ射線因其穿透力好、成本低、突變率高、變異范圍廣等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于作物、園藝以及林木育種，已成為改良農(nóng)業(yè)新品種的重要途徑之一[5-7]。目前，輻射誘變育種工作面臨的最主要問題是最佳輻照劑量的選擇，不同的植物種類、同種植物的不同品種、同一植物的不同發(fā)育階段及不同器官的最佳輻照劑量均存在顯著差異，選擇合適的輻射劑量是保證輻射誘變育種效率的重要前提[8-10]。

粉黛亂子草(Muhlenbergiacapillaris(Lam.) Trin.)，又名毛芒亂子草，為禾本科(Gramineae)亂子草屬植物，是一種多年生暖季型觀賞草，其圓錐花序龐大、繁密，花期長，粉紫色花穗如發(fā)絲從基部長出，遠(yuǎn)看如紅色云霧，花群顏色美觀、質(zhì)地獨特，目前被廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外園林景觀，打造特色花境[11]。粉黛亂子草自然分布于美國中西部，生長于草地、荒原或開闊林地的沙礫土壤中，喜光、耐半陰、耐干旱、耐鹽堿，且具有抗病性強、維護(hù)成本低的特性[12]。目前，國內(nèi)外粉黛亂子草品種單一，針對粉黛亂子草的研究也主要集中于園林應(yīng)用、鑒定評價以及養(yǎng)護(hù)管理技術(shù)等方面[13-17]，關(guān)于粉黛亂子草新品種選育進(jìn)展甚緩，無法滿足日益增加的粉黛亂子草市場需求。因此，探索60Co-γ射線輻射誘變對粉黛亂子草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，可為粉黛亂子草輻射誘變育種提供理論參考。本研究采用粉黛亂子草干種子為實驗材料，設(shè)置5個不同輻射劑量處理，測定種子萌發(fā)及幼苗生長相關(guān)指標(biāo)，為粉黛亂子草輻射誘變新種質(zhì)創(chuàng)制提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以粉黛亂子草‘粉黛’品種為材料，由北京市農(nóng)林科學(xué)院草業(yè)花卉與景觀生態(tài)研究所提供，種子于11月底收獲后經(jīng)自然風(fēng)干、脫粒，選用紙信封盛裝，儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗設(shè)計與處理

1.2.160Co-γ射線輻照 利用南京航空航天大學(xué)輻照中心60Co-γ射線源，對挑選出的完整飽滿的粉黛亂子草干種子(種子含水量約為10%)進(jìn)行輻照處理，設(shè)置5個劑量梯度，分別為100,200,300,400和500 Gy，輻射劑量率為1.08 Gy·min-1，以未經(jīng)輻照的種子為對照。

1.2.1發(fā)芽試驗 選取各輻射劑量處理與對照處理過的粉黛亂子草種子各400粒，每個劑量4個重復(fù)，每個重復(fù)100粒種子，蒸餾水浸泡24 h后，用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒30 s，蒸餾水沖洗3次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的次氯酸鈉溶液消毒20 min，蒸餾水沖洗3次。將消毒后的種子置于鋪有一層濾紙的培養(yǎng)皿中，在人工氣候室中培養(yǎng)，胚芽長度達(dá)到種子長度一半時視為發(fā)芽。人工氣候室環(huán)境條件設(shè)置為：晝夜溫度為23℃/20℃，晝夜周期為14 h/10 h，相對濕度控制在70%，光照強度為300 μmol·m-2·s-1。每天固定時間采用稱重法進(jìn)行補水，計數(shù)種子發(fā)芽情況。于第10天計算種子發(fā)芽勢，第21天萌發(fā)實驗結(jié)束時計算種子的發(fā)芽率。于發(fā)芽試驗最后一天，使用游標(biāo)卡尺測量胚軸至胚芽尖端、胚軸至胚根尖端的長度，精確到0.01 cm，分別記作胚芽長、胚根長。計算方法如下：

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)，Gt指時間t的種子發(fā)芽數(shù)，Dt指相應(yīng)的發(fā)芽試驗天數(shù)。

1.2.2幼苗試驗 發(fā)芽試驗結(jié)束后，選取每個輻射劑量處理具有代表性的幼苗，采用96孔植物水培盒于人工氣候室進(jìn)行水培培養(yǎng)，晝夜溫度為23℃/20℃，晝夜周期為14 h/10 h，相對濕度控制在70%，光照強度為650 μmol·m-2·s-1；先以1/8標(biāo)準(zhǔn)濃度的Hoagland植物水培營養(yǎng)液[18]緩苗一周后，采用1/4標(biāo)準(zhǔn)濃度的Hoagland植物水培營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。每周使用游標(biāo)卡尺測量幼苗的株高及根長。

植物水培盒培養(yǎng)三周后，轉(zhuǎn)入周轉(zhuǎn)箱繼續(xù)進(jìn)行六周的水培培養(yǎng)，采用1/2標(biāo)準(zhǔn)濃度的Hoagland植物水培營養(yǎng)液培養(yǎng)，人工氣候室培養(yǎng)條件不變。每周測量植株株高、葉寬、分蘗數(shù)、總?cè)~數(shù)、綠葉數(shù)及根長。

1.3 根系形態(tài)指標(biāo)測定

水培培養(yǎng)最后一天(苗齡91天)時，將各輻射劑量處理與對照處理具有代表性的粉黛亂子草植株根系洗凈后，用掃描儀(EPSON，12000XL，日本)掃描根系，使用WinRHIZO軟件(V5.0，加拿大)進(jìn)行根系形態(tài)指標(biāo)分析，分析指標(biāo)包括：總根長(cm)、根表面積(cm2)、根體積(cm3)及根平均直徑(mm)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

為了綜合評價不同輻射劑量對粉黛亂子草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，本研究運用隸屬函數(shù)法對各處理下粉黛亂子草的形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，計算公式：y=(xa-xmin)/(xmax-xmin)，其中：xa代表某一指標(biāo)在某處理下的值，xmax和xmin分別代表同一指標(biāo)中在不同處理下的最大值與最小值。

采用SPSS 21.0軟件對所測數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，對不同處理的數(shù)據(jù)選用單因素ANOVA分析處理，用Duncan法進(jìn)行差異顯著性檢驗(P< 0.05)；采用Sigmaplot(14.0，美國)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同60Co-γ輻照劑量對粉黛亂子草種子萌發(fā)的影響

隨著60Co-γ射線輻射劑量的升高，各項發(fā)芽指標(biāo)均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(表1)。在200～400 Gy輻射劑量范圍內(nèi)，粉黛亂子草的發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)均顯著高于對照(P< 0.05)。當(dāng)輻射劑量為400 Gy時，發(fā)芽率達(dá)到最大值(87.25%)；而500 Gy的輻照處理則顯著降低了發(fā)芽率(68.75%)和發(fā)芽指數(shù)(7.72)。300 Gy及400 Gy的輻照處理顯著提高了粉黛亂子草種子的發(fā)芽勢(P< 0.05)，而當(dāng)輻射劑量達(dá)到500 Gy時，發(fā)芽勢為最小值(49.50%)。這表明適量的輻射處理(200～400 Gy)能促進(jìn)粉黛亂子草種子萌發(fā)，但過高劑量的輻射處理(500 Gy)則顯著抑制了種子萌發(fā)。

表1 不同60Co-γ輻照劑量對粉黛亂子草種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of different 60Co-γ radiation doses on seed germination of Muhlenbergia capillaris

隨著輻射劑量的增加，粉黛亂子草的胚芽長度呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)輻射劑量為100 Gy時，胚芽長度達(dá)最大值；在輻射劑量超過100 Gy后，隨著輻射劑量的增加，粉黛亂子草胚芽長度逐漸降低，當(dāng)輻射劑量達(dá)到400 Gy時，其胚芽長度均值約為對照組的1/2；當(dāng)輻射劑量達(dá)到500 Gy時，其胚芽長度均值約為對照組的1/6。粉黛亂子草胚根長度則隨輻射劑量增加呈逐漸降低的趨勢，當(dāng)輻射劑量為100 Gy時，胚根長度比對照減小了0.77 mm；當(dāng)輻射劑量為500 Gy時，胚根長度受輻射的抑制作用較為明顯，該輻射劑量下的胚根長度僅為對照組的1/3。以上結(jié)果表明，輻射處理顯著抑制了粉黛亂子草胚根生長，而低輻射劑量能促進(jìn)胚芽生長，高輻射劑量抑制胚芽生長。

2.2 不同60Co-γ輻照劑量對粉黛亂子草幼苗生長的影響

60Co-γ射線輻照處理對粉黛亂子草幼苗長勢、株高、根長的影響圖1所示。輻照劑量達(dá)到500 Gy時，粉黛亂子草成苗率低于2%，因此，幼苗形態(tài)指標(biāo)測定僅包括0，100，200，300及400 Gy 5個處理。苗齡為28天時，100 Gy處理的粉黛亂子草株高及根長均為最大值；苗齡為35天及42天時，對照組的株高均高于各輻照處理下幼苗株高，且隨著輻射劑量的增加，粉黛亂子草的株高及根長逐漸降低，輻射劑量為400 Gy時，株高及根長均為最低值。因此，較低的輻射劑量(100 Gy)對早期幼苗株高及根長有一定的促進(jìn)作用，但過高的輻射會抑制株高和根長的增加。

圖1 不同60Co-γ輻照劑量對粉黛亂子草幼苗株高和根長的影響Fig.1 Effects of different 60Co-γ radiation doses on plant height and root length of Muhlenbergia capillaris seedlings

2.3 不同60Co-γ輻照劑量對粉黛亂子草植株形態(tài)指標(biāo)的影響

隨著植物生長周期推移，粉黛亂子草植株株高、根長、葉寬、總?cè)~數(shù)、綠葉數(shù)及分蘗數(shù)均呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(圖2)。與對照相比，各輻照處理均顯著降低了粉黛亂子草植株的株高及葉寬，且隨著輻射劑量的增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，400 Gy達(dá)最低值。苗齡為91天時，與對照相比，100～400 Gy輻照處理下株高降低了19.03%～56.47%，根長降低了8.28%～37.96%，總?cè)~數(shù)降低了18.41～26.49%，綠葉數(shù)降低了20.30%～28.82%，分蘗數(shù)減少了21.92%～43.64%。

圖2 不同60Co-γ輻照劑量對粉黛亂子草植株形態(tài)的影響Fig.2 Effects of different60Co-γ radiation doses on morphology of Muhlenbergia capillaris plants

2.4 不同60Co-γ輻照劑量對粉黛亂子草根系形態(tài)指標(biāo)的影響

粉黛亂子草總根長隨輻射劑量增加呈先增加后減小的趨勢(圖3)，輻射劑量為100 Gy時根長達(dá)最大值，但與對照處理差異不顯著；當(dāng)輻射劑量達(dá)到200 Gy及以上時，隨著輻射劑量的增加，粉黛亂子草總根長逐漸降低；當(dāng)輻射劑量達(dá)到400 Gy時，粉黛亂子草總根長比對照降低了55.42%。根表面積、根體積受輻射劑量影響的變化趨勢與總根長基本一致，輻射劑量為100 Gy時粉黛亂子草根表面積與根體積分別增加了22.08%與6.46%，而輻射劑量200～400 Gy下粉黛亂子草根表面積與根體積顯著下降，當(dāng)輻射劑量達(dá)到400 Gy時，根表面積與根體積分別僅為對照的29.34%及19.79%，表明輻射劑量達(dá)400 Gy對根體積及根表面積有極強的抑制作用。相對于總根長、根表面積及根體積，輻照對粉黛亂子草根平均直徑的影響較小，僅當(dāng)輻射劑量達(dá)到400 Gy時，粉黛亂子草根平均直徑較對照顯著降低(—34.94%)。

圖3 不同60Co-γ輻照劑量對粉黛亂子草根系形態(tài)的影響Fig.3 Effects of different 60Co-γ radiation doses on root morphology of Muhlenbergia capillaris plants

2.5 隸屬函數(shù)綜合分析

為了綜合評價不同60Co-γ輻射劑量對粉黛亂子草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，對不同處理下粉黛亂子草的種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)(發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、胚芽長度、胚根長度)、植株形態(tài)指標(biāo)(株高、根長、葉寬、總?cè)~數(shù)、綠葉數(shù)、分蘗數(shù))及根系形態(tài)指標(biāo)(總根長、根表面積、根體積、根平均直徑)進(jìn)行了隸屬函數(shù)分析，計算總得分，結(jié)果表明0 Gy>100 Gy>200 Gy>300 Gy>400 Gy，表明本研究的輻照處理(100～400 Gy)均不同程度地影響了粉黛亂子草植株的長勢(表2)。

表2 不同60Co-γ輻照劑量對粉黛亂子草種子萌發(fā)及幼苗生長的隸屬函數(shù)分析Table 2 Subordinate function analysis for the effects of different60Co-γ radiation doses on seed germination and seedling growth of Muhlenbergia capillaris

2.6 粉黛亂子草干種子60Co-γ輻照半致死劑量計算

統(tǒng)計不同劑量處理下粉黛亂子草的成苗率，利用線性回歸方程式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.16x+5.03，R2=0.87(圖4)，計算求得：粉黛亂子草干種子受60Co-γ輻射的半致死劑量為274.03 Gy。

圖4 60Co-γ輻射劑量與粉黛亂子草死亡率的線性回歸分析Fig.4 Univariate linear regression between radiation dose and death rate of Muhlenbergia capillaris

3 討論

誘變劑量的選擇對于誘變育種至關(guān)重要，輻射劑量過高則存活率降低，失去選擇機會，而劑量過低則誘變效果不佳，獲得突變體的概率大大減少[19-20]。本研究對粉黛亂子草60Co-γ射線的輻射敏感性分析發(fā)現(xiàn)，不同輻射劑量對粉黛亂子草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響各異。經(jīng)不同劑量60Co-γ射線輻射處理后，粉黛亂子草種子的萌發(fā)率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均在一定程度上呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。在輻射劑量300～400 Gy之間，萌發(fā)指標(biāo)可以達(dá)到峰值，當(dāng)輻射劑量達(dá)到500 Gy時，各項發(fā)芽指標(biāo)急劇下降。在一定范圍內(nèi)的低劑量輻照可以提高粉黛亂子草種子萌發(fā)的相關(guān)指標(biāo)，但超過了一定的輻射劑量則會對種胚造成傷害，顯著抑制種子萌發(fā)。彭夢婕等[21]針對60Co-γ射線對紫薇種子萌發(fā)、幼苗生長的研究中，也發(fā)現(xiàn)了低劑量的輻照處理(100 Gy)對種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均有一定的促進(jìn)作用，而較高劑量的輻照(180 Gy)則會顯著影響種子的成苗率。低劑量輻照可能通過提高種子的新陳代謝水平，促進(jìn)種子的萌發(fā)，而高劑量輻射則可能破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、激發(fā)自由基積累、改變種子內(nèi)多種生理生化作用，影響種子活力[8,22]。

植株形態(tài)指標(biāo)是評價粉黛亂子草等觀賞草的重要評價標(biāo)準(zhǔn)，植株的株高、葉寬、葉片數(shù)量、分蘗數(shù)等指標(biāo)都具有評價價值。本研究發(fā)現(xiàn)，60Co-γ射線輻照雖然促進(jìn)了種子萌發(fā)進(jìn)程，但隨著幼苗生長發(fā)育，輻照處理均不同程度地影響了植株各形態(tài)指標(biāo)，降低了株高、根長、葉寬、總?cè)~數(shù)、綠葉數(shù)及分蘗數(shù)，其中100 Gy影響較小。劉淑霞等[23]在對紫花苜蓿的研究中也發(fā)現(xiàn)，隨著60Co-γ輻射劑量的增加，紫花苜蓿的發(fā)芽率、出苗率、株高、株干質(zhì)量、株鮮質(zhì)量及葉綠素含量均顯著下降。唐昌亮等[24]在對洋紫荊的研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)60Co-γ輻照超過一定范圍時，植株幼苗生長的大多數(shù)指標(biāo)都會出現(xiàn)顯著抑制，但一定程度上提升突變率，有利于后續(xù)對突變體的進(jìn)一步篩選。

根系是植物吸收水分及養(yǎng)分的主要器官，其形態(tài)結(jié)構(gòu)(根長、表面積、體積等)直接影響植物生長發(fā)育、生物產(chǎn)量及植物應(yīng)對環(huán)境變化的能力[25-26]。李春牛等[22]發(fā)現(xiàn)，輻照處理顯著影響了茉莉花種子生根，隨著輻照劑量的增加，種子的生根率及根長均呈下降趨勢，不同處理間差異極顯著(P<0.01)。袁帥等[8]發(fā)現(xiàn)50 Gy處理下扁穗雀麥幼苗根長略高于對照(P>0.05)，而輻射劑量超過100 Gy后，根系長度顯著下降；根系表面積和體積的變化均與輻射劑量的變化呈反比，根系平均直徑在60Co-γ輻射處理下與對照間無明顯差異。本研究中，100 Gy處理下粉黛亂子草總根長、根表面積略高于對照，但差異不顯著；輻照劑量超過100 Gy后，總根長、根表面積、根體積顯著下降；除400 Gy外，其余各處理均未顯著影響根平均直徑，這與前人的研究基本一致，表明根平均直徑受輻照影響較小，輻照對根系形態(tài)的影響主要集中于根長、根體積與根表面積。

4 結(jié)論

低劑量的60Co-γ射線輻照對粉黛亂子草種子萌發(fā)具有一定的促進(jìn)作用，提高了種子的發(fā)芽率及發(fā)芽勢；但隨著粉黛亂子草生長發(fā)育進(jìn)程推進(jìn)，植株大部分生長指標(biāo)均受輻照影響，呈現(xiàn)了逐漸下降的趨勢。在根系形態(tài)指標(biāo)方面，100 Gy輻照促進(jìn)了根表面積和根體積的增加，200～400 Gy則顯著抑制了總根長、根表面積及根體積。通過致死率-輻射劑量回歸方程計算得出，粉黛亂子草干種子受60Co-γ輻射的半致死劑量為274.03 Gy。該研究結(jié)果可望為粉黛亂子草輻射誘變及粉黛亂子草新種質(zhì)創(chuàng)制提供一定的數(shù)據(jù)支撐和理論參考。