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    雞新城疫微量紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果不確定度評(píng)定

    2023-01-03 12:34:40宋善道王書麗李志娟
    河南畜牧獸醫(yī) 2022年22期
    關(guān)鍵詞:血凝素移液器新城疫

    張 寧,宋善道,王書麗,李志娟

    (1.河南省獸藥飼料監(jiān)察所,河南 鄭州 450003;2.河南國(guó)康檢測(cè)技術(shù)有限公司)

    測(cè)量不確定度,簡(jiǎn)稱不確定度,是指根據(jù)所用到的信息,表征賦予被測(cè)量值分散性的非負(fù)參數(shù)(JJF 1059.1-2012)或表示與測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù),表征合理地賦予被測(cè)量值的分散性。其結(jié)果為表征結(jié)果的分散性,根據(jù)計(jì)算結(jié)果,其結(jié)果必然為非負(fù)數(shù)。具體而言,不確定度包括由系統(tǒng)影響引起的若干分量。測(cè)量結(jié)果包括估計(jì)值和測(cè)量不確定度,而不確定度反映了測(cè)量結(jié)果的可信程度。

    本研究利用HI 試驗(yàn)測(cè)定雞新城疫病毒(NDV)抗體,并對(duì)測(cè)量不確定度進(jìn)行了評(píng)定和計(jì)算,提供了測(cè)量過(guò)程中各分量的組成和計(jì)算方法,科學(xué)評(píng)定了此方法的準(zhǔn)確性,以期為獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室測(cè)量不確定度評(píng)估提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 樣品 8份待檢雞血清,均來(lái)自河南省獸藥飼料監(jiān)察所,均為留樣樣品。

    1.1.2 試劑 PBS(0.1mol/L,pH 7.0~7.2),自配;1%雞紅細(xì)胞懸液,采自河南省獸藥飼料監(jiān)察所飼養(yǎng)的無(wú)新城疫SPF 雞血清配制;新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原,購(gòu)自哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司,批號(hào):20210412;新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照,購(gòu)自哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司,批號(hào):20210412;新城疫標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照,購(gòu)自哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司,批號(hào):20210412。

    1.2 主要儀器與設(shè)備

    電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH-420AB),購(gòu)自北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司;高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(TGL-16MC),購(gòu)自湘儀離心機(jī)儀器有限公司;移液器(八通道),5~50 μL,購(gòu)自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司;移液器,10~100 μL、100~1 000 μL,購(gòu)自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 血凝素工作液配制

    血凝素凝集價(jià)測(cè)定:按照表1,對(duì)96孔微量板法布局,用PBS(0.1 mol/L,pH7.0~7.2,下同)將血凝素稀釋成不同倍數(shù),加入與抑制試驗(yàn)中血清量等量的PBS,再加入1%雞紅細(xì)胞懸液。將96 孔微量板在振搖器上搖勻,置室溫20~40 min 或置2~8℃40~60 min,當(dāng)對(duì)照孔中的紅細(xì)胞呈顯著紐扣狀時(shí)判定結(jié)果。以使紅細(xì)胞完全凝集的最高稀釋度作為判定終點(diǎn)。

    表1 96孔微量板法測(cè)定凝集價(jià) (單位:mL)

    1.3.2 血凝素工作液配制及檢測(cè)

    1.3.2.1 四單位HAU血凝素的配制

    如果血凝素凝集價(jià)測(cè)定結(jié)果為1:1024(舉例),4個(gè)血凝單位(即4HAU)=1024/4=256(即1:256)。取PBS 9.0 mL,加血凝素1.0 mL,即成1:10稀釋,將1:10稀釋液1.0 mL加入24.6 mLPBS中,使最終濃度為1:256。

    1.3.2.2 檢測(cè)

    檢查4HAU 的血凝價(jià)是否準(zhǔn)確,應(yīng)將配制的1:256 稀釋液分別以1.0 mL 的量加入PBS 1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 和6.0 mL 中,使最終稀釋度為1:2、1:3、1:4、1:5、1:6 和1:7。然后,從每一稀釋度中取0.25 mL,再加入1%雞紅細(xì)胞懸液0.25 mL,混勻。

    如果用微量板,方式相同。即從每一稀釋度中取0.025 mL,加入PBS 0.025 mL,再加入1%雞紅細(xì)胞懸液0.025 mL,混勻。

    將血凝板置室溫40 min 或置2~8℃60 min,如果配制的抗原液為4 HAU,則1:4 稀釋度將給出凝集終點(diǎn);如果4 HAU 高于4 個(gè)單位,可能1:5 或1:6 為終點(diǎn);如果較低,可能1:2或1:3為終點(diǎn)。應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果將血凝素稀釋度做適當(dāng)調(diào)整,使工作液確定為4 HAU。

    1.3.3 血凝抑制試驗(yàn)(HI)

    按照表2,對(duì)96孔微量板法布局,PBS將本血清做2倍系列稀釋,加入含4 HAU 的血凝素液,并設(shè)PBS 和血凝素對(duì)照,充分振搖后,置室溫下至少20 min 或在2~8℃下至少60 min,再加入1%雞紅細(xì)胞懸液,置室溫20~40 min 或置2~8℃40~60 min,當(dāng)對(duì)照孔中的紅細(xì)胞呈顯著紐扣狀時(shí)判定結(jié)果。以使紅細(xì)胞凝集被完全抑制的血清最高稀釋度作為判定終點(diǎn)。

    表2 96孔微量血凝抑制試驗(yàn) (單位:mL)

    2 結(jié)果及分析

    2.1 數(shù)學(xué)模型

    式中, Xi—同一血清樣本單次檢測(cè)的新城疫抗體HI效價(jià)(log2);

    n—平行樣數(shù)量;

    2.2 測(cè)量結(jié)果

    對(duì)8份雞血清進(jìn)行HI重復(fù)性測(cè)定,結(jié)果見表3。

    表3 8份雞血清HI重復(fù)測(cè)定結(jié)果表

    2.3 不確定度評(píng)定

    2.3.1 測(cè)定方法重復(fù)性導(dǎo)致的不確定度ua

    對(duì)血清樣品新城疫HI抗體效價(jià)進(jìn)行8次重復(fù)測(cè)定,平均HI效價(jià)為:

    實(shí)際標(biāo)準(zhǔn)差為

    2.3.2 由測(cè)量?jī)x器和測(cè)定過(guò)程導(dǎo)致的不確定度ub1

    測(cè)定一個(gè)血清樣本需采用200 μl 移液槍進(jìn)行多次操作,其中在96 孔V 型板中加入25 μl PBS 需重復(fù)操作10次,血清的稀釋需用移液器進(jìn)行10 次重復(fù)操作,添加4 HAU抗原需移液槍進(jìn)行10次重復(fù)操作,添加1%雞紅血球移液槍進(jìn)行10次重復(fù)操作。主要考慮以下分量:200 ul移液槍經(jīng)檢定合格,按照《JJG 646-2006移液器檢定規(guī)程》吸取25 μl液體,允許最大誤差為±1 μl,該量為均勻分布,包含因子k=

    移液器重復(fù)帶來(lái)的不確定度ub2,取移液槍,精密量取水200 uL,稱重,重復(fù)10次,結(jié)果見表4。

    表4 移液器重復(fù)10次檢測(cè)結(jié)果

    稱重的標(biāo)準(zhǔn)偏差為Sm=0.7559 g,故S移=0.7559 mL。

    溫度效應(yīng)引入的不確定度ub3,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中環(huán)境溫度變化2℃,考慮其對(duì)體積的影響。

    整個(gè)過(guò)程需進(jìn)行40 次移液器的重復(fù)操作,所以由測(cè)量?jī)x器和測(cè)定過(guò)程導(dǎo)致的不確定度ub。

    2.3.3 人員讀數(shù)導(dǎo)致的不確定度uc

    檢測(cè)人員在觀察讀數(shù)時(shí),因受觀察時(shí)間、操作經(jīng)驗(yàn)以及1%紅血球溶血度等因素的影響,會(huì)產(chǎn)生讀數(shù)誤差。估計(jì)該差a=0.1(log2),為均勻分布,包含因子k=

    2.4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

    計(jì)算雞新城疫微量紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)測(cè)定的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

    2.5 擴(kuò)展不確定度

    取包含因子k=2,擴(kuò)展不確定度U=k×u=0.27×2=0.54≈0.6,新城疫微量紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)HI 效價(jià)為(7.0±0.6)log2,(k=2)。

    3 討論

    通過(guò)對(duì)構(gòu)成不確定度的各分量進(jìn)行詳細(xì)分析,并分析各分量在整體不確定度值中所占的比例,可直觀了解對(duì)檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量影響最大的因素,在對(duì)這些因素針對(duì)性地改進(jìn)后,可以有效提高檢測(cè)質(zhì)量。

    本研究評(píng)估結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.27,擴(kuò)展不確定度為0.6,置信水平P=95%,k=2。試驗(yàn)表明,該檢測(cè)不確定度的主要來(lái)源為測(cè)定方法重復(fù)性、移液器、溫度環(huán)境、人員讀數(shù)帶來(lái)的不確定度。在樣品測(cè)量值處于陽(yáng)性判定值附近時(shí),需要考慮不確定度的存在。該方法可有效評(píng)定雞血清中雞新城疫病毒抗體檢測(cè)結(jié)果的不確定度,可為實(shí)驗(yàn)室在今后的血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)中提供參考?!?/p>

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