平痤乳膏制備工藝的優(yōu)化及其內(nèi)外合治藥效學(xué)考察

張欣榮，胡等慧

（1.河北省中醫(yī)院藥劑科 河北 石家莊 050011；2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 北京 102488）

痤瘡是一種慢性炎性皮膚病，是世界上最普遍的十大疾病，其發(fā)病率具有地域性、年齡性、種族性等特點(diǎn)。因其發(fā)生部位多集中于面部、背部等體表位置，極其影響美觀，不僅對(duì)患者的身體造成不適，而且對(duì)患者的心理會(huì)產(chǎn)生很大影響[1-3]。本次將河北省中醫(yī)院的臨床制劑“平痤膏”進(jìn)一步研發(fā)，制備得到平痤乳膏制劑，以便于更好服務(wù)于臨床?！捌金睢庇擅倒?、丹參、茵陳、甘草等藥味組成，作為臨床制劑時(shí)，起初是將藥材細(xì)粉與凡士林均勻混合制得凡士林膏，該膏雖具有一定療效，但其具有藥效成分溶出不完全，衛(wèi)生不達(dá)標(biāo)及穩(wěn)定性差等問題，為了更好地發(fā)揮該制劑的療效，在此基礎(chǔ)上將其制備成“平痤凝膠”，雖然一定程度改善了上述缺點(diǎn)，但在臨床使用過程中存在保濕性差等問題。因此本課題在前兩種制劑研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步改良制成平痤乳膏，并基于中醫(yī)基礎(chǔ)理論中的“內(nèi)治治本，外治治標(biāo)”及“標(biāo)本兼治”的原則，將平痤乳膏在外用涂抹的同時(shí)，口服載藥粉膠囊，達(dá)到標(biāo)本同治，內(nèi)外合治的目的，以期為該臨床制劑在痤瘡方面的應(yīng)用提供新的給藥途徑和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器設(shè)備：C P 2 2 5 D和B S 2 1 0 S型電子天平（Sartorius,Germany）；KQ-5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-S8雙列八孔水浴鍋（邢臺(tái)德闊機(jī)械廠）；粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司，型號(hào)：800Y）、藥篩（德立DOLO，型號(hào)：DL-248）、脫毛器（Riwa/雷瓦，型號(hào)：RF-770A）酶標(biāo)儀。

1.2 材料試劑：平痤凡士林膏（自制）、平痤乳膏（自制）；平痤凝膠（自制）；痤瘡軟膏（百花醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)271256）；睪酮酶聯(lián)免疫分析試劑盒（北京圣科隆生物科技有限公司，批號(hào)L180226658）；雌二醇酶聯(lián)免疫分析試劑盒（北京圣科隆生物科技有限公司，批號(hào)L180226659）；中性福爾馬林固定液（10%，上海源葉生物科技有限公司）；生理鹽水溶液（自制）。

1.3 動(dòng)物：S P F級(jí)昆明種小鼠，雄性[5周齡，體重（20±5）g，合格證號(hào)SCXK9（京）2016-0002，購于北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司]。

1.4 方法

1.4.1 凡士林膏的制備：按處方量，稱取各中藥材適量，打粉，過100篩；取凡士林適量60℃加熱融化，按藥材粉與凡士林2:1原則，將上述兩者攪拌混合均勻，即得載藥凡士林膏[4-5]。

1.4.2 平痤凝膠的制備

1.4.2.1 中藥提取濃縮液的制備：中藥粉末過80目篩，加8倍量90%乙醇，冷浸72 h，過濾；藥渣加6倍量90%乙醇冷浸兩次，每次48 h，過濾。合并3次濾液，回收乙醇得中藥提取濃縮液。

1.4.2.2 平痤凝膠的制備：稱取一定量的羥丙基甲基纖維素使其濃度為5%，放置4℃充分溶脹，于24 h后取出，依次加入處方量丙二醇及促透劑、中藥提取濃縮液，邊加邊攪拌，至均勻狀態(tài)，即得平痤凝膠。

1.4.2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：本實(shí)驗(yàn)在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)和單因素考察的基礎(chǔ)上，選取對(duì)乳膏成品影響較大的三個(gè)因素：水相與油相的組成比A、乳化溫度B和乳化劑的用量C作為自變量，以成品的穩(wěn)定性、均勻性、外觀狀態(tài)、涂布性能、粘稠度為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，以百分制為得分標(biāo)準(zhǔn)，各指標(biāo)均占20分?？疾旄饕蛩貙?duì)乳膏制備工藝的影響，每個(gè)因素選取低、中、高3個(gè)水平，設(shè)計(jì)因素見表1。

表1 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.4.3 不同制劑的藥效學(xué)研究

1.4.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥：36只小鼠依隨機(jī)數(shù)字表分為6組，即空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組、凡士林膏組、平痤凝膠組、平痤乳膏組、內(nèi)外合治組?？瞻讓?duì)照組不給藥，陽性對(duì)照組涂抹痤瘡軟膏（主要成分為硫磺和大黃），凡士林膏組、平痤凝膠組、平痤乳膏組涂抹相應(yīng)制劑，內(nèi)外合治組外涂平痤乳膏+內(nèi)服載平痤乳膏藥粉膠囊，其中內(nèi)服載平痤乳膏藥粉膠囊根據(jù)小鼠與人體劑量折算為每只小鼠每天每公斤體重0.4 g，將其制備成混懸液多次服用。

1.4.3.2 對(duì)小鼠性激素水平的影響[6]

1.4.3.2.1 血清樣品采集及檢測：各組小鼠連續(xù)涂抹給藥10 d，第11天摘眼球取血，制備血清。使用ELISA法檢測，得標(biāo)準(zhǔn)品光密度值，采用SAS軟件進(jìn)行邏輯回歸分析，得回歸方程。酶標(biāo)儀測定各組血清樣品的吸光度值，將其代入回歸方程中，計(jì)算相應(yīng)樣品中睪酮（T）、雌二醇（E2）的含量，并計(jì)算T/E2比值。

1.4.3.2.2 皮脂腺斑組織結(jié)構(gòu)[7]：皮脂腺斑是雄激素依賴性器官，包含有毛囊、大量皮脂腺及黑素團(tuán)塊等重要結(jié)構(gòu)，可用于判斷藥物抗雄激素及抗皮脂腺增生的情況。本部分取“1.4.3.2.1”項(xiàng)下小鼠脫頸椎處死，剔除小鼠腹部的被毛，摘取下側(cè)腹部皮脂腺斑組織放入8～10倍體積的中性福爾馬林組織固定液中，HE染色切片觀察。

1.4.3.3 小鼠耳腫脹抗炎實(shí)驗(yàn)[8]：每組小鼠連續(xù)10 d于同一時(shí)間點(diǎn)涂抹給藥，在第10天給藥45 min之后，每只小鼠右耳正反兩面各涂抹0.01 ml二甲苯溶液，左耳不做任何處理。造模45 min后處死小鼠，用同一打孔器分別在兩耳的相同部位打下相同大小的圓片，根據(jù)圓片重量的差值計(jì)算每只小鼠的腫脹程度，腫脹度計(jì)算公式：腫脹度（mg）=致炎后的小鼠耳廓重量-致炎前的小鼠耳廓重量；腫脹抑制率（%）=（空白對(duì)照組平均耳腫脹度-給藥組平均耳腫脹度）/空白對(duì)照組平均耳腫脹度×100%。

2 結(jié)果

2.1 平痤乳膏工藝優(yōu)化結(jié)果：由表2可知，最優(yōu)乳膏制備工藝水相與油相比為3:2，乳化溫度為80℃，乳化劑用量為2 g。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選制備工藝實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

2.2 模型擬合：采用Design-Expert對(duì)上面數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以Y對(duì)三個(gè)自變量A、B、C進(jìn)行模型擬合，并根據(jù)相關(guān)系數(shù)（R2）等對(duì)擬合模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過比較各擬合方程的擬合度，得到二次多項(xiàng)式回歸方程Y=86.40+1.38A+1.38B+1.75C-4.50AB-0.25AC-3.75BC+3.80A2-14.70B2+1.05C2，R2=0.9901，P＜0.01，F(xiàn)=77.55，表明模型具有極顯著差異性；失擬項(xiàng)P=0.3220＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明該模型擬合度和可信度均有效，試驗(yàn)誤差小，可以用此模型對(duì)平痤乳膏的制備工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。此外，由F檢驗(yàn)可知三個(gè)因素對(duì)綜合評(píng)價(jià)的影響以C乳化劑用量最為顯著，且AB、BC交互作用顯著。見表3。

表3 方差分析結(jié)果

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析：根據(jù)擬合方程，通過Design-Expert V8.0.6.1軟件繪制綜合評(píng)分隨因素變化的等高線圖和響應(yīng)面圖。由圖1～2可以看出，當(dāng)乳化溫度一定時(shí)，在一定范圍內(nèi)，油相與水相的比與綜合評(píng)分成正相關(guān)，綜合評(píng)分隨著油相與水相的比例增大而增大；由圖3～4可以看出，油水相比一定時(shí)，乳化劑用量與綜合評(píng)分成正相關(guān)，綜合評(píng)分隨著乳化劑用量的增多而增大；由圖5～6可以看出，乳化溫度對(duì)綜合評(píng)分的影響成拋物線，隨乳化溫度的增高綜合評(píng)分呈先增大后降低的趨勢，當(dāng)乳化溫度接近于80℃時(shí)，綜合評(píng)分最高。

圖1 A-B等高線圖

圖2 A-B響應(yīng)面圖

圖3 A-C等高線圖

圖5 B-C等高線圖

圖4 A-C響應(yīng)面圖

圖6 B-C響應(yīng)面圖

2.4 優(yōu)化結(jié)果：根據(jù)回歸模型分析可知，制備平痤乳膏的最優(yōu)條件為：水相比油相3:2、乳化溫度77.66℃和乳化劑用量2.0 g。根據(jù)優(yōu)化結(jié)果并考慮工業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際操作可行性，各因素值均取整值，即油相與水相比3:2、乳化溫度80℃和乳化劑用量2.0 g。

2.5 平痤乳膏對(duì)小鼠性激素含量的影響：使用ELISA法檢測，橫坐標(biāo)選用標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，縱坐標(biāo)選用光密度OD值，據(jù)此進(jìn)行邏輯回歸分析，使用統(tǒng)計(jì)軟件SAS對(duì)T及E2回歸曲線進(jìn)行擬合，擬合方程如下：

各組小鼠的睪酮及雌二醇含量如圖7所示。各組小鼠血清中T/E2值均無任何統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與空白對(duì)照組相比，各組小鼠血清中T值除凡士林膏組以及平痤凝膠組外均顯著降低（P＜0.01）、E2值除凡士林膏組外同樣顯著降低（P＜0.01），說明凡士林膏組降低小鼠體內(nèi)的T與E2水平療效很差。與陽性對(duì)照組相比，內(nèi)外合治組、平痤乳膏組、平痤凝膠組小鼠血清中T值與E2值降低不明顯，療效等同，凡士林膏組略有升高，療效較差。由以上結(jié)果可知，內(nèi)外合治組、陽性對(duì)照組、平痤乳膏組和平痤凝膠均能不同程度地調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)的激素水平，而凡士林膏組調(diào)節(jié)能力很差，各組制劑調(diào)節(jié)能力由高到低依次為內(nèi)外合治組＞平痤乳膏及陽性對(duì)照組＞平痤凝膠組＞凡士林膏組。

2.6 平痤乳膏對(duì)小鼠皮脂腺斑顯微結(jié)構(gòu)的影響：如圖8所示，空白對(duì)照組的小鼠皮脂腺體積較大，部分開口于毛囊，結(jié)構(gòu)完整。與空白對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組小鼠皮脂腺體積略變小，排列緊密；與陽性對(duì)照組相比，凡士林膏組、平痤凝膠組、平痤乳膏組三組變化不大，但內(nèi)外合治組體積變小，且排列較緊密，說明內(nèi)外合治組抑制皮脂腺增長的能力強(qiáng)于平痤乳膏組、平痤凝膠組以及凡士林膏組。由以上結(jié)果可知，內(nèi)外合治組能明顯地使皮脂腺腺體萎縮，控制皮脂的分泌，且效果優(yōu)于陽性對(duì)照組。

圖8 各組小鼠皮脂腺斑纖維結(jié)構(gòu)（100×）

2.7 小鼠耳腫脹抗炎實(shí)驗(yàn)：小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。與空白對(duì)照組相比，各組耳廓腫脹程度均明顯減輕，其中陽性對(duì)照組、平痤乳膏以及內(nèi)外合治組療效顯著（P＜0.01），凡士林膏組、平痤凝膠組療效較差，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明除凡士林膏組和平痤凝膠組外，其余各組均可抑制小鼠耳腫脹。與陽性對(duì)照組相比，平痤乳膏組以及內(nèi)外合治組小鼠耳腫脹明顯減輕（P＜0.01），療效最佳；平痤凝膠組無差異，療效等同，凡士林膏組耳腫脹明顯重于陽性對(duì)照組，療效最差。由以上結(jié)果可知內(nèi)外合治組、平痤乳膏組以及平痤凝膠組均具有一定的抗炎作用，能夠在一定程度上抑制小鼠的耳腫脹，且內(nèi)外合治組療效最佳、其次為平痤乳膏組、最后為平痤凝膠組。

表4 二甲苯致小鼠耳腫脹抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （±s）

表4 二甲苯致小鼠耳腫脹抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （±s）

注：**表示與空白對(duì)照組比較，P＜0.01，##表示與陽性對(duì)照組比較，P＜0.01。

組別 耳廓腫脹度/mg 腫脹抑制率/%空白對(duì)照組 13.37±0.91 -陽性對(duì)照組 10.54±0.65** 21.17凡士林膏組 12.92±0.92## 3.38平痤凝膠組 12.50±0.99 6.49平痤乳膏組 10.46±0.51**## 21.78內(nèi)外合治組 9.97±1.16**## 25.43

3 討論

本文所考察的劑型為乳膏，在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，外用油包水（W/O）型軟膏劑相較于水包油（O/W）型乳膏劑不易揮發(fā)、失水，因此作用時(shí)間更持久，且能夠在皮膚表層覆蓋一層油脂膜，增強(qiáng)皮膚的水合作用，易于有效成分經(jīng)皮遞送，故最終制備W/O的乳膏，在保護(hù)中藥有效成分揮發(fā)的同時(shí)更好的發(fā)揮藥理作用。在W/O乳膏劑制備工藝的過程中，由響應(yīng)面結(jié)果可知，隨著乳化劑用量的增加，乳劑的綜合評(píng)分也增加，但在實(shí)際操作過程中，在保證乳劑穩(wěn)定性的前提下，乳化劑的用量應(yīng)越少越好。通常在O/W的乳膏中，乳化劑的用量大約為0.5%～10%[8]，本實(shí)驗(yàn)乳化劑用量為2 g即可保證穩(wěn)定性，故最終選用乳化劑的用量為2 g。

平痤凡士林乳膏是臨床制劑，由藥材細(xì)粉與凡士林混勻所得，雖然可以與凡士林大量混合，但藥材中有效成分不能有效地從藥材粉末中溶出，透皮性能不佳，影響有效成分發(fā)揮作用，且皮膚適應(yīng)性差；平痤凝膠雖然通過提取中藥材，促進(jìn)有效成分以分子狀態(tài)存在，但保濕性能差，涂抹于皮膚表面后，由于羥丙基甲基纖維素的自身性質(zhì)，使得藥物釋放緩慢，相較于平痤凡士林膏藥效雖明顯增強(qiáng)，但也不及乳膏；平痤乳膏是在前期研究基礎(chǔ)上制備新制劑，相比較前兩者而言，平痤乳膏不僅有效成分提取后便于發(fā)揮作用，保濕性能好，而且易于涂抹和清洗、皮膚適應(yīng)性和滲透性好、生物利用度高，在臨床上具有更好的療效。除此之外，本文基于中醫(yī)理論“內(nèi)外兼治”的指導(dǎo)原則，選用內(nèi)外同治法，采用外用中藥乳膏加口服載藥粉末膠囊給藥，其中載藥膠囊內(nèi)服從中醫(yī)整體理念出發(fā)，通過活血化瘀、清熱解毒，達(dá)到治本目的；乳膏外涂從中醫(yī)局部理論出發(fā)，使藥物在局部受損部位快速起效，發(fā)揮消腫止痛的作用，達(dá)到治標(biāo)目的。結(jié)果顯示，平痤內(nèi)外合治組療效最佳，優(yōu)于單純外用給藥各組，符合中醫(yī)理論中內(nèi)外合治可增效的特點(diǎn)，在對(duì)癥治療的同時(shí)，追朔病原，發(fā)揮標(biāo)本同治之功效。