反復超促排卵對老齡模型小鼠生殖能力的影響

趙 穎 章 勤 陳眾芳 王如燁 馬 景

Chambers 等[1]統(tǒng)計全球76 個國家體外受精和卵胞漿內單精子顯微注射胚胎移植后分娩率分別為19.9%和24.3%，控制性卵巢刺激（control ovarian stimulation，COS）是主要影響因素之一[2]。COS 采用超生理劑量的促性腺激素，誘發(fā)多個卵子同時發(fā)育與成熟，從而獲得更多的胚胎以用于移植[3]。超過4 次的COS 被稱為反復促排[4-5]。研究發(fā)現，接受3 次以上的重復COS 可能導致卵母細胞數量顯著減少，優(yōu)胚數、植入率和臨床妊娠率顯著降低[6-7]。過度氧化應激引起活性氧（reactive oxygen species，ROS）在卵巢內的積累被認為可能是導致卵巢儲備功能低下、卵母細胞損傷的機制之一。反復COS 不但能擾亂卵母細胞中紡錘體組織和染色體排列、改變早期胚胎中的組蛋白修飾，從而影響胚胎發(fā)育潛能[8-9]，而且能明顯升高卵巢ROS 水平，增加卵巢中的氧化應激和細胞凋亡，可能通過p16 和SIRT1/FOXO1 信號通路顯著降低卵巢功能，但其對卵巢顆粒細胞功能、卵母細胞質量的影響仍無定論[10]。線粒體是ROS 最易影響的靶點，線粒體功能障礙可能導致受精失敗、胚胎發(fā)育潛能下降，ROS 作為c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal protein kinase，JNK）的有效誘導劑，可能通過p53 作用介導細胞凋亡。因此，本實驗從ROSJNK-p53-線粒體功能的角度探索反復超促排對老齡雌性小鼠卵巢功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30 只SPF 級7 月齡的雌性C57BL/6 小鼠（28～33 g），均從維通利華實驗動物技術有限公司購買（證書號：SCXK 2019-0001）。小鼠在浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心的屏障設施中以恒溫、恒濕和自然光循環(huán)的條件飼養(yǎng)，實驗通過浙江中醫(yī)藥大學倫理審查（批準編號：20201123-01）。

1.2 實驗試劑與儀器 粉末型孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonado-tropin，PMSG）試劑盒（江蘇易核生物有限公司，批號2001A）；粉末型人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）試劑盒（江蘇易核生物有限公司，批號2003A）；小鼠雌二醇（estradiol，E2）酶聯免疫吸附劑測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（凡科維生物有限公司，批號21010279M）；小鼠孕酮（progesterone，P）ELISA 試劑盒（凡科維生物有限公司，批號21010279M）；小鼠抑制素B（inhibin-B，INHB）ELISA 試劑盒（凡科維生物有限公司，批號21022171M）；ROS（DCFH-DA 探針）試劑盒（碧云天生物技術有限公司，批號112420201215）；RT 反轉錄試劑盒（TAKARA，批號RR036Q），熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TAKARA，批號RR420L）。熒光倒置顯微鏡（蔡司，Axio Observer.A1）；光學顯微鏡（Motic，AE2000）；透射電子顯微鏡（HITACHI，H7650）；熒光定量PCR 儀（ABI，Step-OnePlus）。

1.3 建立反復超促排小鼠模型 依據文獻[5]將30只7 月齡的C57BL/6 雌鼠按照隨機數字表法平均分成兩組，其中15 只腹腔注射15 IU PMSG，48 h 后注射15 IU hCG，每周1 次，連續(xù)4 周。剩余15 只小鼠在實驗結束前2 d 按促排流程腹腔注射PMSG 15 IU、hCG 15 IU 1 次。經歷4 次COS 的老齡雌性小鼠為模型組，僅在實驗結束前接受1 次COS 的老齡雌性小鼠為對照組。

1.4 ELISA 法檢測血清中生殖激素水平 在最后1次COS 注射hCG 16 h 后，小鼠頜下靜脈取血，室溫靜置1 h 后以3000 r/min 離心15 min，取上清，根據說明書，使用ELISA 檢測試劑盒檢測血清E2、P 和INHB 水平。

1.5 體式顯微鏡下觀察卵母細胞形態(tài)、ROS 水平檢測 在最后1 次COS 注射hCG 16 h 后解剖小鼠，取輸卵管壺腹部置于含Hepes 緩沖液的試管中，壺腹部突起處用鋒利的針頭劃開，使卵母細胞-顆粒細胞復合物（cumulus-oocyte complexs，COCs）滑出[11]。小鼠COCs 被放入含有透明質酸酶的預制Hepes 緩沖液中，消化5～10 min 后于體式顯微鏡下觀察卵母細胞的數量和形態(tài)，收集并用于隨后的實驗；卵母細胞ROS 水平檢測通過DCFH-DA 探針方法進行。卵母細胞在PBS 中用10 mM DCFH-DA 孵育20 min，每隔3～5 min 顛倒混勻，而后在37 ℃條件下PBS 洗3次，在熒光倒置顯微鏡下觀察、拍照并用Image J 計算熒光強度。

1.6 HE 染色觀察卵巢中各級卵泡及黃體數量 小鼠卵巢組織于4%甲醛固定后，脫水，石蠟包埋、切片，獲得厚度為4 μm 的卵巢切片并進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色。光學顯微鏡下觀察卵巢結構并進行卵泡計數并拍照。

1.7 透射電鏡觀察卵巢顆粒細胞超微結構 解剖小鼠后，1 min 內快速用眼科鑷子分離一側卵巢，并在冰上用手術刀片切下大小約1 mm×1 mm×1 mm 的卵巢組織，放入提前預冷的2.5%戊二醛中固定。經過漂洗、1%鋨酸固定、脫水包埋、固化后，用超薄切片機獲得約60 nm 切片并用醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，在透射電子顯微鏡下觀察線粒體的形態(tài)，計算嵴模糊的線粒體及空泡征占比。

1.8 實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測卵巢JNK、Bcl2 關聯X 蛋白（Bax）、人體抑癌基因（p53）、叉形頭轉錄因子O 亞型（FOXO3a）mRNA 表達水平 取小鼠卵巢液氮冷凍，后移至-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。取卵巢樣品加入?.5 mL 滅菌管中，加入裂解Buffer并進行組織破碎、吹打至無明顯沉淀，RNA 提取試劑盒提取卵巢總RNA，RT 反轉錄試劑盒在普通PCR 儀中將mRNA 逆轉錄成為cDNA，用熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ配置反應體系，運用實時熒光定量PCR 儀進行擴增。條件：預變性95 ℃3 min；而后40 個循環(huán)（95 ℃10 s，60 ℃30 s）；所有數據采用ABI StepOnePlus PCR 儀收集，轉錄水平通過公式2-△△CT計算，以β-actin 作為內參，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物設計見表1。

表1 RT-qPCR 引物設計

1.9 統(tǒng)計學方法 符合正態(tài)分布的實驗數據以均數±標準差（）表示，應用Prism Graphpad 統(tǒng)計軟件進行分析，方差齊的數據通過獨立樣本t 檢驗分析組間差異，方差不齊者用秩和檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 E2、P、INHB 水平 與對照組比較，模型組小鼠的E2、P 及INHB 水平均顯著降低（P＜0.01）。見表2。

表2 各組小鼠血清E2、P、INHB 水平比較（）

表2 各組小鼠血清E2、P、INHB 水平比較（）

注：對照組接受1 次超促排；模型組接受4 次反復超促排；E2 為雌二醇；P 為孕酮；INHB 為抑制素B；與對照組比較，aP＜0.01

2.2 超促排后獲得卵子數量、破碎卵母細胞比率及ROS 值 與對照組比較，促排后模型組獲得的卵子數量明顯降低，其中破碎卵母細胞的比率明顯升高（P＜0.01）。模型組卵母細胞的ROS 值較對照組明顯升高（P＜0.01）。見表3 及圖1、2。

表3 各組小鼠卵子數量、碎裂比率及卵母細胞ROS 水平比較（）

表3 各組小鼠卵子數量、碎裂比率及卵母細胞ROS 水平比較（）

注：對照組接受1 次超促排；模型組接受4 次反復超促排；ROS 為活性氧；與對照組比較，aP＜0.01

圖1 體式顯微鏡下的卵母細胞形態(tài)

圖2 熒光倒置顯微鏡下卵母細胞ROS 熒光強度

2.3 卵巢各級卵泡及黃體數量及顆粒細胞線粒體形態(tài) 模型組小鼠卵巢中的原始卵泡較對照組明顯減少（P＜0.01），其發(fā)育卵泡（包括竇卵泡及成熟卵泡）均較對照組減少（P＜0.05），而閉鎖卵泡數量較對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（見表4 和圖3）。模型組小鼠的黃體數量較對照組明顯增多（P＜0.05），透射電鏡下可見對照組小鼠的顆粒細胞周圍多為正常線粒體，其結構規(guī)則，呈圓形或桿狀，嵴清晰完整。而模型組有較多異常線粒體，呈現腫脹、聚集、融合的狀態(tài)，其嵴模糊或斷裂，部分空泡化。相較于對照組，模型組線粒體空泡征及線粒體嵴模糊發(fā)生率更高（P＜0.01），見表5 和圖4。

圖3 卵巢病理圖片（HE 染色）

圖4 透射電鏡下卵巢顆粒細胞超微結構（醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色）

表4 各組小鼠原始卵泡、發(fā)育卵泡、閉鎖卵泡及黃體數量比較（個，）

表4 各組小鼠原始卵泡、發(fā)育卵泡、閉鎖卵泡及黃體數量比較（個，）

注：對照組接受1 次超促排；模型組接受4 次反復超促排；與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

表5 各組小鼠線粒體嵴模糊及空泡征發(fā)生率比較（%，）

表5 各組小鼠線粒體嵴模糊及空泡征發(fā)生率比較（%，）

注：對照組接受1 次超促排；模型組接受4 次反復超促排；與對照組比較，aP＜0.01

2.4 卵巢中的凋亡相關基因表達情況 與對照組比較，模型組小鼠的JNK、p53、Bax mRNA 表達均升高（P＜0.05），而FOXO3a mRNA 表達明顯下降（P＜0.01）。見表6。

表6 各組小鼠卵巢JNK、p53、Bax、FOXO3a 基因表達水平比較（）

表6 各組小鼠卵巢JNK、p53、Bax、FOXO3a 基因表達水平比較（）

注：對照組接受1 次超促排；模型組接受4 次反復超促排；JNK 為c-Jun 氨基末端激酶；p53 為人體抑癌基因；Bax 為Bcl2 關聯X 蛋白；FOXO3a 為叉形頭轉錄因子O 亞型；與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

3 討論

高齡女性由于卵巢儲備功能低下，在獲得成功妊娠前不得不經歷多次COS 以獲得足夠的優(yōu)質胚胎。實驗表明，經歷4 次以上COS 的小鼠生育能力明顯下降，抗苗勒管激素表達水平以及E2、P 濃度顯著降低[4]；影響卵丘細胞線粒體功能，從而降低卵巢功能，降低卵母細胞和胚胎質量，影響胚胎發(fā)育。本實驗中，與經歷1 次COS 相比，經歷4 次COS 的老齡雌性小鼠E2、P 及INHB 水平降低，表明連續(xù)COS 降低了小鼠的生殖內分泌水平及卵巢儲備功能。卵巢病理圖片顯示，連續(xù)4 次COS 使小鼠的原始卵泡、竇卵泡及成熟卵泡均減少，并使卵巢顆粒細胞線粒體形態(tài)發(fā)生異常改變、影響了線粒體的功能。通過觀察我們發(fā)現，4次COS 雌性老齡模型小鼠異常卵子，尤其是破碎卵子的比率明顯增高，而其卵子內ROS 水平也明顯增加。我們推測，重復COS 可能導致雌性老齡模型小鼠的生殖器官受到強烈的氧化應激和損傷。

JNK 也稱為應激激活蛋白激酶（SAPK），參與各種應激反應，尤其是導致氧化損傷的應激反應[12]。已有研究表明，在ROS 介導的細胞凋亡中，JNK 被激活并與p53 協同調節(jié)凋亡進程；同時，JNK 可通過Bax的線粒體易位增強Bcl2 促凋亡家族成員的功能。在應對氧化應激時，FOXO3a 磷酸化并促進ROS 清除劑的表達，而促其磷酸化的許多激酶也可作為JNK通路的上游激酶誘導一系列級聯反應及應激細胞的凋亡[13-14]。本研究顯示，由連續(xù)COS 導致的卵巢內ROS 過度累積，可誘導卵巢JNK、Bax、p53 mRNA 表達增加，FOXO3a mRNA 表達減低。

本研究表明，經過4 次COS 的老齡雌性小鼠雌孕激素水平下降、卵巢各級卵泡數減少，可能與卵巢內過度ROS 積聚，卵巢氧化應激水平激增，從而導致JNK、Bax、p53 等凋亡相關基因表達增加，顆粒細胞線粒體形態(tài)異常、功能紊亂有關。