祛瘀消腫方對LPS 刺激的巨噬細胞TLR4 信號通路調(diào)控機制的硏究

金 莉 潘怡宏

急性乳腺炎是女性產(chǎn)褥期常見疾病，常見于產(chǎn)后1～4 個月的哺乳期婦女，以初產(chǎn)婦多見[1]。目前廣泛使用抗生素療法，但存在菌株耐藥、藥物殘留等弊端[2]。中醫(yī)外治療法在治療急性乳腺炎方面具有廣譜抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用[3]。祛瘀消腫方為浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市第一人民醫(yī)院院內(nèi)協(xié)定方，方劑組成為生大黃粉30 g，芒硝120 g。自2012 年起在醫(yī)院乳腺外科得到廣泛應用，對于乳汁郁積和乳腺炎初期，臨床療效顯著，能明顯緩解乳房紅腫熱痛，但其具體作用機制尚不清楚。在炎癥反應的初期，巨噬細胞作為效應細胞首先進入被感染區(qū)，隨后激活并募集嗜中性粒細胞，組成機體抗感染的第一道防線[4]。本研究探討祛瘀消腫方在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的乳腺炎過程中對巨噬細胞的影響以及祛瘀消腫方對炎癥的抑制作用。

1 實驗材料

1.1 細胞 RAW264.7 巨噬細胞購自中科院上海生命科學研究院細胞庫（美國模式培養(yǎng)物保藏所編號：TIB-71）。

1.2 動物 24 只健康成年SD 大鼠，體質(zhì)量160～170 g，50 天齡，SPF 級，由杭州醫(yī)學院實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0002；使用許可證號：SYXK（浙）2019-0011。在室溫（20～25）℃，50%適宜濕度，12 h 光/暗循環(huán)下，自由獲得食物和水。其中，18 只SD 大鼠用于制備祛瘀消腫方含藥血清。本研究獲動物倫理委員會審核備案（動物倫理批號：ZJCLA-IACUC-20020017）。

1.3 主要試劑 胎牛血清（美國Gibco Life Technologies 公司，批號10099-141）；噻 唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）溶液（中國上海Beyotime公司，批號C0009M）；TransZol 試劑盒（北京全式金生物有限公司，批號ET101-01）；DNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara 公司，批號6110A）；熒光定量試劑盒（日本Takara 公司，批號639503）；實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitaive real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）相關(guān)引物（上海生工生物工程股份有限公司）；放射免疫沉淀試驗（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）緩沖液（Thermo Fisher Scientific 公司，批號89901）；BCA 蛋白質(zhì)分析試劑盒（Thermo Fisher Scientific 公司，批號23225）；ECL 化學發(fā)光試劑（中國上海Beyotime 公司，批號P0018AM）；B 細胞淋巴瘤-2 蛋白（B cell lymphoma-2，Bcl2）抗體（批號3498S）、Bcl2 相關(guān)X蛋白（Bcl2 associated X，Bax）抗體（批號2772S）、Toll 樣受體4 蛋白（Toll-like receptor 4，TLR4）抗體（批號14358S）、核因子kappaB 蛋白（nuclear factorkappaB p65，NF-κB-p65）抗體（批號8242S）、核因子κB 抑制劑α 蛋白（nuclear factor-kappa B inhibitor alpha，IκB-α）抗體（批號4812S）和磷酸化IκB-α 蛋白（phosphorylation of IκB-α，p-IκB-α）抗體（批號2859S）（美國Cell Signaling Technology 公司）；磷酸化NF-κB-p65 蛋白（phosphorylation of NF-κBp65，p-NF-κB-p65）抗體（英國abcam 公司，批號ab76302）；小鼠腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-alpha，TNF-α）（批號CSB-E04741m）、白細胞介素-1β（interleukin-1beta，IL-1β）（批 號CSBE08054m）和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）（批號CSB-E04639m）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）kit 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）。

1.4 主要儀器 冷凍高速離心機（美國Thermo 公司，型號：Sorvall Legend Micro）；電泳儀（WIX 韋克斯，型號：EP600）；蛋白轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（WIX 韋克斯，型號：EP600）；多孔分光光度計（LabServ，型號：K3 TOUCH）；倒置熒光顯微鏡（Leica，型號：DMIL LED）；實時熒光定量PCR 儀（貝克曼，型號：ABI7500）；細胞培養(yǎng)箱[Heal Force，型號：HF90（HT）]。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 使用DEME 培養(yǎng)基，在37 ℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)RAW264.7 巨噬細胞，需添加10%胎牛血清。細胞分組：空白對照組（不作LPS 處理+無含藥血清），LPS 處理組（LPS 處理+無含藥血清），低劑量大鼠含藥血清組（LPS 處理+低劑量祛瘀消腫方大鼠含藥血清），中劑量大鼠含藥血清組（LPS處理+中劑量祛瘀消腫方大鼠含藥血清），高劑量大鼠含藥血清組（LPS 處理+高劑量祛瘀消腫方大鼠含藥血清）。

2.2 含藥血清制備 按隨機數(shù)字表法將24 只成年SD 大鼠分為四組，每組6 只：祛瘀消腫方高、中、低劑量組和對照組（不作任何處理）。祛瘀消腫方實驗用藥由項目負責人所在單位中藥制劑室提供，按“人和動物體表面積折算等效劑量比率表”計算，祛瘀消腫方低、中、高劑量組分別含生藥4.5、9.0、13.5 g/kg[5]。每日灌胃1 次，連續(xù)7 d，于末次灌胃后2 h 大鼠股動脈采血。輕輕混勻枸櫞酸鈉溶液（1 mL 枸櫞酸鈉抗9 mL 血液）與采出的血液，防止溶血。3000 r/min 離心5 min，取上清液，56 ℃水浴30 min。0.22 無菌濾器過濾除菌并分裝，于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 MTT 將細胞按1×104個/mL 濃度接種到96 孔板內(nèi)，按照不同的實驗方案處理細胞。再向每個孔中添加MTT 溶液，4 h 后，去除上清液，每孔加入100 μL DMSO，然后使用多孔分光光度計掃描測量570 nm處的吸光度，計算細胞活性。

2.4 qRT-PCR 巨噬細胞培養(yǎng)于6 孔板內(nèi)（1×106cells/孔），待細胞密度達到80%以上后更換含不同劑量大鼠含藥血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，并用LPS刺激10 h，收集細胞。采用TransZol 試劑盒提取細胞總RNA。為檢測凋亡相關(guān)基因（Bax、Bcl2）和TLR4水平，使用DNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，接著使用熒光定量試劑盒進行擴增定量，反應體系和條件按照說明書提供的方案進行。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參基因。相對表達水平均通過2-△△CT計算，△CT=CT目的基因-CTGAPDH。相關(guān)引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 相關(guān)引物序列

2.5 Western blot 用RIPA 緩沖液冰上裂解細胞30 min，并使用BCA 蛋白質(zhì)分析試劑盒測定凋亡相關(guān)蛋白（Bax、Bcl2）和TLR4 信號通路相關(guān)蛋白（TLR4、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65、IκB-α 和p-IκB-α）濃度，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。上樣20 蛋白質(zhì)溶液，80 V 20 min，120 V 60 min，待Marker 完全分離后，再轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h 后，將PVDF 膜與一級抗體在4 ℃下孵育過夜，PBS 清洗3 次，然后在室溫下與次級抗體孵育2 h。配制ECL 化學發(fā)光試劑，X 射線膠片檢測器觀察反應蛋白。一級抗體：Bax（Rabbit，1∶1000），Bcl2（Rabbit，1∶1000），TLR4（Rabbit，1∶1000），NF-κB-p65（Rabbit，1 ∶1000），p-NF-κB-p65（Rabbit，1 ∶1000），IκB-α（Rabbit，1∶1000），p-IκB-α（Rabbit，1∶1000）。

2.6 ELISA 將巨噬細胞按1×106cells/孔的比例接種于6 孔板內(nèi)，待細胞密度達到80%以上后更換含不同劑量大鼠含藥血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，并用LPS 刺激10 h，收集細胞上清，用ELISA 技術(shù)檢測炎癥細胞因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6）的水平，ELISA 具體操作步驟參照小鼠TNF-α、IL-1β 和IL-6 ELISA kit 試劑盒說明書進行。

2.7 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)分析使用GraphPad Prism 7.0 軟件。符合正態(tài)分布的測量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示。采用雙側(cè)t 檢驗來比較兩組數(shù)據(jù)中的個體差異，多組間比較采用單因素方差分析。當P＜0.05時，認為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 祛瘀消腫方對LPS 刺激的RAW264.7 巨噬細胞活性的影響 先用不同劑量（低、中、高）祛瘀消腫方預處理RAW264.7 巨噬細胞12 h，再LPS 刺激10 h，采用MTT 法測定祛瘀消腫方對RAW264.7 巨噬細胞細胞活性的影響。結(jié)果顯示，與LPS 處理組比較，隨著血清中祛瘀消腫方濃度的增加，細胞活性增強（P＜0.05），并呈明顯劑量效應關(guān)系，但細胞活性都低于空白對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 祛瘀消腫方對RAW264.7 細胞活性的影響（%，）

表2 祛瘀消腫方對RAW264.7 細胞活性的影響（%，）

注：空白對照組為RAW264.7 巨噬細胞不作LPS 處理，并添加無含藥血清培養(yǎng)；LPS 處理組為RAW264.7 巨噬細胞LPS 處理，并添加無含藥血清培養(yǎng)；低劑量大鼠含藥血清組為RAW264.7 巨噬細胞LPS 處理，并添加低劑量祛瘀消腫方大鼠含藥血清培養(yǎng)；中劑量大鼠含藥血清組為RAW264.7 巨噬細胞LPS 處理，并添加中劑量祛瘀消腫方大鼠含藥血清培養(yǎng)；高劑量大鼠含藥血清組為RAW264.7 巨噬細胞LPS處理，并添加高劑量祛瘀消腫方大鼠含藥血清培養(yǎng)；LPS 為脂多糖；與空白對照組比較，aP＜0.05；與LPS 處理組比較，bP＜0.05

3.2 祛瘀消腫方減少LPS 刺激的RAW264.7 巨噬細胞凋亡 先用不同劑量（低、中、高）祛瘀消腫方預處理RAW264.7 巨噬細胞12 h，再LPS 刺激10 h，采用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染核測定祛瘀消腫方對LPS 誘導的RAW264.7 巨噬細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，與LPS 處理組比較，細胞凋亡率均有一定程度的下降（P＜0.05），并且呈明顯劑量效應關(guān)系，但細胞凋亡率都比空白對照組要高（P＜0.05），除高劑量大鼠含藥血清組（見圖1A）。qRT-PCR 和Western blot 結(jié)果表明，與LPS 處理組比較，不同劑量（低、中、高）祛瘀消腫方處理的RAW264.7 巨噬細胞抗凋亡蛋白Bcl2 的表達升高，同時，促凋亡蛋白Bax 表達降低。見圖1B和表3。

表3 DAPI 染核活細胞數(shù)統(tǒng)計和Bax 與Bcl2 mRNA 表達水平比較（）

表3 DAPI 染核活細胞數(shù)統(tǒng)計和Bax 與Bcl2 mRNA 表達水平比較（）

注：空白對照組為RAW264.7 巨噬細胞不作LPS 處理，并添加無含藥血清培養(yǎng)；LPS 處理組為RAW264.7 巨噬細胞LPS 處理，并添加無含藥血清培養(yǎng)；低劑量大鼠含藥血清組為RAW264.7 巨噬細胞LPS 處理，并添加低劑量祛瘀消腫方大鼠含藥血清培養(yǎng)；中劑量大鼠含藥血清組為RAW264.7 巨噬細胞LPS 處理，并添加中劑量祛瘀消腫方大鼠含藥血清培養(yǎng)；高劑量大鼠含藥血清組為RAW264.7 巨噬細胞LPS 處理，并添加高劑量祛瘀消腫方大鼠含藥血清培養(yǎng)；LPS 為脂多糖；Bax 為Bcl2 相關(guān)X 蛋白；Bcl2 為B 細胞淋巴瘤-2 蛋白；DAPI 為4'-6-二脒基-2-苯基吲哚；與空白對照組比較，aP＜0.05；與LPS 處理組比較，bP＜0.05

圖1 祛瘀消腫方對LPS 誘導的RAW264.7 巨噬細胞凋亡的影響

3.3 祛瘀消腫方對LPS 刺激的RAW264.7 巨噬細胞炎癥細胞因子釋放量的影響 先用不同劑量（低、中、高）祛瘀消腫方預處理RAW264.7 巨噬細胞12 h，再LPS 刺激10 h。LPS 誘導后，RAW264.7 巨噬細胞TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達顯著增加（P＜0.05）。祛瘀消腫方能顯著抑制TNF-α、IL-1β、IL-6 表達（P＜0.05），抑制作用呈明顯劑量效應關(guān)系。見表4。

表4 祛瘀消腫方對TNF-α、IL-1β、IL-6 表達水平的影響（pg/mL，）

表4 祛瘀消腫方對TNF-α、IL-1β、IL-6 表達水平的影響（pg/mL，）

注：空白對照組為RAW264.7 巨噬細胞不作LPS 處理，并添加無含藥血清培養(yǎng)；LPS 處理組為RAW264.7 巨噬細胞LPS 處理，并添加無含藥血清培養(yǎng)；低劑量大鼠含藥血清組為RAW264.7 巨噬細胞LPS 處理，并添加低劑量祛瘀消腫方大鼠含藥血清培養(yǎng)；中劑量大鼠含藥血清組為RAW264.7 巨噬細胞LPS 處理，并添加中劑量祛瘀消腫方大鼠含藥血清培養(yǎng)；高劑量大鼠含藥血清組為RAW264.7 巨噬細胞LPS 處理，并添加高劑量祛瘀消腫方大鼠含藥血清培養(yǎng)；LPS 為脂多糖；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-1β 為白細胞介素-1β；IL-6 為白細胞介素-6；與空白對照組比較，aP<0.05；與LPS 處理組比較，bP<0.05

3.4 祛瘀消腫方對LPS 刺激的RAW264.7 巨噬細胞TLR4 信號通路的影響 結(jié)果顯示，在LPS 刺激巨噬細胞10 h 以后，TLR4 信號通路中相關(guān)分子TLR4、p-NF-κB-p65 及p-IκB-α 表達水平均顯著升高（P＜0.05），添加祛瘀消腫方血清，能夠抑制表達的增加（P＜0.05）；NF-κB-p65 和IκB-α 表達水平均顯著下降（P＜0.05），添加祛瘀消腫方血清，能夠使表達增加（P＜0.05）。見表5、圖2。

圖2 祛瘀消腫方對TLR4 信號通路相關(guān)蛋白分子的影響

表5 祛瘀消腫方對TLR4 mRNA 相對表達的影響（）

表5 祛瘀消腫方對TLR4 mRNA 相對表達的影響（）

注：空白對照組為RAW264.7 巨噬細胞不作LPS 處理，并添加無含藥血清培養(yǎng)；LPS 處理組為RAW264.7 巨噬細胞LPS 處理，并添加無含藥血清培養(yǎng)；低劑量大鼠含藥血清組為RAW264.7 巨噬細胞LPS 處理，并添加低劑量祛瘀消腫方大鼠含藥血清培養(yǎng)；中劑量大鼠含藥血清組為RAW264.7 巨噬細胞LPS 處理，并添加中劑量祛瘀消腫方大鼠含藥血清培養(yǎng)；高劑量大鼠含藥血清組為RAW264.7 巨噬細胞LPS處理，并添加高劑量祛瘀消腫方大鼠含藥血清培養(yǎng)；LPS 為脂多糖；TLR4 為Toll 樣受體4 蛋白；與空白對照組比較，aP<0.05；與LPS 處理組比較，bP<0.05

4 討論

急性乳腺炎是一種乳腺化膿性疾病。炎癥的初期，巨噬細胞作為效應細胞首先進入被感染區(qū)[6]。研究表明，祛瘀消腫方中的大黃具有抗感染作用，且抗菌譜較廣[7]，可通過抑制環(huán)氧化酶的合成起到抗炎的作用[8]。芒硝外用有清火消腫功效，可用于乳癰及痔瘡腫痛等。兩者合用能起到清熱解毒、抗炎消腫止痛的作用。本研究結(jié)果顯示，祛瘀消腫方增強LPS 抑制的細胞活性，并呈明顯劑量效應關(guān)系。同時，祛瘀消腫方能夠減少LPS 誘導的巨噬細胞凋亡。提示祛瘀消腫方能夠通過調(diào)控巨噬細胞活性和細胞凋亡進而影響炎癥反應。

TNF-α、IL-1β 和IL-6 是目前公認的主要促炎因子，這些因子在生物損傷中發(fā)揮重要作用，通過增加分泌量及瀑布式釋放各種炎癥因子，進而產(chǎn)生炎癥反應[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激RAW264.7 巨噬細胞后，TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達量顯著增加，發(fā)生炎癥反應。祛瘀消腫方處理后，促炎因子表達被顯著抑制，且抑制作用呈明顯劑量效應關(guān)系。

病原微生物刺激機體后，位于細胞膜表面的TLR 受體能夠傳遞刺激信號，激活NF-κB[11-12]。NFκB 復合體被活化后，IκB 被磷酸化，從而釋放出NFκB 異源二聚體，使其進入細胞核內(nèi)，進而啟動TNF-α、IL-1β 和IL-6 等多種炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄[13-14]。在體內(nèi)，NF-κB 主要調(diào)節(jié)炎癥性損傷的發(fā)展、細胞再生能力和細胞凋亡等[15]。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激RAW264.7 后，TLR4、p-NF-κB-p65 及p-IκB-α 表達水平均顯著升高，NF-κB-p65 和IκB-α表達水平均顯著下降，添加祛瘀消腫方血清，使得蛋白表達趨于正常，提示祛瘀消腫方能夠?qū)PS 誘導的RAW264.7 巨噬細胞TLR4 信號通路產(chǎn)生影響。

綜上所述，祛瘀消腫方能夠增強LPS 影響的RAW264.7 巨噬細胞活性，減少細胞凋亡，并且通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路產(chǎn)生抗炎作用。