非酒精性脂肪性肝病的病理改變及相關(guān)分子機(jī)制

高靜雯 劉曉琳 朱錦舟 許春芳

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是高發(fā)的、可進(jìn)展的慢性肝病，影響全球約25%的人口[1]，7% ～ 30%的NAFLD患者可進(jìn)展為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，約9%的NASH患者有進(jìn)展為肝硬化或肝細(xì)胞癌的可能[2]，然而目前尚無特效藥物用于治療NAFLD。2020年初，由22個國家30位專家組成的國際專家小組發(fā)布的有關(guān)代謝相關(guān)脂肪性肝病(MAFLD)新定義的國際專家共識聲明[3]，將NAFLD更名為MAFLD，提出全面、簡便的MAFLD診斷標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)與飲酒量無關(guān)，基于肝活檢組織學(xué)或影像學(xué)，甚至血液生物標(biāo)志物檢查提示存在脂肪肝，并滿足以下三項條件之一：超重/肥胖、2型糖尿病或者代謝功能障礙[3]。盡管更名后MAFLD的診斷標(biāo)準(zhǔn)已從之前的排他性診斷變?yōu)楦鼮榉e極的肯定性診斷，且不考慮飲酒或合并其他肝臟疾病。但在等待世界范圍內(nèi)接受MAFLD這個新術(shù)語和對MAFLD的診斷更加具體前，本文仍沿用NAFLD。基于影像學(xué)檢查敏感性及可行性較低，且目前尚無血液生物標(biāo)志物可替代影像學(xué)檢查，NAFLD的明確診斷仍依賴于肝活檢。近年來國內(nèi)外學(xué)者對NAFLD的病理改變進(jìn)行了大量分子水平的研究，對NAFLD的基礎(chǔ)研究、臨床診療等具有重要意義。

一、正常肝臟組織結(jié)構(gòu)

正常肝臟顏色深紅，血液豐富，質(zhì)地柔軟脆弱。肝臟表面覆以富含彈性纖維的致密結(jié)締組織被膜，肝門部的結(jié)締組織伸入肝實質(zhì)，將實質(zhì)分成許多肝小葉，肝小葉周圍各種管道密集的部位為門管區(qū)。肝小葉為肝臟基本結(jié)構(gòu)。中央靜脈(CV)位于肝小葉中央，沿其長軸分布，周圍肝索和肝血竇呈放射狀分布。肝臟中有兩種主要的細(xì)胞類型：實質(zhì)細(xì)胞和非實質(zhì)細(xì)胞。肝實質(zhì)細(xì)胞(HCs)是肝臟的主要成分，占肝臟總細(xì)胞數(shù)的60%，占肝臟總體積的80%。它們呈放射狀位于肝小葉毛細(xì)血管和肝竇之間，含多種細(xì)胞器及豐富的化學(xué)成分，在能量代謝、解毒和蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。肝竇細(xì)胞為非實質(zhì)細(xì)胞，占肝臟細(xì)胞總數(shù)的35%、體積的17%，包括肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSECs)、庫普弗細(xì)胞(KCs)和肝星狀細(xì)胞(HSCs)等。LSECs是肝臟中數(shù)量僅次于HCs的細(xì)胞類型，參與代謝產(chǎn)物運輸、炎癥和血管生成等生理過程[4]。KCs是肝臟的特化巨噬細(xì)胞，也存在于竇狀細(xì)胞中，參與肝臟損傷的多個病理生理過程[5]。HSCs是位于竇周間隙(space of Disse)的周細(xì)胞，被HCs和LSECs包圍，分泌層黏連蛋白、蛋白多糖和IV型膠原，形成基底膜[6]，HSCs是肝纖維化的主要細(xì)胞類型。NAFLD的發(fā)生、發(fā)展，是上述細(xì)胞結(jié)構(gòu)共同作用的結(jié)果。

二、脂肪變性

NAFLD患者多數(shù)僅僅表現(xiàn)為單純性脂肪肝，即中低倍鏡下超過5%的肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性[7]或肝細(xì)胞中脂質(zhì)含量超過5%[8]，而不伴小葉內(nèi)炎癥、氣球樣變和纖維化(表1)。肝細(xì)胞脂肪變性，最簡單的定義為肝細(xì)胞內(nèi)堆積充滿脂質(zhì)的空泡，在常規(guī)染色的切片上便可看到，外觀為清晰透明的圓形結(jié)構(gòu)。肝細(xì)胞脂肪變性并非NAFLD獨有，也是其他慢性肝病患者最常見的病理表現(xiàn)，因此NAFLD的診斷除了病理表現(xiàn)外，必須結(jié)合臨床病史。NAFLD的脂肪變性通常是大泡狀，有一個大的顯性液泡取代細(xì)胞核并充滿細(xì)胞。在疾病的早期階段，脂肪變的肝細(xì)胞通常呈三帶分布，首先出現(xiàn)于中央靜脈區(qū)，匯管區(qū)較少[9]。隨著脂肪變性的積累，這種帶狀差別消失，脂肪變性的肝細(xì)胞均勻地出現(xiàn)在所有的腺泡區(qū)。當(dāng)肝細(xì)胞伴隨有許多小液泡的泡沫狀，外觀可見微泡狀脂肪變性，它并非一個突出特征，往往出現(xiàn)于更嚴(yán)重的肝病，由線粒體損傷導(dǎo)致，嚴(yán)重時會危及生命[10]。除常規(guī)染色外，肝細(xì)胞脂肪變性在油紅O染色下呈現(xiàn)紅色脂滴，也可以使尼羅紅和中性脂質(zhì)染料在熒光顯微鏡下分別呈現(xiàn)桔紅色和綠色。

NAFLD被認(rèn)為是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)，表現(xiàn)為肥胖、胰島素抵抗(IR)或2型糖尿病和血脂異常[10]。其病理特征表現(xiàn)為肝臟脂質(zhì)累積，主要是甘油三酯(TAG)代謝異常，TAG 約60%來源于循環(huán)中攝取的非酯化游離脂肪酸(NEFAs)、25% 來自脂質(zhì)從頭合成(DNL)、15%來自飲食[11]。TAG去路主要是以極低密度脂蛋白(VLDL)的形式輸出[12]。肝臟通過脂肪酸轉(zhuǎn)運體從外周循環(huán)中攝取脂質(zhì)，脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白和分化簇36參與其中[13]，這些分子受過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)調(diào)控。DNL占肝臟脂肪來源的25%[8]，肝臟以乙酰輔酶A為原料合成脂肪酸，關(guān)鍵酶有乙酰輔酶A羧化酶、脂肪酸合酶、硬脂酰輔酶 A 去飽和酶，受固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白1c的調(diào)控[14]。脂肪酸β氧化受PPARα調(diào)節(jié)，氧化過程依賴線粒體、過氧化物酶體和細(xì)胞色素，脂質(zhì)超載情況下會產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，促進(jìn)脂肪性肝炎進(jìn)展。由于脂肪酸的疏水性，TAG轉(zhuǎn)出依賴水溶性VLDL[15]，VLDL由載脂蛋白B100和酶微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白組成，該過程還涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體[16]。此外，NAFLD較正常人除了脂質(zhì)過量累積之外，其脂質(zhì)組成也有不同，從單純肝臟脂肪變性或非酒精性脂肪肝(NAFL)到NASH，肝臟中的平均TAG/二酰甘油比值呈逐步上升趨勢，游離膽固醇(FC)逐步增加，磷脂酰膽堿(PC)降低，F(xiàn)C/PC比率逐漸增加。NASH中飽和脂肪酸(SFA)/單不飽和脂肪酸(MUFA)+多不飽和脂肪酸(PUFA)比值上升[17]。

NAS為半定量評分系統(tǒng)而非診斷，NAFLD活動度評分(NAFLD activity score，NAS)0～8分，NAS <3分可排除NASH，NAS >4分可診斷NASH，介于兩者之間為NASH可能，規(guī)定不伴小葉內(nèi)炎癥、氣球樣變和纖維化但肝脂肪變性> 33%者為NAFL，脂肪變性不到此程度者僅稱為肝細(xì)胞脂肪變性。

三、脂肪性肝炎

NASH的病理過程包括一系列的代謝紊亂，起于非炎癥性的單純肝臟脂肪變性，以脂肪變性、炎癥和肝細(xì)胞氣球樣變?yōu)樘卣鳎砂榛虿话槔w維化[18]。單純脂肪肝在很大程度上被認(rèn)為是一種良性疾病，進(jìn)展風(fēng)險或臨床影響很小，而NASH進(jìn)展為肝硬化或肝癌的風(fēng)險較大。單純脂肪肝與NASH的鑒別診斷在臨床實踐中具有重要意義，臨床試驗新藥療效往往以炎癥消退為關(guān)鍵結(jié)局。

脂肪性肝炎表現(xiàn)為實質(zhì)炎癥和門脈炎癥。鏡下，實質(zhì)炎癥可見巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤在肝細(xì)胞板，伴或不伴少量中性粒細(xì)胞。匯管炎癥可見門靜脈區(qū)域內(nèi)有淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤。此時可以通過標(biāo)記CD68或F4/80來輔助觀察炎癥情況[19-20]。除鏡下可見的炎癥細(xì)胞外，參與肝臟炎癥反應(yīng)的還有諸多促炎因子。在脂肪性肝炎小鼠模型中，KCs促進(jìn)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和C-C基序趨化因子配體2(CCL2)的產(chǎn)生，參與疾病的早期發(fā)生[21]。同時CCL2及受體CCR2參與骨髓單核細(xì)胞來源巨噬細(xì)胞的招募[22]。KCs分泌的淋巴結(jié)樣受體蛋白3 (NLRP3)炎性小體，參與炎癥和纖維化，其分泌的白介素-1β(IL-1β)，可促進(jìn)脂肪性肝炎的進(jìn)展[23]。參與脂肪性肝炎的淋巴細(xì)胞由輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和B淋巴細(xì)胞組成。Th1分泌的γ-干擾素(IFN-γ)和Th17分泌的白細(xì)胞介素-17(IL-17)會加劇炎癥和纖維化[24]。細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞，可促進(jìn)IFN-γ和TNF-α產(chǎn)生，加速脂肪性肝炎的進(jìn)展，甚至參與到隨后的肝細(xì)胞癌(HCC)[25]。B2細(xì)胞可激活T細(xì)胞分泌促炎因子(TNF-α和IL-6)，促進(jìn)IR和肝纖維化[26]。因此相關(guān)炎癥因子可作為評估NASH嚴(yán)重程度的生物標(biāo)記物或探索NASH發(fā)病機(jī)制的工具。

單憑炎癥的嚴(yán)重程度不能幫助區(qū)分單純脂肪肝和脂肪性肝炎，肝細(xì)胞氣球樣變?yōu)橹拘愿窝椎奶卣餍约?xì)胞病變，也是診斷和評估NAFLD活動程度的必要因素。發(fā)生氣球樣變的肝細(xì)胞蘇木精-伊紅(HE)染色鏡下觀察比正常肝細(xì)胞大，細(xì)胞質(zhì)不規(guī)則聚集和滯留，其間有不規(guī)則半透明視覺上清晰的間隙。Mallory小體也是脂肪性肝炎的典型病理表現(xiàn)，但不是脂肪性肝炎診斷的必要條件，表現(xiàn)為不規(guī)則、密集嗜酸、繩狀細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物，它們與細(xì)胞核密切相關(guān)，或作為一側(cè)不規(guī)則的包涵體，或像項圈一樣圍繞著細(xì)胞核。氣球樣肝細(xì)胞不易找尋，當(dāng)Mallory小體出現(xiàn)在氣球樣變肝細(xì)胞內(nèi)時可幫助識別。此外，Mallory小體由角質(zhì)蛋白8和18(K8/18)[27]過度磷酸化和錯誤折疊的纖維層組成，而氣球樣變肝細(xì)胞K8/18缺失，泛素和K8/18的雙重免疫染色[28]，有助于識別Mallory小體和氣球樣變肝細(xì)胞。

四、纖維化

與其他慢性肝病類似，脂肪性肝炎或單純脂肪肝患者也會發(fā)生肝纖維化，甚至在發(fā)現(xiàn)脂肪性肝炎時，已存在一定程度的纖維化。多數(shù)研究表明，纖維化是肝臟相關(guān)死亡率的主要因素[29]。不同于慢性病毒性肝炎和膽汁淤積性肝炎，NASH纖維化始于中央靜脈區(qū)而非門脈區(qū)。膠原沉積于HCs和LSECs之間的竇周間隙，形成纖維網(wǎng)絡(luò)，包圍并隔離了從末端肝小靜脈延伸出來的單個HC[10]。纖維化早期可以借助特殊染色觀察，如Masson染色、天狼星紅染色、van Gieson染色和reticulin染色，α-SMA免疫染色，或者測定肝組織中羥脯氨酸、膠原蛋白含量來判斷有無肝纖維化發(fā)生。隨著纖維化進(jìn)展，纖維網(wǎng)格增厚和肝細(xì)胞消失，其次門脈周圍纖維化、門脈周圍肝細(xì)胞被膠原纖維包裹，接著橋接纖維化，從門脈區(qū)到鄰近的終肝小靜脈，沿中央靜脈區(qū)纖維性連接，甚至發(fā)生肝硬化，此時常規(guī)染色便可觀察到[10](表2)。研究發(fā)現(xiàn)，膽管損傷也會促進(jìn)肝臟纖維化進(jìn)展，此時K7和 K9的免疫染色有助于觀察膽管損傷[30]。

NAFL發(fā)展為NASH和纖維化與一系列肝臟損傷有關(guān)，這些損傷由脂肪毒性、氧化應(yīng)激、一氧化氮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥和凋亡引起，并依次發(fā)生在不同的肝臟細(xì)胞中，最終導(dǎo)致肝臟再生和纖維化的激活，膠原蛋白增多和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積，促進(jìn)肝纖維化和肝硬化。肝轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β)是最有效的纖維化細(xì)胞因子，是HSCs激活和肝纖維化的關(guān)鍵驅(qū)動因子[29]。此外，HCs和KCs等細(xì)胞及其相關(guān)的細(xì)胞因子，也參與肝臟纖維化的進(jìn)展。

五、其他病理表現(xiàn)

NAFLD患者的肝臟活檢中還可以看到巨線粒體、胞質(zhì)糖原病、糖原核、脂肪肉芽腫和鐵沉積等。其中，糖原性肝細(xì)胞病需要注意，因為糖原性肝細(xì)胞很常見，可以模仿氣球樣變肝細(xì)胞或使其難以識別。在糖原病中，肝細(xì)胞彌漫增大，呈蒼白色，胞漿稀少，細(xì)胞膜突出。糖原性肝病是一種急性形式的糖原病，與1型糖尿病和高轉(zhuǎn)氨酶水平有關(guān)，一旦血糖水平控制住即可消失[31]。在NAFLD均可見巨線粒體，它們是卵球形嗜酸性、高碘酸-希夫反應(yīng)陰性的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物[32]。糖原核是NAFLD和NASH中常見的發(fā)現(xiàn)，并與糖尿病相關(guān)[10]。脂肪肉芽腫可見于NAFLD和其他慢性肝病，由于它們可能位于終末肝小靜脈附近，并與纖維化有關(guān)，因此在疾病早期可引起混淆，在評估NAFLD纖維化時，應(yīng)考慮與脂肪肉芽腫相關(guān)的纖維化。約1/3的NAFLD患者表現(xiàn)出鐵超載的跡象，Nelson等[33]在849例患者的隊列研究中發(fā)現(xiàn)鐵沉積與NAFLD組織學(xué)嚴(yán)重程度相關(guān)。鐵超載、脂質(zhì)過氧化等引起鐵死亡，鐵死亡抑制劑，包括鐵抑素-1、自由基捕獲抗氧化劑和脂蛋白抑素-1，能夠緩解NAFLD動物模型的炎癥、纖維形成和肝損傷[34]，普魯士藍(lán)染色可以通過簡單的半定量評分來評估肝鐵素沉著[35]。雖然目前這些表現(xiàn)在NAFLD的診斷中不充分也不必要，但有助于全面了解NAFLD的發(fā)病機(jī)制。

正確且充分地認(rèn)識NAFLD的病理特征及背后的分子機(jī)制，是研究、診斷、治療疾病的理論基礎(chǔ)，相信在日新月異的科技發(fā)展中，對NAFLD的診斷會更加準(zhǔn)確，對NAFLD的防治會更加科學(xué)合理。