生物檢材中氯胺酮及其代謝物的分析研究進展

游雙銀，馬賽歌，王小怡，李夢陽

（河南金劍司法鑒定中心，河南洛陽 471000）

近年來，我國社會發(fā)展過程中，經(jīng)常會出現(xiàn)氯胺酮濫用的問題，導(dǎo)致社會治安以及經(jīng)濟建設(shè)受到了一定影響。毒品濫用的行為也越來越趨向于年輕化以及男女平均化。根據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，毒品濫用中氯胺酮的比例高達20%，短期內(nèi)使用氯胺酮會導(dǎo)致語言系統(tǒng)混亂，引發(fā)人類幻覺，長期服用會造成記憶力減退和認知能力障礙等問題產(chǎn)生，造成心肺功能損害?，F(xiàn)階段，缺乏對氯胺酮免疫測定的有效方式，因此快速準(zhǔn)確的檢測方法，是我國發(fā)展建設(shè)之中所需要關(guān)注的重點內(nèi)容。在氯胺酮及其代謝物的檢測過程中，存在著多種多樣的檢測技術(shù)，本文對氯胺酮檢測方式的優(yōu)點以及弊端進行了分析，希望能夠為相關(guān)工作者提供一些建議和幫助。

1 氯胺酮

氯胺酮又被稱為消旋2環(huán)己酮，是苯環(huán)己哌啶衍生物，是一種非巴比妥類靜脈全麻藥，在醫(yī)療上主要應(yīng)用于術(shù)前肌肉放松以及全身麻醉和麻醉輔助之中。在氯胺酮臨床應(yīng)用過程中，患者會出現(xiàn)惡心，情緒焦躁以及幻覺等副作用，長期使用會導(dǎo)致患者出現(xiàn)精神依賴。鹽酸氯氨酮是白色結(jié)晶粉末，可以溶于水，在乙醇中也能夠出現(xiàn)微微溶解的情況。氯胺酮是N-甲基-D 天門冬氨酸受體拮抗劑，因此常用于癲癇病的治療，氯胺酮有兩種旋光異構(gòu)體，商業(yè)產(chǎn)品是兩者的混合物。根據(jù)實驗研究顯示，右旋氯胺酮的麻醉力度是左旋利安銅的四倍，并發(fā)癥產(chǎn)生的幾率相較于左旋氯氨銅和消旋氯胺酮來說更低。

2 檢材的采取和預(yù)處理

2.1 檢材的采取

在氯胺酮進入人體之后，肝臟會產(chǎn)生代謝為去氯鉀、氯胺酮、脫氫去甲氯胺酮和其他代謝物，進一步羥基化，形成葡萄糖酸結(jié)合物，90%會從腎臟排出，5%會從糞便排出，4%會隨尿液排出?；诖?，血液以及尿液生物檢材中，檢測到去甲氯胺酮、脫氫去甲氯胺酮同樣也可以當(dāng)作患者吸食氯胺酮的有效證據(jù)。在血液采集過程中，需要避免污染以及變質(zhì)問題的產(chǎn)生，尿樣采取需要保證不會被水稀釋或者摻假。

人體的唾液、汗液、指甲、嘔吐物和其他組織器官等，都可以用于氯胺酮以及代謝物的檢測之中。根據(jù)實驗過程發(fā)現(xiàn)，較為常見的檢材是血液以及尿液，這兩者萃取的效果最好。這種萃取方式以及檢材方式，一般被用于近期吸毒者的檢測之中，能夠有效檢測出是否存在毒品濫用的行為，如果尿樣分析出現(xiàn)超時的問題，就可以利用毛發(fā)進行檢測?，F(xiàn)階段，國內(nèi)外毒物分析工作者對于毛發(fā)分析的工作十分重視，并將其應(yīng)用到法庭檢測的判斷之中。和傳統(tǒng)的生物檢材相比，毛發(fā)的收集較為便利，并且不會侵犯受檢人員的隱私，能夠有效避免作假、監(jiān)測時間過長的問題產(chǎn)生，有利于檢材穩(wěn)定性，保存起來也較為容易。

2.2 檢材的預(yù)處理

利用離心的方式取血樣的上清液，可以用于濫用物質(zhì)的提取以及檢測之中。對于尿樣的預(yù)處理需要經(jīng)過酸堿酶解，利用游離出濫用物質(zhì)的原型物或者代謝物等，使用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對尿液中的氯胺酮和其代謝物進行判斷，先將樣品通過口徑0.22μm 的聚偏氟乙烯濾膜過濾，然后使用大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜以及電噴霧質(zhì)譜的方式進行評判，根據(jù)結(jié)果分析顯示，APCI 的離子化效率高于氯胺酮、去甲氯胺酮。檢測限度為0.50、0.95、0.48以及0.33ng/mL。使用高效液相色譜法對血漿中的氯胺酮和丁派卡因含量進行檢測，將0.5的血漿使用反向萃取技術(shù)進行有效提取，這種萃取方式較為簡便以及快速。使用色氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對全血中氯胺酮的含量進行檢測，限度為0.05μg/mL，在0.1～5.0μg/mL 呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。這種方法已經(jīng)被廣泛用于毒品以及臨床分析過程之中。

在對毛發(fā)、指甲以及肝臟等檢材進行收集之后，需要進行洗滌以及消化等預(yù)處理工作，進行提取，針對無法及時檢測的樣本，需要保存在溫度為-10℃以下的冰箱之中，唾液樣品需要放入低溫冰箱中過夜，讓其蛋白失去黏性，利用離心的方式求取上清液進行檢測。

在消化前，需要使用洗滌劑以及超聲波對頭發(fā)進行處理，這樣能夠有效去除頭發(fā)表面的油脂、汗液和吸附其中的濫用物質(zhì)。常用的洗滌劑有0.05%二氯甲烷或者0.1%十二烷基磺酸鈉溶液、甲醇等，針對毛發(fā)洗滌、水解和提取時需進行比較，0.1%的十二烷基磺酸鈉、0.1%洗潔精、蒸餾水、丙酮洗滌能夠有效對焊液產(chǎn)生的污染進行去除，洗滌之后的毛發(fā)需要加入0.1mol/L 的HCI，在15度水域中過夜水解后進行提取，使用GC-MS 檢測腦中的氯胺酮含量，將用乙烷和乙醚進行萃取，能夠得到100%的回收率，檢出量為10ng。

3 樣本的提取

3.1 液-液萃?。↙LE）和液相微萃取（LPME）

在毒品實驗室中，較為常用的提取分離方法為液-液萃取法，此種方法具有操作簡單、重復(fù)性較好的優(yōu)勢，因此一般被用于毒品的提取之中，樣品中加入內(nèi)標(biāo)并且進行簡化，尿樣中加入少量的NACl 固體讓其進行飽和，能夠有效減少溶質(zhì)在水中的溶解速度，進一步提升提取的效率。乙酸乙酯一般被用為提取劑，使用的液-液萃取方法能夠?qū)⒂袡C層揮發(fā)制干，殘渣在鹽酸中融入用正己烷萃取，這樣能夠有效避免基質(zhì)的影響，并且獲得較高的回收率，一般來說回收率能夠高達95%。但是任何事情都存在一定的兩面性，如果使用乙醚、氯仿等非極性有機溶劑萃取生物樣品，以及其他復(fù)雜樣品中微量毒品時，會導(dǎo)致一些內(nèi)源性組分，比如蛋白質(zhì)、脂肪、組胺類將共萃入有機相，對樣品中微量毒品檢驗的效果產(chǎn)生一定的影響。此外此種方式較為容易乳化，導(dǎo)致提取時間過長，影響目標(biāo)提取物的提取效果。除此之外，LLE 所用有機溶性毒性較大，對檢驗人員的身體健康會造成一定的威脅，因此現(xiàn)階段逐步減少了對比方法的應(yīng)用。

LPME 是將一定長度的中空纖維膜的一端插在微量進樣器針頭上，將膜的另一端進行封閉，在萃取前將中空纖維膜接入到作為接受項取劑的有機溶液之中，讓有機溶液能夠被固定在中空纖維膜的微孔之中。在LPME 中代取物能夠利用中空纖維微孔不溶于水的有機接受項，而進入到注射器之中。實現(xiàn)了液-液-液三相微萃取以及高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)測定尿樣中的安非他明以及氯胺酮的方法，對萃取時間，料液、pH 和攪拌速度的影響進行了充分分析，并最終得到了萃取溶液是300μL 甲苯尿液，pH 是1.0μL的0.1mol/LHCl，攪拌速度在600r/min，萃取時間在10min 左右的條件。在該條件之中，氯胺酮的線性范圍在0.01～5μg/mL。對比標(biāo)準(zhǔn)差來看偏差。不高于2%監(jiān)測均線是5ng/mL，實驗室使用一次液-液-液三項微萃取對尿液進行處理，能夠有效消除其中的干擾成分，對安非他明以及氯胺酮進行分析，并且有機溶液消耗較少、萃取效率較高、提升了該方式的靈敏性。

3.2 固相萃?。⊿PE）

SPE 是指利用溶劑和固定相之間對被萃取化合物的選擇性和分析系數(shù)性的差距，促進目標(biāo)化合物從檢材混合中分離出來的提取技術(shù)，并且廣泛用于毒品提取以及凈化之中，與LLE 不同的是SPE 的選擇性較強，并且使用的溶劑量較少，不會出現(xiàn)乳化的問題，能夠進行批量化的處理，一般會用于大量樣品的分析以及測定之中。用SPE-LC-MS 結(jié)合數(shù)據(jù)分析的處理系統(tǒng)，對尿液大批量毒品進行半定量分析鑒定，樣品使用SPE C18自動固相萃取，然后進行測定，10min之后數(shù)據(jù)庫能夠自動儲存結(jié)果并且給出報告。該實驗對分析結(jié)果精準(zhǔn)性提升有重要的促進意義，并且減少了數(shù)據(jù)處理需要耗費的時間和數(shù)據(jù)之間產(chǎn)生的錯誤問題，適合工作量較大的實驗室毒品檢測以及常規(guī)檢測，GS 法快速對尿樣中存在的氯胺酮和其代謝物進行檢測，萃取率高達95%，并且具有靈敏度、準(zhǔn)確性較高的特征，使用SPE 柱對尿樣進行檢測，然后用陽離子化學(xué)電離氣質(zhì)色譜法對尿液中的氯胺酮以及去甲氯胺酮含量進行衡量，濃度在86、430、18、16/ml時，二者的回收率在53～79以及45～14之間，檢出限在25ng/ml。一般來說，國外，監(jiān)測技術(shù)大多是固相萃取以及自動固相萃取技術(shù)，具有疏水官能團和交換官能團的混合性，SPE 柱固相萃取肝中的嗎啡回收率可以高達90%，對尿液中的氯胺酮以及去甲氯胺酮進行萃取，回收率在70%左右。

3.3 固相微萃?。⊿PME）和頂空固相微萃取（HSSPME）

在一定溫度中，將萃取纖維頭放置在密閉容器中的樣品上方，一定時間后直接進行取樣，這種方式能夠有效檢測揮發(fā)性物質(zhì)，并且速度較快，雜質(zhì)較少。毛發(fā)中親脂性毒品比如尼古丁、甲基苯丙胺衍生物以及氯胺酮等檢測方法，能夠?qū)υ诿l(fā)中的可卡因、氯胺酮以及毒品，能夠有效進行檢測。固相微萃取色相色譜法結(jié)合氮磷檢測器，可快速對尿樣中的氯胺酮進行檢測。使用聚二甲基硅氧烷SPME 萃取頭頂空萃取10min，尿液之中加入1.0μg 氯胺酮，平均回收率在102.6%，檢測限在1.13mg/mL，具有操作簡單并且速度較快的特征。

3.4 微波輔助萃?。∕AE）

微波輔助萃取是一種新型的高效分離技術(shù)，利用微波熱效應(yīng)的原理實現(xiàn)對樣品的有機溶解進行加熱，能夠讓目標(biāo)組分從樣品中進行分離。和傳統(tǒng)的提取技術(shù)相比，該項技術(shù)萃取的速度較快，并且消耗的成本較低，不會出現(xiàn)污染問題，樣品萃取凈化技術(shù)發(fā)展速度以及現(xiàn)代化技術(shù)設(shè)備不斷更新升級的過程之中，利用MAE 方式進行檢測，可對尿樣中的毒品進行有效提取。

4 檢測方法

4.1 薄層色譜分析法（TLC）

薄層色譜分析法是法庭之中檢測毒物的有效定性分析方法，能夠?qū)⒖梢傻亩酒坊蛘咛崛艋臋z材，在TLC 板上進行點樣，并且將標(biāo)準(zhǔn)品作為對照展開顯色之后，將測定被檢物的Rf 值和標(biāo)準(zhǔn)樣品進行比對，能夠?qū)崿F(xiàn)定性分析的需要。該技術(shù)一般應(yīng)用在血清、血液、尿液、可疑藥物粉末以及藥片中未知藥物的檢測。TLC 對氯胺酮和其代謝含量進行檢測，能夠得到254ng/mL 的精準(zhǔn)檢測結(jié)果。但是薄層色譜操作起來較為困難，需要消耗的時間也較長。因此一般被用于法庭毒物檢測之中。

4.2 氣相色譜法（GC）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）

GC 分離效果較好，靈敏度較高，分析速度也很快，可以和電子捕獲檢測器火焰離子化驗檢測器和MS 等多種檢測器綜合運用，但是一般來說，GC 的監(jiān)測方法應(yīng)用于具有較強的熱穩(wěn)定性能以及揮發(fā)速度較快的特征，物質(zhì)監(jiān)測過程中，大多數(shù)物品的監(jiān)測可以使用氣相-色譜法進行監(jiān)測。GC-MS 是一種較為成熟的定型技術(shù)，一般使用免疫法對陽性結(jié)果樣品進行分析。一般應(yīng)用于個別急性大的毒品利用衍生化處理，也可以使用氣相色譜進行分析。氯胺酮GC 或者MS 進行檢測時，色譜行為檢測的程度較差，柱后衍生對其色氣相色譜行為提升有重要的幫助性作用。

4.3 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜一般用于熱穩(wěn)定性較差，揮發(fā)能力較差并且分子量較大的毒品分離檢測過程中，但是卻由于缺乏高靈敏度的通用型檢測器，因此在實驗過程中會消耗數(shù)量較多的有機溶液，針對分子質(zhì)量在2 000以上的物質(zhì)之中，檢測效率降低，分離速度也較慢。

5 結(jié)束語

現(xiàn)階段我國法治建設(shè)在不斷完善發(fā)展的過程之中，在此背景下，想要改善現(xiàn)階段存在的販毒問題，提升我國環(huán)境建設(shè)以及社會建設(shè)質(zhì)量，就需要加強毒品工作的重視。這一時期，我國發(fā)展的進程之中對微量毒品的監(jiān)測生物檢材提取分離檢驗的要求較高，在凈化提取過程之中，液-液萃取存在一系列的弊端，因此使用效率不斷下降。在提取凈化過程之中，較為常見的應(yīng)用方式是固相萃取，頂空固相微萃取的使用較為簡單并且便捷，所需樣品數(shù)量較少，不用進行衍生化，因此毒品分析過程之中也該項技術(shù)成為了應(yīng)用較廣的技術(shù)。微波輔助萃取技術(shù)，是近兩年較為常見的檢測技術(shù)，具有檢測速度快、提取效率高的特征，在檢測方法上，氣相色譜以及液相色譜的檢測結(jié)果精準(zhǔn)度最高，一般與質(zhì)譜進行聯(lián)用。應(yīng)加強對于靈敏度較高、特異性較好的產(chǎn)品的深入分析研究，并且使其進行快速檢測，并且促進其向自動化分析的方向所轉(zhuǎn)變，為我國毒品檢測發(fā)揮一定的幫助。