高通量測序用于結(jié)核病診斷的研究進(jìn)展

王 璽 綜述，蘭 箭 審校

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 400000

結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌感染所致的疾病，人型結(jié)核菌為人類主要致病型。結(jié)核分枝桿菌可以感染機(jī)體除毛發(fā)、指甲以外的任何部位，其中以肺部感染最常見。結(jié)核病位列全球第13大死因，據(jù)《2021全球結(jié)核病報(bào)告》顯示，2020年全球結(jié)核潛伏感染人群接近20億，新發(fā)患者987萬，發(fā)病率為127/10萬；我國估算的新發(fā)患者數(shù)為84.2萬，發(fā)病率為59/10萬，在30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家中我國高居第2位，僅次于印度[1]。目前結(jié)核病的輔助診斷方法很多，涉及病原學(xué)、影像學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)以及病理學(xué)等，但診斷效能欠佳。結(jié)核菌培養(yǎng)是確診結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，但靈敏度僅為45%～60%[2-4]，臨床診斷往往需要聯(lián)合多種方法進(jìn)行檢測分析，并常常采取診斷性抗生素治療方式來輔助臨床判斷，導(dǎo)致結(jié)核病診斷的延誤和治療的延后，因此提高檢測方法的靈敏度和特異度對結(jié)核病的防控意義重大。NGS采用基因測序方法能快速檢出病原微生物，本文就NGS應(yīng)用于結(jié)核病診斷的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 NGS概述

基因組測序共經(jīng)歷了三代技術(shù)發(fā)展。一代測序的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確度高、容易掌握，缺點(diǎn)是耗時(shí)長、過程復(fù)雜、費(fèi)用高。二代測序，也就是NGS，它以循環(huán)微陣列法為原理，包括樣本處理、核酸提取、基因文庫生成和生物信息學(xué)途徑分析幾個(gè)步驟[5]。NGS一次能對高達(dá)幾百萬條的DNA分子測序，使物種的基因組或轉(zhuǎn)錄組測序變得容易。NGS用于病原學(xué)的檢測包括靶向下一代測序(tNGS)、宏基因組下一代測序(mNGS)、全基因組測序(WGS)等。tNGS是對富集后的目的DNA序列進(jìn)行高通量測序，只能用于核酸序列已知的病原體的檢測；mNGS是直接提取樣本中全部微生物群落基因的DNA進(jìn)行測序，理論上一次性可以檢出全部的微生物序列；WGS是對整個(gè)基因組進(jìn)行檢測，可以檢測編碼區(qū)、非編碼區(qū)、調(diào)控區(qū)，以及一些結(jié)構(gòu)變異。相對于一代測序，NGS的準(zhǔn)確性略有降低，但通量高、耗時(shí)短、成本低，更適用于臨床使用。三代測序是以單分子測序技術(shù)為基礎(chǔ)的新一代測序方式，不需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，主要分為單分子熒光測序技術(shù)和納米孔測序技術(shù)，近年來三代測序逐漸控制了成本，但在精度上仍需進(jìn)行更多的研究與驗(yàn)證[6-7]，目前較少應(yīng)用于臨床。

NGS包括DNA測序和RNA測序，DNA測序可檢測除RNA病毒以外的病原微生物，RNA測序可檢測RNA病毒，同時(shí)還可以反映病原微生物轉(zhuǎn)錄活性[8]。mNGS可以檢測來自人類、動(dòng)物、食品和環(huán)境的各種標(biāo)本，在不預(yù)先了解病原體類型的情況下能直接檢出所有微生物序列，包括病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲。由于不同病原微生物有不一樣的生長條件，常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)往往不能培養(yǎng)出標(biāo)本中的所有病原微生物，所以NGS將來有可能成為微生物實(shí)驗(yàn)室的主導(dǎo)技術(shù)[9-10]。NGS還能對艾滋病、結(jié)核病、流感、脊髓灰質(zhì)炎、瘧疾等傳染性疾病進(jìn)行監(jiān)測[11-12]。多項(xiàng)研究指出，在感染性疾病中mNGS的靈敏度高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法[13-14]，尤其是用于血液、支氣管肺泡灌洗液和痰液標(biāo)本的檢測[15]。在肺部感染性疾病的病原學(xué)檢測中，NGS比傳統(tǒng)方法檢測范圍更廣、檢出率更高、耗時(shí)更短，且能明顯提高了真菌感染的診斷率[16-18]。相較于普通病原菌，結(jié)核分枝桿菌更難培養(yǎng)，因此NGS用于檢測結(jié)核分枝桿菌的檢測是極具前景的。

2 常用的結(jié)核病檢測方法

目前關(guān)于結(jié)核病的檢測方法很多，包括涂片法、培養(yǎng)法、病理活檢、影像學(xué)檢查以及結(jié)核分枝桿菌核酸檢測、純化蛋白衍生物(PPD)試驗(yàn)、γ干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)、結(jié)核抗體檢測等，確診結(jié)核病常常需要上述檢測方法的聯(lián)合使用[19]。

涂片法的依據(jù)是結(jié)核分枝桿菌的抗酸特性，是指將樣本進(jìn)行涂片、染色，根據(jù)染色情況判定結(jié)果。該法簡便、快捷，但靈敏度受樣本質(zhì)量的影響大，且不能鑒別結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌[20]。培養(yǎng)法特異度高，但由于結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，不管是羅氏固體培養(yǎng)基(2～4周)還是改良液體培養(yǎng)基(1～2周)，都無法避免培養(yǎng)周期長的問題，不能快速得到結(jié)果[19]。陽性培養(yǎng)標(biāo)本還需要進(jìn)一步進(jìn)行耐藥表型分析，即結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)(DST)，以了解結(jié)核分枝桿菌是否存在耐藥，但需耗時(shí)2～4周。在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，培養(yǎng)法的低效能限制了其在早期診斷中的臨床應(yīng)用[12]。病理活檢也是診斷結(jié)核病的方法之一，結(jié)核病的病理改變表現(xiàn)為上皮細(xì)胞樣肉芽腫性炎，光學(xué)顯微鏡下可見大小不等、數(shù)量不同的壞死性和非壞死性的肉芽腫，同時(shí)需要在病變區(qū)找到病原菌，并采用抗酸染色方法來確定[19]。但部分患者活檢難度大，且增加了診治風(fēng)險(xiǎn)，從而限制了臨床上的廣泛開展。胸部X片是臨床篩查肺結(jié)核的最常用方法，但容易漏檢，相比之下，胸部CT可以發(fā)現(xiàn)更小、更隱匿的病灶。肺結(jié)核病灶具有多形性的特點(diǎn)，容易出現(xiàn)空洞、硬結(jié)及鈣化灶，常位于上葉尖后段及下葉背段，但影像學(xué)不典型者也并非罕見，常常需要與其他病原菌感染相鑒別，因此影像學(xué)檢查只能作為診斷結(jié)核的輔助證據(jù)。

核酸檢測技術(shù)的發(fā)展在一定程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)病原學(xué)檢查的局限性，靈敏度和特異度均有所提高。常用方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(LAMP)、利福平耐藥快速檢測(Xpert MTB/RIF)等。LAMP無法對檢測結(jié)果進(jìn)行耐藥性判斷[21]，而Xpert MTB/RIF可同時(shí)用于結(jié)核病的診斷和耐利福平結(jié)核菌的判斷[1]。LAMP與Xpert MTB/RIF在結(jié)核病的診斷中有較好的一致性，明顯優(yōu)于涂片法[22-23]；在臨床診斷患者中，兩者靈敏度與培養(yǎng)法接近，特異度高于培養(yǎng)法；但在有抗結(jié)核活性藥物暴露史的患者中，兩者靈敏度優(yōu)于培養(yǎng)法[22]?？菇Y(jié)核藥物通過抑制細(xì)胞壁、蛋白質(zhì)、酶的合成等原理降低結(jié)核分枝桿菌菌株活性[24-27]，而核酸可以較長時(shí)間保留在死亡菌株中，同時(shí)也說明分子生物學(xué)方法不能替代結(jié)核菌培養(yǎng)用于藥物療效監(jiān)測。由于LAMP操作簡單、成本低，當(dāng)Xpert MTB/RIF由于條件限制不能開展時(shí)，LAMP可以取代涂片顯微鏡檢查，提高結(jié)核病診斷能力[22]。此外，核酸檢測技術(shù)還應(yīng)用于耐藥結(jié)核的基因型分析，包括基于反向雜交的線探針分析(LPA)和半定量Xpert MTB/RIF[28]，但臨床上的應(yīng)用不如表型分析廣泛。

結(jié)核分枝桿菌感染人體后會(huì)發(fā)生一系列免疫反應(yīng)，基于此的檢驗(yàn)方法有PPD試驗(yàn)和IGRA。PPD試驗(yàn)是基于Ⅳ型超敏反應(yīng)的皮膚試驗(yàn)，根據(jù)硬結(jié)及水泡的情況在試驗(yàn)后72 h判定結(jié)果，該法干擾因素較多，有出現(xiàn)假陽性或假陰性可能，且不能區(qū)分活動(dòng)性感染與潛伏感染，靈敏度較低。IGRA包括結(jié)核菌感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，它們都有很高的靈敏度，且T-SPOT法特異度稍高于ELISA法，且同樣不能區(qū)分活動(dòng)性感染與潛伏感染[29]。血清結(jié)核分枝桿菌抗體在體內(nèi)存在時(shí)間很長，即使結(jié)核病痊愈后仍可以檢測到，盡管檢測敏感度在70%左右，但并不能作為判斷結(jié)核病活動(dòng)性的指標(biāo)[30]。

3 NGS在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用

3.1NGS檢測結(jié)核分枝桿菌 多項(xiàng)研究報(bào)道，NGS檢測結(jié)核分枝桿菌的特異度高達(dá)98%以上，而靈敏度明顯優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)法和Xpert MTB/RIF[31-33]。NGS在不同部位來源的樣本檢測中也存在差異，肺樣本的檢測靈敏度明顯高于肺外樣本，分別為58.5%和43.1%；痰液檢測靈敏度為52.3%，略低于培養(yǎng)法的60.9%；但在培養(yǎng)陰性的支氣管肺泡灌洗液和漿膜腔液體樣本中，NGS陽性檢出率仍有28.8%，提示NGS有利于菌陰結(jié)核病的診斷[32]，且NGS對肺外結(jié)核的診斷效率仍高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法和Xpert MTB/RIF[32-36]。NGS檢測需要32～36小時(shí)，液體培養(yǎng)基培養(yǎng)法需要14～55天，雖然涂片法只需1～2天，但它的靈敏度及特異度均不如NGS，因此NGS有利于活動(dòng)性肺結(jié)核的早期診斷[32]。

WGS通過檢測單核苷酸多態(tài)性(SNP)的多寡，可以用來評估和鑒別結(jié)核病患者是否合并感染、復(fù)發(fā)或者再感染。如果變量位置顯示具有不同等位基因的群體共存，則可以在大量測序數(shù)據(jù)中檢測到合并感染[37-38]。對復(fù)發(fā)結(jié)核患者前后兩次的標(biāo)本進(jìn)行檢測，也可判斷是復(fù)發(fā)還是再次感染。一項(xiàng)摩爾多瓦的研究對患者進(jìn)行基因測序顯示，在多個(gè)耐藥結(jié)核樣本之間的SNP差異不超過10個(gè)，從基因?qū)用孀C實(shí)了人與人之間的傳播[39]。痰液和支氣管肺泡灌洗液都可以作為NGS檢測的樣本，但痰液更容易被污染，在變異分析中會(huì)引入更大的偏差，出現(xiàn)不真實(shí)的SNP。對于痰稀少的疑似肺結(jié)核病例，支氣管肺泡灌洗液或肺組織是更好的結(jié)核分枝桿菌檢測標(biāo)本，但這類標(biāo)本都包含大量的人類基因，需進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制以減少宿主基因組的影響[40]。由于部分標(biāo)本的黏液含量高，結(jié)核分枝桿菌可能發(fā)生聚集而分布不均，導(dǎo)致結(jié)核菌計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確，因此樣本需要預(yù)處理，通過耗盡其他細(xì)胞DNA來均化和富集結(jié)核桿菌，以提高NGS診斷率[41]。除此之外，抗結(jié)核治療會(huì)顯著降低NGS的檢出率，這提示NGS樣本需要在經(jīng)驗(yàn)性治療前收集，并且樣本如果在檢測或運(yùn)輸過程中被污染同樣會(huì)降低NGS診斷率[33-34]。另外，由于結(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)菌，體液中的病原體含量較少，在檢測過程中需對細(xì)胞進(jìn)行破壁處理，這可能會(huì)破壞遺傳物質(zhì)，導(dǎo)致檢出率降低。

3.2NGS對耐藥結(jié)核菌的識別 結(jié)核病疫情難控制的原因和耐藥菌株的增加密切相關(guān)，耐藥結(jié)核患者數(shù)量增加的主要原因是不適當(dāng)?shù)闹委熀湍退幗Y(jié)核分枝桿菌分離株的社區(qū)傳播。在基因組水平上，結(jié)核分枝桿菌的耐藥性是由單個(gè)或多個(gè)結(jié)核分枝桿菌基因的遺傳變異造成的。NGS用于鑒別結(jié)核分枝桿菌分離株的分子分型技術(shù)，有基于IS6110的限制性片段長度多態(tài)性分析(IS6110-RFLP)、分枝桿菌散布重復(fù)單位-可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列測定(MIRU-VNTR)、WGS等。IS6110-RFLP分型在20世紀(jì)90年代是公認(rèn)的結(jié)核病基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)[42]，但它費(fèi)力耗時(shí)，對操作人員要求高，而且對IS6110拷貝數(shù)在5個(gè)或以下的菌株沒有足夠的分辨能力[43]。2009年歐洲疾病預(yù)防和控制中心(ECDC)提出將MIRU-VNTR作為結(jié)核病基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)。MIRU-VNTR分型結(jié)果格式簡單，以DNA擴(kuò)增為基礎(chǔ)，不需要對結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，并縮短了實(shí)驗(yàn)室檢測時(shí)間[44]。2019年，ECDC提議在一些優(yōu)先病原體的監(jiān)測和暴發(fā)調(diào)查中使用WGS。一項(xiàng)評估WGS在實(shí)驗(yàn)室診斷分枝桿菌性能的研究顯示，93%的分枝桿菌與常規(guī)實(shí)驗(yàn)室鑒定結(jié)果一致，93%的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群藥敏預(yù)測與DST結(jié)果相符合[45]。WGS用于分子分型可獲得高分辨能力的精確遺傳信息，但目前微生物數(shù)據(jù)庫尚缺乏廣度和精度，且沒有統(tǒng)一的解讀標(biāo)準(zhǔn)，因此普及推廣面臨著挑戰(zhàn)[43,46]。

由于結(jié)核病耐藥是由結(jié)核分枝桿菌基因突變引起的，因此使用NGS進(jìn)行耐藥監(jiān)測有很大優(yōu)勢。NGS的成本與DST相當(dāng)，且耗時(shí)短，它可以識別所有可能導(dǎo)致耐藥的突變，不管是已知的還是未知的，同時(shí)還可以區(qū)分改變表型的耐藥突變和不改變表型的沉默突變[28,41,47]。在利福平耐藥的檢測上，Xpert MTB/RIF檢測耐利福平結(jié)核菌的特異度(99.5%)比NGS高，但靈敏度較低(61.8%)[34]。一項(xiàng)研究采用NGS檢測了1000多份痰菌陽性樣本，發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者對利福平、氟喹諾酮、吡嗪酰胺的耐藥率低，但對利福平敏感患者對異煙肼的耐藥率較高。如果使用Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥性，將導(dǎo)致漏診很多耐異煙肼結(jié)核病患者[34]。這也說明了傳統(tǒng)的分子技術(shù)不足以評估全部的耐藥突變，需要進(jìn)行多重分析。NGS檢測一線抗結(jié)核藥物和部分二線抗結(jié)核藥物耐藥性的準(zhǔn)確率很高[48]，表型結(jié)果與基因型結(jié)果的一致性較好，但由于抗藥性遺傳基礎(chǔ)不完全清楚，故基因型方法還不能完全取代傳統(tǒng)的表型方法[12,48-49]。有報(bào)道分析了88株再培養(yǎng)的耐多藥肺結(jié)核病(MDR-TB)菌株，比較NGS和一代測序?qū)τ谶拎乎０纺退幍耐蛔儥z測，兩者結(jié)果符合率為89%，NGS不僅證實(shí)了一代測序檢測到的吡嗪酰胺耐藥的主要突變基因，即pncA基因，還發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)新的混合菌株突變，解決了部分基因型與表型結(jié)果不一致的問題[50]。隨著NGS更多應(yīng)用于結(jié)核病的耐藥性檢測，以及基因序列數(shù)據(jù)信息的不斷補(bǔ)充和完善，NGS有望用于結(jié)核病耐藥的定量解釋，以指導(dǎo)制定后續(xù)治療方案[51]。與DST相比，WGS可以了解不同地區(qū)的結(jié)核分枝桿菌耐藥模式和在傳播過程中不斷獲得的耐藥性信息，這更有利于結(jié)核病疫情的控制[52]。

4 總結(jié)和展望

我國是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，由于傳統(tǒng)檢測方法的局限性，結(jié)核病的早期診斷和防控仍面臨很大挑戰(zhàn)。NGS檢測特異度高，且靈敏度高于培養(yǎng)法和Xpert MTB/RIF，能快速檢測樣本中所有的微生物序列，在結(jié)核病的早期診斷和鑒別診斷上有很大的價(jià)值。NGS可以對多種樣本進(jìn)行檢測，對肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷都有很大幫助；同時(shí)還能鑒別結(jié)核患者是合并感染、復(fù)發(fā)或者再感染；能識別所有可能導(dǎo)致耐藥的突變，確定耐藥菌株的傳播模式，有利于阻斷結(jié)核病的傳播。

目前NGS缺乏全面且高精度的數(shù)據(jù)庫，對檢測出的基因閾值不能進(jìn)行量化分級，對檢測結(jié)果沒有統(tǒng)一的解讀標(biāo)準(zhǔn)，對操作沒有統(tǒng)一的流程，這些都是NGS廣泛推行面臨的問題。雖然NGS在結(jié)核菌感染中的研究日益增多，但高中低風(fēng)險(xiǎn)區(qū)都缺乏多中心和大規(guī)模的前瞻性研究，使其診斷效能和可信度都大打折扣。NGS是醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等多學(xué)科發(fā)展進(jìn)步的成果，目前用于結(jié)核病的早期診斷和耐藥結(jié)核的鑒定還欠成熟，其發(fā)展和完善還需要多學(xué)科的共同努力和協(xié)作。