1例輸入性罕見遠期復發(fā)卵型瘧原蟲多重感染的實驗室檢測分析

薛衛(wèi)斌，王浩園，張婷婷，蔣莉娟，蔣一斕，羅?？怠?/p>

1.重慶市第九人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，重慶 400700；2.西南大學醫(yī)學研究院，重慶 400700

卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)是4種主要人體瘧原蟲之一，其分布范圍較小，主要在熱帶西非流行，通過受感染的按蚊(Anopheles)叮咬傳播[1-2]。卵型瘧原蟲感染導致的瘧疾(簡稱卵型瘧)在我國極為罕見，近年來隨著跨境人流量的增加，輸入性病例數(shù)量有所上升，我國輸入性瘧疾病例主要來源于非洲，占87.81%，且以惡性瘧疾為主[3]。由于卵形瘧原蟲的形態(tài)、感染的發(fā)作周期、再燃和復發(fā)機制都與間日瘧原蟲極為相似，并且因復發(fā)卵形瘧患者的原蟲密度又較低[4-5]，因此要作出正確的診斷難度大，也容易漏診和誤診。筆者對重慶市第九人民醫(yī)院(下稱本院)收治的1名輸入性卵形瘧遠期復發(fā)的患者采用了幾種實驗室診斷方法進行檢測，最終確診，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料 患者為男性，漢族，46歲，四川省瀘縣人。2021年5月18日，自覺不適，畏寒、發(fā)熱；此癥狀隔日發(fā)作，并逐漸出現(xiàn)乏力、活動后氣促，于2021年5月22日發(fā)作后于本院進行治療。入院時體溫40 ℃，呼吸23次/分，心率144次/分，血壓141/87 mm Hg。神志清楚，精神一般，對答切題，全身淺表淋巴結(jié)未捫及，肝、脾肋下未捫及。

患者既往病史：2016年6月至2019年3月，患者曾在位于非洲中部西海岸的加蓬共和國工作，為初次發(fā)病。在當?shù)剡M行了檢查瘧疾快速診斷試劑盒(RDTs)檢測為陽性，T1、T2陽性情況未知，形態(tài)學檢查未做，當?shù)蒯t(yī)生結(jié)合癥狀診斷為惡性瘧原蟲感染導致的瘧疾(簡稱惡性瘧)，用喹啉、青蒿琥酯抗瘧治療，并用其他藥物進行了對癥輔助治療。3 d后患者病情好轉(zhuǎn)，于是停藥。幾個月后，患者又出現(xiàn)瘧疾癥狀，自行服用抗瘧藥物(藥物名稱不詳)后好轉(zhuǎn)，病情有反復。2019年下半年回國，直到2020年3月才再次出現(xiàn)癥狀，患者未立即就醫(yī)，而是自行服用復方蒿甲醚本芴醇治療，然后好轉(zhuǎn)。

輔助檢查：2021年5月22日血常規(guī)檢查顯示，紅細胞計數(shù)4.48×1012/L，血紅蛋白137 g/L，血小板計數(shù)120×109/L，白細胞計數(shù)7.82×109/L，中性粒細胞百分數(shù)85.9%，淋巴細胞百分數(shù)8.4%，超敏C反應蛋白36.8 mg/L，總蛋白62.5 g/L，清蛋白36.5 g/L。超敏肌鈣蛋白、B型腦鈉肽、甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的檢測結(jié)果均為陰性。因患者既往有瘧疾病史，于是行血液瘧原蟲鏡檢，結(jié)果為陽性，并提示可見小滋養(yǎng)體、配子體，蟲種暫時未知。

1.2方法

1.2.1復查血常規(guī) 將患者5月22日的血常規(guī)標本，使用Sysmex公司XN-3100全自動血液分析流水線系統(tǒng)及原裝配套試劑進行血常規(guī)項目的復檢。

1.2.2RDTs檢測 使用萬孚瘧原蟲檢測試劑盒進行檢測，嚴格按說明書進行操作。

1.2.3顯微鏡鏡檢 用Sysmex SP-50全自動血涂片制備儀制備厚、薄血涂片并進行瑞-姬染色，再通過奧林巴斯CX-43型號的顯微鏡進行觀察，并用MShot Image Analysis System軟件拍照進行記錄。

1.2.4瘧原蟲巢式PCR和一代測序檢測 采集1管患者的靜脈全血標本，使用巢式PCR結(jié)合一代測序技術來鑒定瘧原蟲的蟲種及亞型。根據(jù)參考文獻[6]，合成鑒定瘧原蟲屬的通用引物(rPLU)和4種瘧原蟲(P.falciparum、P.malariae、P.vivax、P.ovale curtisi、P.ovale wallikeri)的特異性引物(分別為rMAL、rVIV、rOVA、rOVAv)，見表1，引物均由北京擎科生物科技有限公司重慶分公司合成。采用血液DNA小量提取試劑盒提取患者外周血DNA。巢式PCR第一輪PCR擴增體系(25 μL)包括2×T5 Direct PCR Mix(血液)12.5 μL，rPLU正、反向引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。第一輪擴增程序為98 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，一共進行35個循環(huán)；72 ℃最后延伸3 min，4 ℃保存擴增產(chǎn)物。然后對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳(1.5%瓊脂糖)。巢式PCR第二輪擴增體系(25 μL)包括2×T5 Direct PCR Mix(血液)12.5 μL，特異性正、反向引物各1 μL，DNA模板(為第一輪擴增產(chǎn)物)2 μL，ddH2O 8.5 μL。第二輪擴增程序和第一輪相同。對第二輪巢式PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳(1.5%瓊脂糖)。采用FastPure?Gel DNA Extraction Mini Kit試劑盒切膠回收第二輪擴增的目標條帶。測序PCR擴增體系(10.3 μL)包括特異性反向引物1 μL，測序緩沖液1.9 μL，BigDye一代測序試劑(BDT)0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 4.9 μL。測序PCR擴增程序為96 ℃預變性1 min，96 ℃變性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸4 min，共進行25個循環(huán)；4 ℃保存。采用磁珠法純化測序PCR產(chǎn)物，將純化后的測序PCR產(chǎn)物13 μL上機測序(使用的測序儀型號為ABI 3500)。使用NCBI在線比對工具nBlast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將一代測序的結(jié)果與其核酸數(shù)據(jù)庫進行比對，判斷瘧原蟲類型。

表1 瘧原蟲巢式PCR檢測的引物序列及擴增片段大小

2 結(jié) 果

2.1血常規(guī)復查的結(jié)果 血常規(guī)結(jié)果與初次結(jié)果基本相符，但Q-Flag報警提示有受感染的紅細胞(iRBC)；WDF通道的散點圖，位于中性粒和嗜酸性粒細胞散點群之間，集中在中性粒細胞散點群下方有一群異常散點群；WNR通道的散點圖，位于白細胞散點群左下方的區(qū)域也出現(xiàn)一群異常散點群，見圖1。

注：A為WDF通道散點圖；B為WNR通道散點圖；圈內(nèi)為儀器檢測中顯示為淺紫色的異常散點群。

2.2RDTs檢測 結(jié)果為T2陽性，根據(jù)說明書的解釋，提示感染除惡性瘧原蟲以外的其他3種瘧原蟲中的單種或多種。

2.3形態(tài)學檢查 查見卵形瘧環(huán)狀體,見圖2A；查見大滋養(yǎng)體，見圖2B；查見雌配子體，見圖2C；查見雄配子體，見圖2D；查見多重感染形態(tài)，見圖2E、2F。

注：A中箭頭所指為卵形瘧環(huán)狀體；B中箭頭所指為卵形瘧大滋養(yǎng)體； C中箭頭所指為卵形瘧雌配子體；D中箭頭所指為卵形瘧雄配子體；E中箭頭所指為卵形瘧多重感染；F中箭頭所指為卵形瘧多重感染。

2.4巢式PCR電泳及一代測序結(jié)果 第一輪巢式PCR擴增產(chǎn)物電泳圖，見圖3A，產(chǎn)物大小為1 200 bp，與目標條帶大小相符，說明該患者有瘧原蟲屬的感染。第二輪巢式PCR擴增產(chǎn)物電泳圖，見圖3B，產(chǎn)物大小為778 bp，與預期相符，說明該患者感染的瘧原蟲類型屬于P.ovlae curtisi。第二輪巢式PCR產(chǎn)物的一代測序結(jié)果及NCBI在線比對工具驗證了該患者感染的瘧原蟲屬于P.ovlae curtisi亞種，與形態(tài)學檢測結(jié)果一致。

注：A為第一輪巢式PCR產(chǎn)物電泳圖；B為第二輪巢式PCR產(chǎn)物電泳圖；泳道1是分子標準條帶；泳道2為由患者外周血DNA標本擴增得到的產(chǎn)物。

2 討 論

因WDF溶血劑作用較弱，瘧原蟲感染的紅細胞不會被溶血劑破壞。故不同感染階段的紅細胞對WDF散點圖的干擾也不同，瘧原蟲小滋養(yǎng)體期感染紅細胞內(nèi)容物的復雜程度和細胞體積小于中性粒細胞，核酸含量與中性粒細胞類似，但其細胞內(nèi)容物的復雜程度和核酸含量小/少于嗜酸性粒細胞，這一部分感染的紅細胞在散點圖上會出現(xiàn)在中性粒細胞和嗜酸性粒細胞之間的區(qū)域[7-10]。WNR溶血劑作用強于WDF溶血劑，可破壞被瘧原蟲感染的紅細胞膜，使其細胞變?yōu)楹携懺x的裸核，裸核的體積和核酸含量均低于白細胞，也不會干擾白細胞的計數(shù)和嗜堿性粒細胞的計數(shù)[7-10]。有研究表明，萬孚瘧原蟲檢測試劑盒對卵形瘧原蟲的總體檢出率為70.0%，其檢出率與原蟲密度、瘧原蟲乳酸脫氫酶(pLDH)濃度關系密切，與pLDH基因多態(tài)性無關[11]。

卵形瘧環(huán)狀體與間日瘧較相似，細胞質(zhì)較大呈淡藍色環(huán)狀，約為紅細胞直徑的1/3，1個紅核。卵形瘧大滋養(yǎng)體與三日瘧較相似，紅細胞稍顯腫脹，邊緣整齊或不規(guī)則樣；蟲體小于正常紅細胞，呈圓形、帶狀或大環(huán)狀，但較大。卵形瘧雌配子體與三日瘧和間日瘧相似，感染蟲體的紅細胞漲大，一般呈卵圓形或者橢圓形，呈“彗星”樣或傘狀[5]；蟲體圓形，胞質(zhì)深藍色，核結(jié)實并偏于一側(cè)，虐色素多而分散，被感染的紅細胞形態(tài)稍規(guī)則，并略大于正常紅細胞，蟲體紅核藍漿，胞核偏于一側(cè)明顯，核染色質(zhì)致密，細胞質(zhì)幾乎脹滿整個紅細胞。雄配子體與雌配子體的形態(tài)大致相同，主要區(qū)別在于雄配子體的胞核位于中央，而雌配子體的胞核偏于一側(cè)。卵形瘧通常寄生于紅細胞內(nèi)的原蟲只有1個，偶有2個(多重感染)，而此病例中，多次查到有2個以上的原蟲寄生于1個紅細胞內(nèi)的形態(tài)，是典型的多重感染，紅細胞呈卵圓形稍腫大和褪色；仔細觀察有4個蟲體寄生在內(nèi)，實屬罕見；而被感染的紅細胞脹大且不規(guī)則，褪色明顯，內(nèi)含有大、小滋養(yǎng)體及未成熟裂殖體，更是罕見。

巢式PCR技術在第一輪擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果出來后，條帶大小與預期相符，證明是瘧原蟲屬疾病；第二輪電泳結(jié)果顯示P.ovale curtisi 亞型的特異性序列被擴增出來，證明引物序列可靠，并初步判斷該瘧原蟲類型屬于P.ovale curtisi 亞型；nBlast比對結(jié)果分數(shù)越高，E值(Expect value)越小，同源性越高；因此可知此樣本的DNA序列與卵形瘧的序列相似程度較高，最終判斷該樣本是卵形瘧P.ovale curtisi亞型[12]。最后，重慶市疾控中心也確診此病例為卵形瘧。

抗瘧藥使用應遵循安全、有效、合理、規(guī)范的原則。應根據(jù)瘧原蟲蟲種及其對抗瘧藥的敏感性和患者的臨床癥狀與體征合理選擇藥物，并應嚴格掌握劑量、療程和給藥途徑，以保證治療和預防效果并延緩抗藥性的產(chǎn)生[13]。所以能否快速明確診斷出瘧原蟲的蟲種及其重要。

Sysmex血液分析儀的iRBC和寄生蟲感染紅細胞(pRBC)的報警值得高度警惕，很有必要建立在血常規(guī)的復檢規(guī)則中，以防止瘧原蟲的漏檢；戴燕等[14]曾經(jīng)報道，對異常散點圖的分析，也可快速、簡便的篩查瘧原蟲，也可防止瘧原蟲的漏檢；RDTs操作方便，判讀結(jié)果快，但對檢測非惡性瘧的特異性不強，可作為鏡檢法鑒別蟲種的輔助工具[15]；KOTEPUI等[16]也曾報道，通過形態(tài)學方法將卵形瘧誤認為間日瘧是很常見的，并導致全世界卵形瘧原蟲病例的報告不足，但形態(tài)學檢查任然是診斷瘧疾及其蟲種的最理想且廉價的方法；巢式PCR和一代測序技術特異性好，準確率高，尤其對鑒別蟲種亞型有著很好的適用性，但其設備昂貴，無法配備所有基層實驗室；實驗室的工作人員與醫(yī)生和患者的溝通也很重要，可聯(lián)系臨床資料得到正確的診斷方向。

對此罕見病例，本實驗室利用現(xiàn)有條件對其進行了多種方法診斷，以形態(tài)學的診斷最為迅速、準確且廉價，其他方法各有優(yōu)劣，適合對其進行輔助鑒別診斷。根據(jù)2015年WHO發(fā)布的《瘧疾治療指南》(第三版)中的建議，實驗室常規(guī)檢查方法推薦形態(tài)學和RDTs聯(lián)合檢測[17]，所以加強基層實驗室人員對瘧原蟲理論及形態(tài)學的培訓尤為重要。