生物鐘基因在缺血再灌注及心肌重構(gòu)中的研究

王姣 彭石 劉麗芳 吳波 姚亞麗

缺血再灌注損傷是缺血組織恢復(fù)血液供應(yīng)后，因炎癥風(fēng)暴擴(kuò)散使心肌結(jié)構(gòu)和功能損傷加重的病理變化[1]。研究顯示生物鐘紊亂可加重缺血再灌注損傷，導(dǎo)致心肌修復(fù)異常，預(yù)后惡化[2]，但相關(guān)研究較少。本文介紹生物鐘基因在缺血再灌注及心肌重構(gòu)中的作用及可能機(jī)制，為心血管疾病治療提供潛在策略。

1 生物鐘基因

生物鐘基因包括核心基因Clock，Bmal1，Per1、2、3，Cry1、2及多種鐘控基因。生物鐘基因調(diào)節(jié)機(jī)體的多項(xiàng)生理功能，使其適應(yīng)外界環(huán)境變化。生物鐘轉(zhuǎn)錄因子Clock-Bmal1 形成異二聚體，與Per、Cry基因啟動(dòng)子結(jié)合，進(jìn)而增加Per 和Cry蛋白生成。當(dāng)Per 達(dá)到一定濃度后，部分可與Cry蛋白結(jié)合，形成Per-Cry 復(fù)合物，負(fù)性調(diào)節(jié)生物鐘基因轉(zhuǎn)錄，而夜間Per-Cry 復(fù)合物降解使基因轉(zhuǎn)錄再次激活。Clock-Bmal1 也與Rev基因的E-box 元件結(jié)合，增加Rev-Erb 蛋白生成。當(dāng)Rev-Erbα 較多時(shí)，可與Arntl基因啟動(dòng)子上的視黃酸相關(guān)受體反應(yīng)元件（ROREs）結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制Ror 蛋白的激活作用，進(jìn)而抑制基因轉(zhuǎn)錄[3]。正常的生物鐘節(jié)律對(duì)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，其紊亂可導(dǎo)致一系列心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展[4]。

2 生物鐘紊亂與心血管事件

研究表明，生物鐘節(jié)律中斷會(huì)增加冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┑陌l(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，生物鐘異常也影響缺血再灌注及心肌重構(gòu)等過程[5]。生物鐘紊亂可使心肌細(xì)胞耐受缺氧的能力降低，組織炎性反應(yīng)加重，細(xì)胞外基質(zhì)沉積增多，進(jìn)而加重缺血再灌注損傷，干擾心肌重構(gòu)，使患者預(yù)后惡化[2]。Bmal1基因缺失小鼠會(huì)出現(xiàn)心血管生物鐘節(jié)律減弱、廣泛心肌纖維化，形成年齡依賴性擴(kuò)張型心肌病，導(dǎo)致早期死亡率增加，提示生物鐘缺失可導(dǎo)致相關(guān)基因表達(dá)改變、心肌肌聯(lián)蛋白亞型改變及肌節(jié)結(jié)構(gòu)破壞，引起疾病發(fā)生發(fā)展[6]。人類急性ST段抬高型心肌梗死發(fā)作的晝夜時(shí)間影響梗死面積大小以及住院死亡率[7]，清晨發(fā)作時(shí)心肌梗死面積增大，死亡風(fēng)險(xiǎn)增加。重癥監(jiān)護(hù)病房的光照、碎片化睡眠等加重生物鐘紊亂，給患者的康復(fù)帶來嚴(yán)重影響[8]。

3 生物鐘基因與缺血再灌注

缺血再灌注時(shí)，缺血心肌通過產(chǎn)生活性氧（ROS）和激活細(xì)胞死亡程序，誘發(fā)組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，線粒體激活[2,9]，致使血管損傷，形成微血管阻塞（MVO），造成“無回流”現(xiàn)象，加劇心肌損傷[1]。生物鐘基因紊亂可增加ROS 及炎性因子生成[10-11]，加重線粒體功能缺陷，增加細(xì)胞鐵死亡及生物鐘自噬，加劇缺血再灌注損傷[2]。

3.1 生物鐘基因與炎性因子生成

清晨發(fā)生的心肌梗死具有更大的梗死面積[12]，可能由于清晨梗死發(fā)作后早期優(yōu)先觸發(fā)與炎性反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)，導(dǎo)致梗死部位白細(xì)胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子（TNF）等炎性因子水平增加，炎性反應(yīng)增強(qiáng)，心肌損害加重[13]。生物鐘紊亂如何加重缺血再灌注損傷的相關(guān)機(jī)制尚未完全清楚，研究提示生物鐘紊亂通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1 型極化、單核細(xì)胞趨化、白細(xì)胞激活和炎性小體激活增加等機(jī)制，加重再灌注損傷，干擾心肌修復(fù)[14]。生物鐘紊亂使極化的巨噬細(xì)胞分泌IL-23 增加，從而驅(qū)動(dòng)適應(yīng)性輔助性T 細(xì)胞17（Th17 細(xì)胞）產(chǎn)生并激活I(lǐng)L-17，導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡[15]。生物鐘紊亂可導(dǎo)致C 反應(yīng)蛋白（CRP）升高，后者與再次心肌梗死和冠心病死亡率增加相關(guān)。

3.2 生物鐘基因與細(xì)胞收縮功能障礙

在生物鐘基因缺失小鼠的血管中，內(nèi)皮源性血管舒張因子一氧化氮（NO）及血管擴(kuò)張劑生成減少[9]，血管收縮因子環(huán)氧化酶-1（COX1）表達(dá)增加，ROS 生成增多，加重再灌注損傷，提示缺血再灌注損傷與生物鐘紊亂導(dǎo)致內(nèi)皮型一氧化氮合酶偶聯(lián)受損有關(guān)[16]。生物鐘異常通過加劇氧化應(yīng)激，使基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）活性增強(qiáng)，造成心肌收縮蛋白的降解及肌絲結(jié)合Ca2＋能力的下降[17]，導(dǎo)致心肌收縮功能障礙。Bmal1 缺失的心肌細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)Ca2＋瞬態(tài)振幅降低、肌絲對(duì)Ca2＋敏感性降低等表現(xiàn)[18]，這與Bmal1基因調(diào)控Titin-cap 蛋白（TCAP）表達(dá)相關(guān)。TCAP 在維持心肌肌節(jié)完整性中起重要作用[19]，生物鐘缺失使TCAP 亞型組成改變，心肌肌節(jié)結(jié)構(gòu)破壞[20]，影響心肌收縮力受損修復(fù)及心臟修復(fù)。

3.3 生物鐘基因線粒體功能障礙

線粒體功能障礙被認(rèn)為是心血管疾病進(jìn)展的關(guān)鍵因素。生物鐘異常影響線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞自噬等多種功能。Bmal1缺失的心肌細(xì)胞出現(xiàn)線粒體形態(tài)伸長(zhǎng)，嵴結(jié)構(gòu)異常，融合標(biāo)志物表達(dá)升高，自噬伴侶蛋白與自噬體微管相關(guān)蛋白表達(dá)降低，自噬蛋白BNIP3 表達(dá)降低，導(dǎo)致線粒體自噬功能受損，加重心肌受損[18]。Bmal1缺失可抑制BNIP3 介導(dǎo)的線粒體自噬，在缺血早期，正常的自噬激活對(duì)去除受損細(xì)胞器、避免蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激反應(yīng)至關(guān)重要[21]，自噬延遲會(huì)加重再灌注損傷，加速細(xì)胞死亡，造成心肌異常重構(gòu)和心功能障礙。生物鐘紊亂可改變線粒體內(nèi)膜通透性，誘導(dǎo)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTPs）開放，使細(xì)胞中ROS 生成增多，加重細(xì)胞膜和DNA 損傷及脂質(zhì)過氧化，加速細(xì)胞死亡[1]。糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）可能為生物鐘基因，研究發(fā)現(xiàn)mPTPs 開放與GSK-3β 相關(guān)[2]。

3.4 生物鐘基因生物鐘自噬

生物鐘自噬（clockophagy）是一種選擇性自噬過程，是芳基烴受體核轉(zhuǎn)位樣蛋白1（Arntl1）通過自噬相關(guān)蛋白5 和泛素化結(jié)合蛋白依賴的選擇性自噬降解，導(dǎo)致人脯氨酰羥化酶2（EGLN2）表達(dá)升高，缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子-1α（HIF-1α）穩(wěn)定性降低，脂肪酸氧化及鐵死亡增加，加重心肌損害[22]，而Arntl1為重要的生物鐘基因。再灌注中的鐵死亡使缺氧細(xì)胞釋放游離鐵，鐵誘導(dǎo)ROS 生成和脂質(zhì)過氧化物積累，使心肌細(xì)胞死亡[22]。Per2缺失小鼠缺氧細(xì)胞中HIF-1α 的穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致其耐受缺氧的能力下降，且對(duì)缺氧誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)的抵抗能力減弱，心肌細(xì)胞鐵死亡增加。生物鐘紊亂可通過HIF-1α/BNIP3 途徑使心肌細(xì)胞線粒體通透性改變，加重再灌注損傷[23]。

4 生物鐘基因與心肌重構(gòu)

心臟重構(gòu)是在ROS 及炎性因子的刺激下，心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)等發(fā)生結(jié)構(gòu)及功能改變，使心肌肥厚、纖維化，最終進(jìn)展為心力衰竭[1,24]。氧化應(yīng)激可造成心肌細(xì)胞外基質(zhì)成分及相關(guān)因子的異常表達(dá)，干擾正常的心肌修復(fù)。生物鐘紊亂使巨噬細(xì)胞極化[24]，誘導(dǎo)血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）生成，改變還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶亞型，使ROS 產(chǎn)生增多，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，造成異常的心肌重構(gòu)[9]。生物鐘基因缺失使線粒體膜通透性改變，從而增加MMP-2 活性，導(dǎo)致有正常結(jié)構(gòu)和功能的膠原蛋白降解，進(jìn)而促使心肌細(xì)胞外基質(zhì)分解，加速心肌重構(gòu)[1]。

5 生物鐘基因在缺血再灌注損傷治療中的作用

時(shí)間治療方法是以生物鐘節(jié)律、藥動(dòng)學(xué)及藥效學(xué)為基礎(chǔ)，制定特定給藥時(shí)間，以提高治療效果[25]。Ang Ⅱ在心肌重構(gòu)方面起到重要作用，且受生物鐘基因調(diào)控，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）特定的給藥時(shí)間可降低Ang Ⅱ水平，同時(shí)降低下游氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善異常重構(gòu)[1]。以生物鐘基因?yàn)榘悬c(diǎn)的生物學(xué)治療為促進(jìn)心肌修復(fù)提供了潛在的治療方案。Rev-Erbα 激活劑 SR9009 可減輕炎性反應(yīng)，促進(jìn)心肌組織修復(fù)，有利于心肌功能的恢復(fù)[11]。通過控制Per2基因的穩(wěn)定性而治療心肌缺血成為潛在的治療策略[26]。Cry 穩(wěn)定劑KL001 可能對(duì)降低心血管不良事件有潛在作用，但仍需大量研究來評(píng)估其準(zhǔn)確性[27]。

6 小結(jié)

生物鐘紊亂可引起內(nèi)皮功能障礙、心肌收縮力損傷、ROS 和炎性因子增加、生物鐘自噬和鐵死亡增加及ECM 降解增加，在缺血再灌注損傷和心肌重構(gòu)中起到關(guān)鍵作用。生物鐘基因與缺血再灌注損傷和心肌重構(gòu)密不可分，仍需要深入探究其作用機(jī)制及其在心血管疾病治療中的應(yīng)用。