葫蘆科作物多倍化研究進展

虞夏清,陳勁楓

(南京農業(yè)大學作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室,江蘇 南京 210095)

多倍體(polyploid)是指包含3套及以上完整染色體組的生物。形成多倍體生物的過程被定義為多倍化(polyploidization)。多倍體在自然界中十分常見,如重要農作物棉花(Gossypiumspp.)、小麥(Triticumaestivum)、油菜(Brassicanapus)、甘蔗(Saccharumofficinarum)等。盡管多倍化的進化意義仍然存在爭議,但隨著近年來基因組學、系統生物學和生物信息學技術的快速發(fā)展,越來越多的證據顯示,多倍化是物種形成與進化的重要驅動力[1]。研究表明,所有的被子植物均經歷過至少一次以上的多倍化事件,意味著所有的被子植物都是古多倍體[2-3]。同時,被子植物進化過程中普遍發(fā)生的多倍化事件與白堊紀-第三紀生物滅絕事件(KT-extinction)在時間上吻合。因此,學者們推斷多倍化可能是現存多數被子植物的祖先在生物滅絕事件中存活下來的重要原因[3-4]。近期研究認為,多倍體優(yōu)于二倍體的抗逆能力是其在生物大滅絕事件中存活下來的重要原因[3,5]。多倍化過程能夠在短時間內極大豐富生物體的遺傳多樣性,為進化提供原始的遺傳基礎,也為作物遺傳改良提供豐富的育種資源。多倍體通常在多個性狀方面具有明顯的優(yōu)勢,如生物量和產量相關性狀及抗逆性等方面。多倍化的育種應用已經為人們帶來了巨大的經濟和社會效益[6]。因此,多倍化不僅對于物種適應性進化具有重要意義,也是作物遺傳改良的重要途徑[7]。

作為最早被馴化的作物類型之一,葫蘆科作物包含黃瓜(Cucumissativus)、甜瓜(Cucumismelo)、西瓜(Citrulluslanatus)、南瓜(Cucurbitaspp.)、冬瓜(Benincasahispida)等多個重要經濟作物,在農業(yè)生產中占有舉足輕重的地位[8-9]。大多數葫蘆科作物以果實作為鮮食或加工產品,部分葫蘆科作物還具有重要的藥用和觀賞價值[10]。在科學研究中,葫蘆科作物是研究性型分化和維管生物學的模式作物[11-12]。黃瓜作為第1個被全基因組測序的蔬菜作物,開啟了葫蘆科作物研究的基因組學時代[13]。隨著測序技術和基因組學的快速發(fā)展,在甜瓜[14]、西瓜[15]、南瓜[16]和冬瓜[17]等葫蘆科作物上相繼完成了全基因組測序、組裝與版本更新[18],為葫蘆科作物的物種起源與進化以及表型性狀的分析與利用奠定了基礎。大規(guī)模比較基因組學結果顯示,在雙子葉植物共有的一次全基因組加倍事件之后的約兩千萬年,葫蘆科作物發(fā)生過一次多倍化事件[9]。多倍化被認為是開花植物迅速分化和繁育擴張的重要原因。因此,多倍化在葫蘆科作物的分化與擴張中也扮演了重要角色[19]。

多倍化已在葫蘆科作物育種中得到較為廣泛的應用,例如西瓜的多倍體育種早在1939年就已開展。多倍化一直以來都是葫蘆科作物育種與研究的重點。根據基因組的組成不同,多倍體通?？梢苑譃橥炊啾扼w(autopolyploid)和異源多倍體(allopolyploid)。同源多倍體的亞基因組相同,而異源多倍體則包含不同的亞基因組,對應的多倍化過程分別稱為同源多倍化和異源多倍化。與同源多倍化相比,異源多倍化同時包含多倍性和雜合性的雙重特征,因而通常表現出更為復雜而豐富的變異,這對于物種進化與作物育種極為重要。在21世紀初前人對葫蘆科作物倍性育種的方法與應用進行了總結[20],其中絕大多數是關于同源多倍化的總結,而關于異源多倍化的研究涉及較少。本文針對近年來葫蘆科作物多倍化的研究展開綜述,從多倍體的獲得與鑒定、優(yōu)勢以及組學研究等方面,總結近年來葫蘆科作物多倍化研究的重要進展,探討未來多倍化在葫蘆科作物研究中的方向,為提升葫蘆科作物的產量和品質提供參考。

1 葫蘆科作物多倍體的獲得與鑒定

多倍體的獲得途徑包括自然變異、物理或化學方式誘導、離體培養(yǎng)等。多倍體材料的鑒定方法主要包括形態(tài)學鑒定、染色體直接計數、流式細胞測定以及分子生物學方法鑒定等。Zhang等[21]開發(fā)了一種基于高度保守的5S rDNA序列和拷貝數的實時定量PCR技術方法,此方法采樣量小,可用于快速鑒定西瓜倍性,其準確性與流式細胞測定相近。關于獲得與鑒定多倍體方法的比較,前人已經從某個單一物種到某一類植物/作物分別進行了總結與記錄[20,22-26],本文不再贅述。對于葫蘆科作物而言,多倍體鑒定主要以形態(tài)學和細胞學鑒定為主。

自發(fā)形成的多倍體在葫蘆科作物中并不常見,利用秋水仙素處理或離體培養(yǎng)技術誘導多倍體已在西瓜、甜瓜等葫蘆科作物上普遍應用。不同的誘導方式在不同葫蘆科作物中存在較大差別,誘導率從小于1%到高達50%。秋水仙素對同源四倍體冬瓜的誘導率最高可達35.2%[27-28]。在同一物種中,不同的誘導方法誘導率也不同,如秋水仙素和氨磺樂靈誘導印度南瓜獲得同源四倍體的誘導率分別為0.33%和0.83%[29]。閔子揚等[30]以子葉為外植體,利用秋水仙素結合組織培養(yǎng)誘導南瓜多倍體,通過形態(tài)和根尖染色體鑒定得出誘導率達25.71%。Zheng等[31]利用秋水仙素處理誘導黃瓜同源四倍體的誘導率只有6%,而劉永月等[32]利用秋水仙素和二甲基亞砜混合溶液對黃瓜同源四倍體的誘導率則高達14%。Wang等[33]利用甲基胺草磷誘導同源四倍體甜瓜的誘導率高于秋水仙素和氨磺樂靈,為14.44%,而賈媛媛等[34]利用芐氨基腺嘌呤激素通過離體培養(yǎng)誘導獲得同源四倍體甜瓜,誘導率與甲基胺草磷誘導率接近,為14.3%。張勇等[35]利用秋水仙素對不同類型甜瓜進行多倍體誘導,發(fā)現網紋型材料的四倍體誘導率達54.4%,而2份光皮型材料四倍體誘導率則分別為20.0%和23.3%。因此,葫蘆科作物多倍體的誘導率受到許多因素的影響,例如所用化學試劑的種類、處理時間、處理方式與處理對象的選擇、物種與基因型以及統計方法等。

2 多倍化在葫蘆科作物中的優(yōu)勢

2.1 產量與品質優(yōu)勢

多倍化能夠產生多倍體優(yōu)勢,即能夠有效提高作物產量與質量。與二倍體相比,葫蘆科作物同源多倍體普遍表現出的特點主要包括:植株節(jié)間變短,葉片變大、變厚,莖變粗,花冠變大,花粉粒變大,氣孔增大,保衛(wèi)細胞葉綠體數增加,果實大小不變或變小,果實質量增加,果肉變厚,果實結實率與花粉育性降低等[27,31-33,36-38]。這些形態(tài)學特征可以作為初步判定葫蘆科作物多倍體的參考指標。然而,并非所有的葫蘆科多倍體都呈現出這些特征,少數甚至存在相反的結果。例如,與印度南瓜(Cucurbitamaxima)二倍體相比較,同源四倍體葉片變小,而其他形態(tài)指標則符合上述多倍體共有特征[29]。通過離體組織培養(yǎng)獲得的同源四倍體甜瓜在形態(tài)上與二倍體無顯著差異[39]。與同源多倍體相比,異源多倍體的表型更為復雜。Yu等[40-41]對獲得的甜瓜屬人工異源四倍體(Cucumis×hytivus)進行表型分析,發(fā)現異源四倍體存在著多種不同的表型變異,種子大小、植株生物量等表型介于雙親之間,而細胞大小則表型出倍性效應,顯著大于二倍體親本。

在品質性狀方面,葫蘆科作物多倍體果實通常表現出高于二倍體的可溶性糖、可溶性固形物、可溶性蛋白質等品質指標[33-34,38,42]。四倍體和三倍體薄皮甜瓜果實成熟時期可溶性糖、可溶性固形物、可溶性蛋白質、維生素C、氨基酸含量均高于二倍體,但并非全部與倍性成正比,例如三倍體甜瓜的可溶性固形物和可溶性蛋白含量均高于四倍體[43-44]。張勇等[35]發(fā)現同源四倍體甜瓜與二倍體甜瓜相比,雖然果肉厚度并無明顯改變,但是單果重和可溶性固形物含量顯著降低。Jaskani等[45]比較了秋水仙素處理獲得的同源四倍體西瓜與原始親本二倍體的果實品質性狀,發(fā)現四倍體西瓜果實的類胡蘿卜素、番茄紅素和單糖含量更高,但節(jié)間長度、果實質量、總糖含量無顯著差別。袁平麗等[46]發(fā)現同源三倍體、四倍體西瓜的番茄紅素含量前期積累比二倍體慢,后期迅速積累,顯著高于二倍體。Dou等[47]研究發(fā)現,多倍體與二倍體西瓜中番茄紅素含量存在差異,該差異的產生是由于多倍化引起的番茄紅素代謝基因的轉錄水平變化和植物激素的水平變化引起的。

由此可見,盡管以往的研究結果表明倍性效應在決定葫蘆科作物產量和品質性狀中存在許多共性,但每個多倍化事件都是獨特的,其產生的表型也在很大程度上是未知的,有時甚至會產生截然相反的結果。產量和品質性狀的形成因素復雜,受到許多基因的調控,任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生變化,都會影響最終代謝產物含量的變化。多倍化能夠引起全基因組范圍內不同程度的基因表達變化。隨著表型組學的快速發(fā)展,建立快速的多倍體篩選機制可以提高多倍體育種的效率。同時,解析多倍化引起產量與品質性狀改變的分子機制,能夠為利用多倍化精確開展多倍體育種奠定重要基礎。

2.2 克服遠緣雜交障礙

種間雜交可以將近緣野生種中有用的基因導入栽培品種,促使作物進化并創(chuàng)制新的作物類型。然而,由于野生種與栽培種之間往往存在不同程度的生殖隔離,種間雜交經常會遇到雜交不親和、雜種不育以及雜種后代強烈分離等難題[48-49]。部分雜種不育可以通過染色體加倍達到遺傳上的穩(wěn)定,從而恢復育性[24,50]。

黃瓜遺傳基礎狹窄[13,51],種內變異缺乏,急需通過種間雜交拓寬遺傳基礎。Chen等[52-53]通過胚拯救的方法獲得了栽培黃瓜與近緣野生酸黃瓜(CucumishystrixChakr.)之間的遠緣種間雜種,然而正反交雜種均高度不育。為恢復育性,Chen等[54]利用秋水仙素處理對種間雜種進行染色體加倍,獲得了甜瓜屬首例完全可育的異源四倍體新物種,命名為Cucumis×hytivusJ. F. Chen & J. H. Kirkbr.。該異源四倍體一方面可以作為全新的作物類型進行研究與利用,另一方面可以作為橋梁,將野生種中攜帶的優(yōu)異基因轉移到栽培黃瓜中,對于黃瓜的遺傳改良具有重要意義。Yu等[55]發(fā)現該異源四倍體存在葉片延遲成熟的新表型,表現為葉面積與葉片光合能力增長緩慢、幼葉葉綠素與類胡蘿卜素等光合色素含量偏低以及葉片發(fā)育過程中庫-源轉化異常等;對葉綠素生物合成關鍵基因的序列和表達分析顯示,在該人工異源四倍體中,葉綠素生物合成的關鍵基因谷氨酰tRNA還原酶基因1(HEMA1)、尿卟啉原脫羧酶基因2(HEME2)和原葉綠素酸酯氧化還原酶基因(POR)表現為較親本顯著下調表達的非加性表達特征,推測葉綠素生物合成受阻為其葉綠素缺乏的主要因素?；蚩寺∽C實來自雙親的部分同源基因在異源四倍體中均得以保留,并在異源四倍體中存在融合了雙親基因序列的HEMA1嵌合基因。

研究者進一步將該異源四倍體與二倍體親本栽培黃瓜回交創(chuàng)制了異源三倍體、異附加系、漸滲系等一系列的優(yōu)異資源[56-59],再利用漸滲系分離出具有霜霉病、細菌性角斑病、蔓枯病和根結線蟲的抗性單株,進行了抗性基因的發(fā)掘[60-63],并通過抗性轉育培育了“南抗”“霜抗”以及“雙抗”系列黃瓜新品種,成功實現了從野生種到栽培黃瓜優(yōu)異基因的有效轉移。

2.3 適應性優(yōu)勢

多倍體的適應性和抗病抗逆性往往優(yōu)于二倍體。例如,與二倍體中國南瓜相比,同源四倍體南瓜的抗早衰性更強,脯氨酸含量和過氧化物歧化酶活性更高,丙二醛含量更低,傷流量更高,根系活力更強[29,64]。此外,同源四倍體西瓜對枯萎病的抗性優(yōu)于二倍體[65-66]。黃金艷等[67]通過比較同源四倍體薄皮甜瓜與二倍體在干旱脅迫下的株高脅迫指數、莖徑脅迫指數、干物質脅迫指數、葉綠素含量、相對可溶性糖含量和脯氨酸含量等生理指標發(fā)現,四倍體的抗旱性顯著強于二倍體。何毅等[68]通過比較高溫對不同倍性西瓜生理特性及果實品質的影響,發(fā)現同源四倍體和三倍體西瓜的耐熱性優(yōu)于二倍體。Wang等[69]對甜瓜屬異源四倍體的耐弱光能力進行分析,發(fā)現其光補償點為11.25 μE·m-2·s-1,低于耐弱光黃瓜品種‘長春密刺’,且在弱光處理2周后葉綠素a和葉綠素b含量增加,葉綠素a/b值大幅度降低,形態(tài)學耐弱光隸屬值達0.946,表明該異源四倍體具有較強的耐弱光性。

多倍體適應性優(yōu)勢的分子機制是近年來學者們較為關注的課題。研究表明,基因組加倍使植物抗性基因的容量成倍增加,拓寬了基因的遺傳變異范圍,提高了產生優(yōu)良基因組合的概率,從而提供了植物對不利環(huán)境抗性的遺傳基礎[70]。Chen等[42]和Yu等[71]對甜瓜屬異源四倍體及其親本接種南方根結線蟲(Meloidogynespp.)進行抗性鑒定,發(fā)現異源四倍體抗線蟲能力顯著強于栽培黃瓜親本,推測與其拓寬的遺傳基礎有關。此外,該異源四倍體在高溫下的抗性也顯著優(yōu)于二倍體親本,高溫與對照下二倍體親本及異源四倍體的轉錄組學分析顯示,異源四倍體高溫下特異的光合響應機制可能是其耐高溫的重要原因[71]。

同源四倍體西瓜在未經過預冷處理時的耐冷性不如二倍體,而經過預冷處理的耐冷性則強于二倍體,推測四倍體中的某種耐冷基因只在預冷情況下才能誘導表達,從而增強四倍體的耐冷性[72-73]。葫蘆科作物多倍體的適應性優(yōu)勢不僅與多倍化引起的全基因組遺傳變異有關,表觀遺傳修飾的改變同樣扮演了重要角色。楊炳艷等[74]通過比較低溫脅迫下西瓜同源二倍體和三倍體甲基化及基因表達的差異發(fā)現,三倍體在低溫脅迫后去甲基化率與基因上調表達量均大于二倍體,因而三倍體的耐冷性強于二倍體。朱紅菊等[75]比較了鹽脅迫下同源四倍體與二倍體西瓜幼苗的形態(tài)學指標和DNA甲基化情況發(fā)現,與二倍體相比,四倍體西瓜幼苗的耐鹽性更強,甲基化比率和去甲基化比率更低。

3 葫蘆科作物多倍體組學研究

得益于組學技術的快速發(fā)展,學者們有機會從點到面對植物多倍化過程進行全基因組范圍的認識。Sun等[16]同時完成了印度南瓜和中國南瓜(Cucurbitamoschata)的全基因組測序,從基因層面解釋了2種南瓜的顯性特征差異。通常多倍體形成后會失去部分祖先基因,重新回到二倍體狀態(tài)。然而,該研究表明,與其他古多倍體不同,南瓜較為完整地保存了2個祖先的基因組,且2個親本基因組間并沒有顯著的偏向性[16]。多倍體中亞基因組沒有偏向性的結果并不多見,相反,亞基因組不對稱性(亞基因組優(yōu)勢)則更為常見,通常表現為有偏向性的基因表達和基因丟失[1]。亞基因組不對稱性與物種進化和雜種優(yōu)勢的形成存在著密切聯系,而這種不對稱性形成的相關機制仍不清晰。Yu等[71]利用第三代基因組測序技術獲得了甜瓜屬人工異源四倍體的全基因組序列,并通過與親本基因組的比較基因組學分析,揭示了異源四倍體基因組中具有顯著的亞基因組優(yōu)勢現象,來自栽培黃瓜的亞基因組相比酸黃瓜基因組丟失的基因數/序列更少,占表達優(yōu)勢的基因數目更多。Yu等[71]進一步對未加倍的二倍體種間雜種進行全基因組測序與比較基因組學分析,結果表明,亞基因組優(yōu)勢在種間雜交過程中已經確立,在異源加倍過程中,基因組加倍對于基因組的影響與種間雜交各不相同。最后,通過分析甜瓜屬異源四倍體形成早期各世代基因組的變化,發(fā)現異源多倍體形成后的二倍體化穩(wěn)定過程可以分為2個階段,第1個階段為快速穩(wěn)定期,發(fā)生在最初的1～3個世代,絕大多數的基因組變化發(fā)生在這一階段,之后進入第2階段,基因組的變化逐漸變緩,只發(fā)生少數的基因/序列丟失[71]。可見,葫蘆科作物的多倍化全基因組分析為理解植物多倍化提供了重要的理論依據。

越來越多的證據顯示,多倍化除了對植物基因組有直接影響,對轉錄組、蛋白組、染色體行為和表觀基因組均有顯著的影響[76-78]。許哲等[79]對同源四倍體和二倍體西瓜的轉錄組進行比較分析,發(fā)現基因組加倍后大量的基因發(fā)生差異表達,推測氧化應激蛋白、脫落酸受體、乙烯響應轉錄因子等基因是西瓜多倍體形成的關鍵基因。龍婭麗等[80]通過高通量測序比較了同源四倍體和二倍體西瓜葉片的sRNA表達譜,鑒定了四倍體與二倍體中與抗逆脅迫相關的差異表達miRNA,結果表明,80.46%的miRNA在二倍體中上調表達,遠多于四倍體,推測miRNA介導的轉錄后調控在四倍體西瓜的抗逆性中發(fā)揮重要作用。Saminathan等[81]在四倍體西瓜中鑒定到全基因范圍內基因表達水平的改變,發(fā)現22個基因在不同組織中均發(fā)生了可變剪切,表明多倍化可能通過引起可變剪切產生不同的蛋白質,使重要轉錄因子和轉運蛋白的功能發(fā)生改變,從而影響精氨酸生物合成、葉綠素生物合成以及淀粉和蔗糖的代謝等生物學過程,最終影響表型。Garcia-Lozano等[82]研究發(fā)現,同源多倍體西瓜中高達88%的基因呈現出倍性效應表達差異,且大部分是上調表達的,同時,在四倍體西瓜中還檢測到大量的去甲基化區(qū)域,這些區(qū)域位于上調表達差異基因的啟動子、基因間區(qū)域以及轉錄起始位點附近。

此外,三維基因組學分析揭示了多倍化在西瓜中影響基因組的A/B結構改變,調控與植物生長、發(fā)育和脅迫響應相關基因的表達[82]?？梢?基因組的表觀遺傳修飾不僅僅來自線性DNA系列,也可能來自非隨機的空間結構[83]。Hi-C(high-through chromosome conformation capture)技術的出現推動了三維基因組學的發(fā)展。研究者利用Hi-C技術不僅證實了染色質疆域的存在,而且進一步發(fā)現了更多染色質的三維特征[84-85]。在植物三維基因組研究方面,對擬南芥和棉花多倍體的研究發(fā)現,多倍化帶來的三維結構變化與基因的表達調控有關,最終可能導致表型的改變[86-87]。

4 總結與展望

4.1 多倍體在不同葫蘆科作物中的研究

雖然葫蘆科作物中的多倍體研究與應用起步時間較早,且在西瓜、甜瓜等作物上也取得了較為豐碩的成果,但是與其他作物相比發(fā)展相對緩慢。從過去幾十年的研究中不難發(fā)現,葫蘆科作物的多倍體研究多數仍停留在多倍體誘導和鑒定上,而對于相關機制的深入研究并不多見,且絕大多數的研究以西瓜、甜瓜和黃瓜為研究對象,對其他葫蘆科作物涉及較少,這也基本符合園藝作物研究以實際生產需求為導向的特點。其中近一半以上的研究關注于多倍體西瓜的研究,這與生產上對三倍體無籽西瓜的重要需求密不可分。三倍體無籽西瓜是目前生產上利用同源多倍體面積最大的葫蘆科作物之一,因此,四倍體西瓜親本和三倍體雜種西瓜的選育和研究是西瓜多倍體研究的重中之重。相比之下,其他葫蘆科作物研究較少也有許多客觀的原因,例如研究受眾群體小、相關研究人員少,項目支持與經費有限等。近年來關于冬瓜、苦瓜、南瓜等其他葫蘆科作物的多倍化研究呈現出逐漸增加的趨勢,而關于西瓜、甜瓜、黃瓜多倍化相關的研究也在逐漸深入。相信多倍化在葫蘆科作物育種中也會受到越來越多的重視,從而發(fā)揮更大的作用。

4.2 葫蘆科作物多倍體研究的進化意義

多倍體植物能從生物大滅絕事件中“頑強”地存活并繁殖,這在很大程度上體現了多倍化對于物種進化的重大意義。特別是在全球氣候快速變化的今天,解析多倍化適應性優(yōu)勢形成的分子基礎,對于理解生物進化和開展作物遺傳育種等具有重要的理論指導意義與實踐應用價值。自然界中存在的天然多倍體距離形成之初已經歷成千上萬年的進化,其基因組及其祖先基因組均已發(fā)生許多改變,無法觀測多倍體形成早期的變化,而人工合成的多倍體,具有遺傳基礎清晰等特點,是研究探明多倍體早期進化機制的重要途徑。例如,甜瓜屬人工異源四倍體的創(chuàng)制完整地再現了多倍體作物形成早期的全過程,包括種間雜交、基因組加倍、初期二倍體化3個關鍵階段,為多倍體進化研究提供了非常有利的條件,其研究結果為理解植物多倍化相關機制提供了重要參考。葫蘆科作物是僅次于禾本科、豆科和茄科的第四大食用植物科之一,未來在更多的葫蘆科作物中開展類似的多倍化研究,能夠為全面揭示多倍化在物種多樣化與基因組進化上的意義提供重要的理論依據。

4.3 未來進一步研究的方向

綜上所述,隨著測序技術和表型組學的持續(xù)快速發(fā)展以及Hi-C等新分子技術的出現,接下來可以從以下幾方面進一步開展葫蘆科作物多倍體的研究:1)在苦瓜、絲瓜等更多的小眾葫蘆科作物中開展多倍體誘導,建立每個物種穩(wěn)定的誘導體系,提高誘導率,同時深入研究不同因素影響誘導率的分子機制,為穩(wěn)定獲得葫蘆科作物的多倍體材料提供理論基礎;2)借助表型組學方法建立葫蘆科作物快速高效的多倍體鑒定與篩選體系,提高獲得廣適應性和綜合性狀優(yōu)良多倍體的效率;3)在全球人口持續(xù)增長、氣候變化加劇、資源環(huán)境不斷惡化的大背景下,利用多倍化提高作物的多樣性,增強環(huán)境適應性是作物育種的重要內容,綜合利用多組學技術和先進的分子技術手段揭示多倍體抗性優(yōu)勢形成的分子機制,有助于實現精準改良,保障全球糧食安全和食物質量。