甘蔗及其制品中3-硝基丙酸檢測方法研究進(jìn)展

王彥力，寧德嬌，牙 禹，謝麗萍，蔣翠文，梁 靜，李燾，閆飛燕，唐 莉

（1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測技術(shù)研究所，廣西 南寧 530007；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甘蔗品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（南寧），廣西 南寧 530007）

1 前言

甘蔗是我國最主要的糖料作物［1］，也是人們喜愛食用的一種冬春季上市的水果。近年來，隨著農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)的快速發(fā)展，各種甘蔗飲品也迅速進(jìn)入市場，并受到了消費(fèi)者的青睞。但是南方高溫高濕的天氣，使甘蔗在儲藏、運(yùn)輸過程中容易滋生甘蔗節(jié)陵孢和蔗生節(jié)陵孢，進(jìn)而生成一種有毒的代謝產(chǎn)物3-硝基丙酸（3-Nitropropionic Acid，3-NPA）［2］。除霉變甘蔗外，3-NPA也存在于一些高等植物中［3］，還可由曲霉屬和青霉屬的部分菌種產(chǎn)生［4］。作為一種強(qiáng)烈的神經(jīng)毒素，3-NPA能抑制線粒體琥珀酸脫氫酶，且不可逆轉(zhuǎn)，因而會阻礙三羧酸循環(huán)［5-6］。3-NPA可穿過血腦屏障從而損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，若人體過量攝入3-NPA，會出現(xiàn)嘔吐、眩暈、肌張力障礙、肌痙攣等急性中毒癥狀，嚴(yán)重?fù)p害健康，甚至危及生命［7］，我國曾報(bào)道過多起因食用含有3-NPA的甘蔗而引起中毒的事件［8-10］。因此，甘蔗及其制品中3-NPA含量的監(jiān)測不僅有利于保障消費(fèi)者的身體健康，對于促進(jìn)甘蔗及其加工產(chǎn)業(yè)的有序發(fā)展也具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

當(dāng)前文獻(xiàn)報(bào)道的3-NPA檢測方法主要為色譜法，也是當(dāng)前國家標(biāo)準(zhǔn)使用的檢測方法，其靈敏度高、結(jié)果可靠。但色譜儀購置和使用成本高昂、操作繁瑣、使用和維護(hù)需要很強(qiáng)的技術(shù)性，難以實(shí)現(xiàn)智能化、低成本快速檢測，在農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)基地和中小企業(yè)并不具很好的普及性。近年來，3-NPA的快速檢測技術(shù)受到研究者越來越多的關(guān)注，隨著新技術(shù)的開發(fā)和新材料的應(yīng)用，熒光和電化學(xué)傳感技術(shù)在3-NPA檢測方面展示出強(qiáng)大的分析性能和廣闊的應(yīng)用前景。本文主要介紹國內(nèi)外甘蔗及其制品中3-NPA檢測方法的研究進(jìn)展，著重介紹各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)及發(fā)展方向，為構(gòu)筑更為精準(zhǔn)、靈敏、高效的3-NPA的檢測方法提供參考。

2 檢測方法

2.1 色譜法

2.1.1 薄層色譜法

3-NPA檢測早期使用較多的是薄層色譜法［11-12］，樣品經(jīng)過提取、凈化后，3-NPA在薄層色譜板上與顯色劑反應(yīng)形成熒光產(chǎn)物，使用熒光掃描儀測定其含量，方法檢出限為2 mg/kg。因?yàn)殪`敏度和準(zhǔn)確度上的不足，及近年來色譜技術(shù)的快速發(fā)展，薄層色譜法已經(jīng)很少被用于3-NPA的測定。

2.1.2 氣相色譜法

氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分離3-NPA的效果好，檢測也較靈敏。汪儆等［13］分別使用氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用對豆科植物中3-NPA進(jìn)行定量和定性分析，并對4種不同牧草產(chǎn)生3-NPA的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了評估；劉勇等［14］使用氣相色譜-熱能檢定器測定大鼠血漿內(nèi)的3-NPA的含量，靈敏度可達(dá)4 ng/mL。目前未見利用氣相色譜和氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜對甘蔗及其制品中3-NPA含量測定的相關(guān)研究報(bào)道。

2.1.3 高效液相色譜法

高效液相色譜是目前實(shí)際應(yīng)用和研究報(bào)道較多的3-NPA檢測技術(shù)。2022年國家市場監(jiān)督管理總局發(fā)布的食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法BJS 202205《甘蔗及甘蔗汁中3-NPA的測定》［15］中3-NPA的檢測方法為高效液相色譜，使用的是二極管陣列檢測器，當(dāng)取樣量為2 g時(shí)，方法的檢出限和定量限分別為0.3 mg/kg和1.0 mg/kg。吳越等［16］采用C18色譜柱，以乙腈-KH2PO4溶液為流動相，等度洗脫，在210 nm波長下檢測霉變甘蔗樣品中的3-NPA，外標(biāo)法定量，線性范圍為0.5~20.0 mg/kg，檢出限為0.05 mg/kg，加標(biāo)回收率為91.7%~99.4%。高效液相色譜法不受3-NPA揮發(fā)性的限制，準(zhǔn)確度高，且當(dāng)以空白基質(zhì)加標(biāo)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)可消除基質(zhì)干擾。

2.1.4 高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法和超高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法

高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法和超高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法是將液相色譜儀與質(zhì)譜儀分別作為分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)的方法，結(jié)合了液相色譜分離待測組分和質(zhì)譜鑒定結(jié)構(gòu)的功能。劉紅河等［17］采用超高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜測定甘蔗和甘蔗渣中3-NPA的含量，線性范圍為1.0~50μg/kg，甘蔗和甘蔗渣的方法檢出限分別為0.30μg/kg和0.06μg/kg，加標(biāo)回收率為86.9%~102.0%。付云等［18］采集湖州地區(qū)市售甘蔗進(jìn)行3-NPA的檢測，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較了不同時(shí)間段市售甘蔗所含3-NPA的量，該方法的回收率在86.2%~105.3%，線性范圍為10~500 μg/kg，檢出限為0.03μg/kg。液質(zhì)聯(lián)用與液相色譜相比，具有靈敏度高、樣品不需衍生且用量少、分析快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

2.1.5 離子色譜法

離子色譜法是根據(jù)待測物中的離子與離子交換柱的電荷作用力的差異對離子進(jìn)行分離，依靠光學(xué)或電化學(xué)儀器檢測物質(zhì)的方法。邵國健等［19-20］先后采用了免試劑離子色譜法和固相萃取—離子色譜法對甘蔗中的3-NPA進(jìn)行測定，在0.1~50μg/mL線性良好，樣品平均加標(biāo)回收率為89.2%~102%，檢出限為0.03 mg/kg。離子色譜法操作較簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，但靈敏性相對較差。

總體來說，色譜法檢測甘蔗及其制品中的3-NPA含量，準(zhǔn)確度佳，但方法靈敏度不一，受前處理影響較大。色譜法的樣品前處理過程一般采用液—液萃?。?2，15］或固相萃取［21-24］，步驟繁瑣，對3-NPA分離純化的效果因萃取劑或固相萃取柱填料而異，且均需要使用大量有機(jī)溶劑，不利于環(huán)保，也會損害操作人員的健康。新型前處理技術(shù)如凝膠滲透色譜［16］和分子印跡［25-26］用于分離純化甘蔗中的3-NPA，分析速度快，回收率高，有機(jī)溶劑用量少，尤其是采用分子印跡材料作為固相萃取柱填料，能選擇性吸附3-NPA，極大地提高了分離純化效率。

2.2 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法是應(yīng)用高電壓在散熱效率很高的毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行的電泳［27］，適合極性小分子分析，分離效率高，且樣品前處理簡單。解娜等［28］使用毛細(xì)管電泳分離結(jié)合二極管陣列檢測器檢測甘蔗中的3-NPA，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，3-NPA的質(zhì)量濃度在1.0~100.0 mg/L范圍內(nèi)與其對應(yīng)的校正峰面積呈良好的線性關(guān)系，方法檢出限為0.3 mg/L，回收率為95.2%~103.9%。此法無需有機(jī)溶劑，樣品基質(zhì)干擾小，準(zhǔn)確度和精密度高，且毛細(xì)管柱易清洗和再生，但是方法的靈敏度難以滿足檢測樣品中微量3-NPA的需求。此外，電滲可能改變樣品組成，從而影響分離重現(xiàn)性。

2.3 熒光法

發(fā)光金屬有機(jī)框架材料是近些年興起的一種熒光材料，具有較高的孔隙率和較大的比表面積、多樣的結(jié)構(gòu)及高度可調(diào)的發(fā)光性能等優(yōu)點(diǎn)，非常適于作為探針檢測有機(jī)小分子及離子［29-32］。最近，有多篇相類似的關(guān)于此類材料作為熒光探針檢測3-NPA的研究報(bào)道［33-36］，方法上都是合成得到在一定范圍內(nèi)對pH敏感的發(fā)光金屬有機(jī)框架材料，當(dāng)向溶液加入3-NPA后pH值發(fā)生變化，引起熒光信號的改變，從而建立3-NPA的熒光分析方法。此類檢測3-NPA的方法，材料可經(jīng)適當(dāng)處理后重復(fù)利用，響應(yīng)迅速，有的方法甚至能實(shí)現(xiàn)可視化檢測，但檢測靈敏度普遍不高（檢出限最低也只能達(dá)到1.0μmol/L），當(dāng)前并不具備很好的推廣應(yīng)用價(jià)值。

2.4 電化學(xué)傳感技術(shù)

電化學(xué)傳感分析具有操作簡便、成本低廉、靈敏快速、適合現(xiàn)場在線監(jiān)測等特點(diǎn)，與其他方法相比，在分析速度、檢測成本及靈敏度上具有較大優(yōu)勢。本課題組［37］利用3-NPA對乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用制備了一種穩(wěn)定、靈敏的乙酰膽堿酯酶電化學(xué)生物傳感器，在最佳條件下，抑制率與3-NPA濃度的對數(shù)在0.10~30μg/L范圍內(nèi)線性良好，檢測限為0.05μg/L，用于甘蔗樣品中3-NPA測定加標(biāo)回收率在88.8%~98.2%之間，檢測靈敏度遠(yuǎn)優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。但是常見的Cd2+、Cr3+、Hg2+等重金屬離子和吡蟲啉等農(nóng)藥同樣對乙酰膽堿酯酶具有抑制作用，對檢測產(chǎn)生明顯的干擾。為此，如何提升傳感器件的選擇性，構(gòu)建兼具高靈敏度和高選擇性的3-NPA傳感器，對促進(jìn)電化學(xué)傳感技術(shù)在3-NPA檢測的進(jìn)一步應(yīng)用具有重要意義。

3 總結(jié)與展望

本文主要介紹了甘蔗及其制品中3-NPA檢測方法的相關(guān)研究進(jìn)展。液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用是檢測3-NPA最常用的方法，技術(shù)比較成熟，準(zhǔn)確度和靈敏度較高，基本可以滿足各種不同樣品的分析要求。但其使用成本高昂、需要專業(yè)的技術(shù)人員和固定的檢測場所，且?guī)缀醵夹枰M(jìn)行復(fù)雜的前處理過程，操作繁瑣費(fèi)時(shí)，在樣品的快速篩查上并不具備優(yōu)勢。熒光法和電化學(xué)法在成本、分析速度及儀器的微型化上具有很好的優(yōu)勢，在3-NPA的快速分析上顯示出巨大的潛力，但要投入實(shí)際應(yīng)用仍需解決方法的靈敏度、選擇性及復(fù)現(xiàn)性等問題。

為了提高3-NPA的檢測效率、靈敏度和準(zhǔn)確性，一方面可以開發(fā)選擇性高、分離速度快的材料，如分子印跡聚合物、磁性材料等，提升3-NPA的分離純化效率。另一方面，可進(jìn)一步探索設(shè)計(jì)靈敏度更高、選擇特異性更為優(yōu)異的新材料與熒光、電化學(xué)等分析方法相結(jié)合，提升方法的靈敏性和選擇性，為構(gòu)建3-NPA的現(xiàn)場快速篩查提供有力的技術(shù)支持。此外，目前有關(guān)3-NPA檢測的研究基本集中在甘蔗及其制品，但食物中毒事件發(fā)生后，食物樣本往往沒有保存，因此，建立人體血液、嘔吐物、排泄物等樣本中3-NPA的檢測方法，對于中毒原因的診斷至關(guān)重要。