HDV RNA檢測(cè)的臨床意義與方法

林妍雪，秦艷麗，張繼明

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科，上海市傳染病與生物安全應(yīng)急響應(yīng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家傳染病醫(yī)學(xué)中心，上海 200040

HDV是由意大利Rizzetto等［1］從重癥乙型肝炎患者肝組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)并于1977年首次報(bào)道。HDV RNA與HDAg結(jié)合為核衣殼，依賴HBsAg包膜進(jìn)行包裝從而進(jìn)出肝細(xì)胞建立感染，即HDV是HBV的衛(wèi)星病毒［2－3］。雖然HDV是迄今為止已知對(duì)人有感染性的最小病毒，基因組長(zhǎng)度僅有1672～1697 bp［4］，但是能夠?qū)е伦顕?yán)重的病毒性肝炎。HDV感染主要有兩種形式，一種是患者首次同時(shí)暴露于HBV和HDV，稱為HBV/HDV聯(lián)合感染（co－infection），多數(shù)可自發(fā)康復(fù)，少數(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)橹匕Y肝炎；另一種是在既往感染HBV的基礎(chǔ)上暴露于HDV，稱為重疊感染，其中70%～90%將發(fā)展為慢性HDV感染［5－6］。與HBV單一感染相比，合并HDV感染會(huì)加速肝臟炎癥進(jìn)展至肝硬化、肝癌及其他終末期肝?。?－9］，平均于5年內(nèi)進(jìn)展為肝硬化，10年內(nèi)進(jìn)展為肝細(xì)胞癌［10］。

由于各地區(qū)HDV感染的發(fā)病率、檢測(cè)率不一，檢測(cè)手段的靈敏度、特異度參差，不同研究對(duì)于丁型肝炎的流行率統(tǒng)計(jì)結(jié)果不盡相同。近年發(fā)表的幾篇大型Meta分析顯示，目前全球HDV感染者總數(shù)約為1200萬(wàn)～6000萬(wàn)，甚至可能達(dá)到7200萬(wàn)，HDV流行率在總?cè)巳褐袨?.16%～0.8%，在HBsAg陽(yáng)性人群中達(dá)到4.5%～13%［10－12］，顛覆了既往人們普遍認(rèn)為丁型肝炎發(fā)病率低的看法。

由于HDV的傳播依賴于HBV，關(guān)于丁型肝炎診治的意見多是在HBV相關(guān)指南中提出。2015年世界衛(wèi)生組織（WHO）慢性乙型肝炎指南提出HDV的活動(dòng)性感染應(yīng)該由高滴度的HDV抗體診斷，通過血清HDV RNA檢測(cè)來證實(shí)［13］。2015年亞太肝病學(xué)會(huì)（APASL）推薦通過HDV RNA、HDV抗原或抗HDV IgM檢測(cè)來確認(rèn)HDV活動(dòng)感染［14］。2017年歐洲肝病學(xué)會(huì)（EASL）推薦在所有慢性乙型肝炎患者中篩查各類血源傳播病毒［15］。2018年美國(guó)肝病學(xué)會(huì)（AASLD）建議對(duì)具有HDV感染風(fēng)險(xiǎn)的HBsAg陽(yáng)性者進(jìn)行丁型肝炎檢測(cè)，包括HIV感染者、注射吸毒者、男男性行為者、來自HDV高流行地區(qū)的移民，以及HBV DNA低但轉(zhuǎn)氨酶高的患者；其推薦的篩查測(cè)試是HDV

抗體，測(cè)試結(jié)果為陽(yáng)性的進(jìn)一步進(jìn)行HDV RNA檢測(cè)以診斷活動(dòng)性HDV感染［16］。目前不同指南對(duì)于丁型肝炎篩查對(duì)象及診斷方案的意見并不完全一致，不過檢測(cè)現(xiàn)狀顯然沒能達(dá)到上述任一指南的要求。本文就HDV RNA檢測(cè)的臨床意義及方法進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期推動(dòng)丁型肝炎篩查的普及和檢測(cè)質(zhì)量的提高。

1 HDV RNA檢測(cè)的臨床意義

1.1 血液中檢出HDV RNA是丁型肝炎現(xiàn)癥感染的金標(biāo)準(zhǔn) 長(zhǎng)期以來，對(duì)于HDV感染的評(píng)判常常是通過酶免疫法或放射免疫法來檢測(cè)HBV感染者血清中是否存在HDV抗體。這一方法操作簡(jiǎn)便且成本低廉，但其不足也顯而易見：其一，在丁型肝炎感染早期，血HDV病毒載量迅速上升，而抗體卻遲遲不能檢出，HDV抗原雖在一段時(shí)間后可以測(cè)得，但不久就會(huì)同機(jī)體產(chǎn)生的抗體結(jié)合形成復(fù)合物，此時(shí)若依賴HDV抗原抗體檢測(cè)結(jié)果則有很大概率出現(xiàn)漏診［17－18］。其二，HDV IgG在HDV感染后長(zhǎng)期存在，其陽(yáng)性結(jié)果只能說明既往有過感染卻無(wú)法體現(xiàn)感染是否仍然持續(xù)。其三，現(xiàn)有的HDV抗體檢測(cè)試劑盒良莠不齊，靈敏度不盡如人意，上海一項(xiàng)研究［19］使用抗HDV－IgG商業(yè)試劑盒對(duì)225例轉(zhuǎn)氨酶升高的HBsAg陽(yáng)性患者進(jìn)行血清抗體檢測(cè)，結(jié)果無(wú)一陽(yáng)性，但對(duì)同一批樣本進(jìn)行HDV RNA檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率達(dá)到4.9%。

肝組織中檢出HDAg及血中檢出HDV RNA都是HDV復(fù)制的直接證據(jù)，可作為丁型肝炎現(xiàn)癥感染的可靠依據(jù)［20］，然而HDAg與抗－HDV形成免疫復(fù)合物導(dǎo)致其不易檢出，靈敏度欠佳，且肝活檢有一定創(chuàng)傷性而難以常規(guī)開展。血HDV RNA檢測(cè)則因其兼具靈敏度和實(shí)用性而被公認(rèn)為診斷活動(dòng)性HDV感染的最佳指標(biāo)。在臨床實(shí)踐中，血清/血漿中HDV RNA不能檢出是診斷丁型肝炎治愈的必要條件。

1.2 HDV病毒血癥與丁型肝炎不良預(yù)后相關(guān) 在丁型肝炎抗體陽(yáng)性人群中，檢出HDV RNA的患者有著更差的臨床結(jié)局。西班牙一項(xiàng)研究［9］對(duì)118例抗－HDV陽(yáng)性患者中位隨訪8年后，起始測(cè)得HDV RNA陽(yáng)性的患者更容易發(fā)展為肝硬化（31%vs 0，P＝0.002）和肝臟失代償（28%vs 3%，P＝0.019）。瑞典多家二級(jí)醫(yī)院合作開展的中位隨訪6.5年的觀察研究［21］發(fā)現(xiàn)，在337例HDV抗體陽(yáng)性患者中，有HDV病毒血癥的患者肝臟不良事件的發(fā)生率為無(wú)HDV病毒血癥患者的3.8倍。意大利一項(xiàng)對(duì)299例HDV感染者長(zhǎng)達(dá)28年的隨訪研究［7］中，HDV持續(xù)復(fù)制造成肝硬化和肝細(xì)胞癌的年發(fā)病率分別為4%和2.8%，是肝臟相關(guān)病死率的唯一預(yù)測(cè)指標(biāo)。Romeo等［22］發(fā)現(xiàn)對(duì)于就診時(shí)尚未發(fā)生肝硬化的丁型肝炎患者，其HDV病毒血癥水平越高，進(jìn)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌的傾向就越大。而與HDV RNA持續(xù)陽(yáng)性或一過性陰轉(zhuǎn)的患者相比，HDV RNA清除與更高的無(wú)事件生存率顯著相關(guān)［23］。

1.3 啟動(dòng)丁型肝炎治療有賴于HDV RNA精確定量 對(duì)于丁型肝炎患者，“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療”有助于延緩甚至逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展，從而改善預(yù)后。通過對(duì)HBsAg陽(yáng)性的患者檢測(cè)HDV RNA，有助于及時(shí)識(shí)別丁型肝炎患者，確定其治療方案是單獨(dú)使用核苷（酸）類似物、還是單獨(dú)使用聚乙二醇干擾素（PEG－IFN）或者二者聯(lián)合治療［16］。目前推薦代償期慢性丁型肝炎患者的首選治療方案為PEG－IFN應(yīng)用至少48周；由于核苷（酸）類似物對(duì)HDV感染無(wú)效，因此不建議將其用于除肝硬化患者之外的HBV低復(fù)制的患者；而對(duì)于HBV DNA持續(xù)復(fù)制或水平升高的丁型肝炎患者，則應(yīng)考慮核苷（酸）類似物治療［15－16］。

更高的HDV RNA檢測(cè)靈敏度意味著更多丁型肝炎患者能夠被識(shí)別和救治。德國(guó)一項(xiàng)研究［24］使用RoboGene HDV RNA定量試劑盒（首款通過CE－IVD認(rèn)證的HDV RNA試劑盒）對(duì)以往HIDIT－Ⅱ臨床試驗(yàn)中收集的372個(gè)血液標(biāo)本重新進(jìn)行HDV RNA檢測(cè)，因最低檢出限由原來的930 IU/mL降低到了14 IU/mL，此前檢測(cè)為陰性的血液標(biāo)本中有1/3復(fù)測(cè)得到陽(yáng)性結(jié)果［25］。

1.4 HDV RNA水平是監(jiān)測(cè)和預(yù)測(cè)抗HDV藥物療效的主要指標(biāo) Farci等［26］開展了用不同劑量IFNα－2a治療慢性丁型肝炎患者的隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)相比于低劑量IFN治療組和未治療組，高劑量IFN治療組患者血清HDV RNA滴度顯著持續(xù)下降，相對(duì)應(yīng)地，其停藥后的肝臟組織病理、臨床結(jié)局、生存率也有不同程度改善。Keskin等［27］發(fā)現(xiàn)PEG－IFN治療24周的HDV RNA水平是療程結(jié)束24周時(shí)病毒學(xué)應(yīng)答的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素；HDV RNA下降幅度可以預(yù)測(cè)治療結(jié)局［28－29］。Yurdaydin等［30］對(duì)IFN治療后的丁型肝炎患者開展了中位時(shí)間為55個(gè)月的隨訪研究，產(chǎn)生持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答（停藥后HDV RNA持續(xù)陰性至少兩年）的患者與未產(chǎn)生持續(xù)性應(yīng)答的患者相比，出現(xiàn)并發(fā)癥和死于肝臟相關(guān)疾病的概率都明顯降低。Bulevirtide、lonafarnib等丁型肝炎治療新藥仍在審評(píng)中［31］，用藥前后對(duì)患者HDV水平進(jìn)行長(zhǎng)期準(zhǔn)確定量使得在國(guó)際多中心臨床試驗(yàn)中評(píng)估HDV新療法的優(yōu)劣成為可能，也是制定丁型肝炎患者管理共識(shí)的必經(jīng)之路。目前各臨床試驗(yàn)中丁型肝炎治療目標(biāo)暫無(wú)統(tǒng)一意見，通常以停藥6個(gè)月以后無(wú)法檢測(cè)到血清HDV RNA或者療程結(jié)束時(shí)HDV RNA較基線下降≥2 log作為療效指標(biāo)［32］。

1.5 HDV RNA檢測(cè)是對(duì)HDV進(jìn)行基因分型的基礎(chǔ) HDV具有廣泛的遺傳多樣性，全基因組序列的變異程度可達(dá)40%，目前通過對(duì)已知毒株RNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析將其分為8種基因型（HDV－1～8），各基因型還可進(jìn)一步分為2～4種基因亞型［33－34］。通常，全基因組核苷酸序列相似度＞80%或基因組R0區(qū)域（889～1289）核苷酸序列相似度＞85%的兩個(gè)病毒株同屬一個(gè)基因型，全基因組核苷酸序列相似度＞90%（HDV－1＞84%）的兩個(gè)病毒株屬于同一個(gè)基因亞型［34］。不同HDV基因型和基因亞型的地域分布有所差異，亞洲主要分布有HDV－1、HDV－2和HDV－4［4，33－34］。

HDV基因型與丁型肝炎臨床病程及結(jié)局相關(guān)聯(lián)。Su等［35］研究表明，中位隨訪135個(gè)月后HDV－1型感染者相較于HDV－2型感染者有更低的臨床緩解率（15.2%vs 40.2%，P＝0.007）、更高的肝細(xì)胞癌發(fā)生率（32.6%vs 11.1%，P＝0.008）和病死率（45.7%vs 22.2%，P＝0.013）。HDV－4與HDV－2相似，較少造成嚴(yán)重臨床后果。HDV－3引起的急性感染是造成南美洲暴發(fā)性肝炎的主要因素［36］。在撒哈拉以南的非洲患者中，HDV－5比HDV－1更易致使肝臟纖維化［37］。HDV不同基因型和基因亞型致病性存在差異的原因尚未完全闡明，可能與RNA復(fù)制編輯及病毒組裝的效率相關(guān)［38－39］。

2 HDV RNA的檢測(cè)方法進(jìn)展

2.1 核酸印跡雜交 在PCR技術(shù)尚未發(fā)展的20世紀(jì)80年代，HDV RNA的檢測(cè)主要依賴核酸印跡雜交。其檢測(cè)流程是：抽提血清中的RNA，變性后直接轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素或尼龍膜，或通過變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離后轉(zhuǎn)移固定到膜上，用HDV RNA探針（放射性同位素標(biāo)記的HDV cDNA片段［40］或由體外轉(zhuǎn)錄HDV RNA［41］）雜交，洗膜后對(duì)其進(jìn)行顯影［42］。其優(yōu)點(diǎn)是可以半定量檢測(cè)HDV RNA，操作所需試劑儀器都易于取得，缺點(diǎn)則在于印跡雜交技術(shù)對(duì)于HDV RNA檢測(cè)的靈敏度有限［41］。

2.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT－PCR）技術(shù) 第1篇關(guān)于PCR技術(shù)的文獻(xiàn)［43］發(fā)表于1985年，其原理是在體外模擬遺傳物質(zhì)的天然復(fù)制，以微量的核酸模板擴(kuò)增得到大量的特定DNA片段。PCR面世不久就被應(yīng)用于HDV RNA的檢測(cè)［41］，擴(kuò)增產(chǎn)物可根據(jù)需要進(jìn)一步進(jìn)行核酸雜交或者測(cè)序，而隨著PCR技術(shù)不斷發(fā)展，HDV RNA檢測(cè)的靈敏度和特異度也在不斷提升。

常規(guī)反轉(zhuǎn)錄PCR：提取并純化待測(cè)患者血液中的RNA成分，將其反轉(zhuǎn)錄所得cDNA作為擴(kuò)增模板，選用一對(duì)HDV保守序列特異的引物，通過一定循環(huán)次數(shù)的變性、退火、延伸，獲得所需片段的拷貝。Madejón等［41］用RT－PCR產(chǎn)物進(jìn)行Southern印記雜交，發(fā)現(xiàn)常規(guī)PCR方法檢測(cè)HDV RNA比狹縫雜交要靈敏10 000倍。

反轉(zhuǎn)錄巢式PCR（RT－nested PCR）：針對(duì)HDV RNA序列設(shè)計(jì)內(nèi)外兩對(duì)引物，外引物用于血清cDNA的第一輪PCR，擴(kuò)增包含延伸側(cè)翼區(qū)域的片段，第二輪PCR以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，由內(nèi)引物識(shí)別目標(biāo)區(qū)域繼續(xù)擴(kuò)增。巢式PCR能提高擴(kuò)增倍數(shù)同時(shí)減少非特異擴(kuò)增，從而更加靈敏且特異地檢測(cè)HDV RNA含量［44］。

實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄PCR（qRT－PCR）：qRT－PCR是指在PCR反應(yīng)中加入熒光物質(zhì)，通過在PCR過程中檢測(cè)熒光信號(hào)來實(shí)時(shí)判斷核酸擴(kuò)增情況，而后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)模板進(jìn)行定量分析的方法。根據(jù)所用熒光物質(zhì)的不同，qPCR方法主要分為染料法和探針法。染料法是利用熒光染料游離時(shí)不發(fā)光而結(jié)合于雙鏈DNA小溝后發(fā)出熒光的特性，使得熒光信號(hào)強(qiáng)度隨著PCR雙鏈產(chǎn)物增加而成比增長(zhǎng)，其優(yōu)點(diǎn)是成本較低，缺點(diǎn)在于非特異性產(chǎn)物和引物二聚體也可引起熒光信號(hào)，特異性不足［45］。探針法則是利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，探針上的報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)于PCR延伸階段分離從而產(chǎn)生熒光信號(hào)，當(dāng)探針設(shè)計(jì)良好時(shí)，此方法比染料法更為靈敏和特異，但成本也相對(duì)提高［46］。Yamashiro等［47］在2004年首次描述了應(yīng)用SYBR Green熒光染料對(duì)HDV RNA進(jìn)行RT－PCR定量方法，其對(duì)于合成HDV RNA片段的檢出限為1000拷貝/mL。Le等［48］在2005年描述了利用Taqman探針檢測(cè)HDV RNA的方法，對(duì)血清HDV RNA檢出限為100拷貝/mL。目前應(yīng)用于HDV RNA檢測(cè)的主流熒光方案是Taqman探針，其次為Fret探針、分子信標(biāo)以及SYBR Green染料［49］。

近些年HDV RNA實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)的流程和細(xì)節(jié)設(shè)計(jì)得到了不同維度的優(yōu)化。一步法qRT－PCR使得cDNA合成與PCR擴(kuò)增在同一管中相繼完成，相比于分兩步進(jìn)行，簡(jiǎn)化工作流程、節(jié)約時(shí)間的同時(shí)降低了污染可能性。UDG酶和dUTP的應(yīng)用有助于消除PCR殘留核酸污染，降低實(shí)驗(yàn)樣本的假陽(yáng)性率。Wang等［50］針對(duì)HDV序列的兩處保守片段設(shè)計(jì)了雙靶標(biāo)引物和探針，任一片段檢測(cè)到陽(yáng)性即判斷該樣本為HDV RNA陽(yáng)性，理論上能夠減少由于病毒變異所致的檢測(cè)靈敏度下降，降低漏檢的發(fā)生。高溫變性后冷凍（95℃放置10 min后立即冷卻至80℃）的方法被證實(shí)可以更好地破壞HDV RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高逆轉(zhuǎn)錄效率［51］。檢測(cè)增強(qiáng)劑（detection enhancer）被認(rèn)為可能有利于松弛二級(jí)結(jié)構(gòu)以及擴(kuò)增富含GC的核酸片段［18］。

反轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR（RT－dPCR）：數(shù)字PCR將待測(cè)樣品隨機(jī)分配到大量獨(dú)立的反應(yīng)單元中，每個(gè)反應(yīng)單元分別單獨(dú)進(jìn)行核酸擴(kuò)增后分析其熒光信號(hào)的有無(wú)，將判斷結(jié)果按照泊松分布的原理進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析從而得到靶分子的拷貝數(shù)及濃度。數(shù)字PCR可以實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒核酸的絕對(duì)定量，其相對(duì)于qPCR靈敏度更高，具有耐受性好，標(biāo)本用量少等優(yōu)勢(shì)；但由于其系統(tǒng)復(fù)雜度增加且成本較高，目前尚未得到廣泛應(yīng)用。Olivero等［52］設(shè)計(jì)了使用ddPCR檢測(cè)HDV載量的方法，同時(shí)用qPCR與其進(jìn)行比較，結(jié)論是ddPCR方法檢測(cè)HDV RNA具有媲美qPCR的精度與重現(xiàn)性，同時(shí)其最低定量限為qPCR方法的1/5。目前應(yīng)用數(shù)字PCR對(duì)HDV RNA進(jìn)行檢測(cè)的文獻(xiàn)屈指可數(shù)，未來仍需更多的研究來對(duì)該方法的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop－mediated isothermal amplification，LAMP） LAMP是由Notomi等［53］在1998年設(shè)計(jì)的一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，在60℃～65℃的穩(wěn)定溫度下依賴2～3對(duì)特異性引物和鏈置換DNA聚合酶，持續(xù)循環(huán)合成DNA。其優(yōu)勢(shì)為速度快、操作簡(jiǎn)便、設(shè)備要求簡(jiǎn)單、裸眼觀察濁度即可判讀結(jié)果；不足之處在于引物設(shè)計(jì)難度高且需要所有引物都與序列匹配才能擴(kuò)增，而HDV易于變異，一套引物可能只能滿足部分毒株的擴(kuò)增需要［54－55］。Wang等［54］開發(fā)了用于HDV－1檢測(cè)的RT－LAMP體系，認(rèn)為此方法靈敏度不亞于常規(guī)RT－qPCR。

3 HDV檢測(cè)的定量標(biāo)準(zhǔn)品選擇

目前絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室選擇qRT－PCR方法對(duì)HDV RNA進(jìn)行定量，選用的定量標(biāo)準(zhǔn)品主要包括質(zhì)粒、體外轉(zhuǎn)錄的RNA、自制患者血清標(biāo)準(zhǔn)品、裝甲R(shí)NA以及國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品。用含有HDV cDNA片段的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品的主要優(yōu)點(diǎn)在于質(zhì)粒穩(wěn)定性佳，可重復(fù)性好，不足在于無(wú)法參與并監(jiān)控RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄過程。體外轉(zhuǎn)錄的HDV RNA能夠參與核酸提取和逆轉(zhuǎn)錄，但因完全裸露而可能被環(huán)境中的核酸酶降解或受各類理化因素影響［47］，且亞基因組RNA與天然完整的HDV RNA的結(jié)構(gòu)并不一致，也不具備病毒包膜，從而無(wú)法真正模擬臨床樣本中HDV病毒顆粒的裂解變性過程［51］。Homs等［51］建立了具有完整HDV基因組序列的RNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)過凍融仍保持穩(wěn)定，或許能夠在一定程度上模擬臨床樣本中HDV RNA的結(jié)構(gòu)和行為。自制患者血清標(biāo)準(zhǔn)品是從高HDV病毒載量的慢性丁型肝炎患者體內(nèi)獲得的，其最大優(yōu)勢(shì)在于能夠完整復(fù)刻真實(shí)樣本的檢測(cè)，不足之處則在于此類標(biāo)準(zhǔn)品中含有真實(shí)HDV顆粒而具有傳染性，可能面臨倫理問題，且無(wú)法大量供應(yīng)［56］。裝甲R(shí)NA是將目的RNA序列包裹到某種病毒外殼或其他蛋白外殼中構(gòu)建而成，具有可耐受核酸酶、穩(wěn)定性高、生物危險(xiǎn)性低的特點(diǎn)，同時(shí)也能參與核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增、檢測(cè)的全過程，從而更好地完成質(zhì)控，是較為理想的標(biāo)準(zhǔn)品選擇［57］。但目前似乎尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道合成具有完整HDV基因組的裝甲R(shí)NA，可能是因其具有一定的技術(shù)難度。以上四類標(biāo)準(zhǔn)品的共同缺點(diǎn)在于各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果不具有可比性，為推進(jìn)HDV RNA檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，2013年WHO建立了第一批HDV RNA國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品［58］。該標(biāo)準(zhǔn)品是將患者血漿樣本中分離得到的HDV－1型毒株以人源陰性血漿稀釋后制成的凍干制劑。使用者自行將其用0.5 mL的無(wú)核酸酶水溶解后即可得到5.75×105IU/mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿，該濃度是由多中心分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR協(xié)作定值。但因其獲取困難、價(jià)格昂貴，目前尚未得到全面普及。

4 小結(jié)與展望

長(zhǎng)期以來，人們對(duì)HDV感染的臨床認(rèn)識(shí)普遍不足，加之缺乏標(biāo)準(zhǔn)而可及的檢測(cè)方案和試劑，導(dǎo)致HBsAg陽(yáng)性人群中HDV檢測(cè)率嚴(yán)重低下，丁型肝炎診斷多有遺漏。臨床上廣泛用于治療慢乙型肝炎的核苷（酸）類似物對(duì)HDV感染并無(wú)改善作用［59］，丁型肝炎診斷不足無(wú)形之中帶來巨大疾病負(fù)擔(dān)。

目前國(guó)際上以RT－PCR為主流的HDV RNA檢測(cè)方案持續(xù)優(yōu)化，靈敏度、特異度都在不斷提高，高通量、自動(dòng)化更是大勢(shì)所趨。現(xiàn)有的不少HDV RNA檢測(cè)方法對(duì)HDV－1反應(yīng)良好，對(duì)其他基因型的檢測(cè)能力卻相對(duì)低下，原因之一在于HDV RNA序列的異質(zhì)性對(duì)引物和探針的保守性提出了更高的要求，其次在于HDV序列易自身折疊形成復(fù)雜結(jié)構(gòu)從而影響反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的效率［49］。為了增加檢驗(yàn)的靈敏度，理想的引物和探針應(yīng)設(shè)計(jì)于高度保守的區(qū)域，同時(shí)要考慮到RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)反轉(zhuǎn)錄的影響。HDV國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的出現(xiàn)使得對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行校正成為可能，但目前只有HDV－1基因型，希望其未來可以繼續(xù)推出其他7種基因型HDV標(biāo)準(zhǔn)品，使得各方法對(duì)于血液HDV RNA含量的測(cè)定能力得以全面準(zhǔn)確評(píng)價(jià)。普及丁型肝炎感染知識(shí)，在HDV易感人群中全面開展血HDV RNA檢測(cè)，對(duì)推動(dòng)丁型肝炎早診早治，降低丁型肝炎疾病負(fù)擔(dān)具有重大意義。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：林妍雪負(fù)責(zé)查閱文獻(xiàn)和撰寫文章；秦艷麗負(fù)責(zé)修改文章；張繼明負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。