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    液體活檢在肝細(xì)胞肝癌早期篩查中的作用及研究進(jìn)展

    2023-01-02 10:57:42姜紹文謝青
    臨床內(nèi)科雜志 2022年12期
    關(guān)鍵詞:檢測研究

    姜紹文 謝青

    根據(jù)2020年12月WHO發(fā)布的全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù),原發(fā)性肝癌是發(fā)病率居第6位的惡性腫瘤,而其死亡率更是高居第3位[1]。WHO估計2030年全球?qū)⒂谐^100萬人死于原發(fā)性肝癌,而肝細(xì)胞肝癌(HCC)是原發(fā)性肝癌最常見的病理類型,約占所有原發(fā)性肝癌的85%[2]。我國是肝病大國,HCC發(fā)病率和死亡率均占全球的一半左右,疾病負(fù)擔(dān)極為沉重[3]。HCC起病隱匿、進(jìn)展迅速,大多數(shù)患者在首次確診時已處于疾病中晚期,失去了根治的機(jī)會,遠(yuǎn)期預(yù)后差。而早期篩查、早期診斷、早期治療對于改善HCC患者預(yù)后、提高根治率和長期生存率至關(guān)重要。令人沮喪的是,我國大陸地區(qū)早期HCC[巴塞羅那臨床肝癌分期(BCLC) 0/A期]的診斷構(gòu)成比僅為33%,總體生存期23個月,5年生存率僅11.7%~14.1%[3]。目前臨床上HCC的早期篩查主要依賴于腹部超聲檢查聯(lián)合外周血清標(biāo)志物[如甲胎蛋白(AFP)、異常凝血酶原(DCP/PIVKA-Ⅱ)等]檢測。然而這些單一的血清學(xué)標(biāo)志物即使聯(lián)合超聲檢查,診斷早期HCC的能力仍無法令人滿意,發(fā)現(xiàn)小肝癌(直徑≤2 cm)的敏感度更有較大改善空間。因此,臨床急需敏感度和特異度更高的、便于反復(fù)檢測、動態(tài)監(jiān)測的新型無創(chuàng)HCC早期篩查標(biāo)志物。

    液體活檢指對外周循環(huán)中的腫瘤副產(chǎn)物進(jìn)行分子生物學(xué)分析,以獲取原發(fā)腫瘤相關(guān)信息的技術(shù),包括外周血、尿液、胸腔積液、腹腔積液等體液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)、循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、循環(huán)游離RNA(cfRNA)及外泌體等成分[4]。液體活檢在肺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌和乳腺癌等腫瘤中的研究已顯示其具有良好的臨床應(yīng)用前景[5]。近年來,HCC領(lǐng)域內(nèi)有關(guān)液體活檢的研究也逐漸增多,涵蓋HCC的早期篩查和診斷、預(yù)后評估、疾病進(jìn)展及復(fù)發(fā)監(jiān)測、療效預(yù)測等諸多方面,成為眾多學(xué)者關(guān)注的一大熱點(diǎn)。本文對液體活檢在HCC早期篩查中的作用及研究進(jìn)展作一綜述。

    一、CTCs

    CTCs由原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤釋放進(jìn)入外周血而形成。每天有大量CTCs進(jìn)入血液循環(huán),但僅少于0.01%的CTCs最終存活,并形成致命性轉(zhuǎn)移灶。CTCs半衰期一般為1.0~2.4小時,大多數(shù)CTCs因免疫攻擊、剪切力、失巢效應(yīng)而消亡,在發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤患者中CTCs僅占外周血細(xì)胞的十億分之一,這給CTCs的研究帶來巨大困難[4-5]。幸運(yùn)的是,隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步,鑒別、分離、分析CTCs特征的方法學(xué)也取得一定突破。目前檢測CTCs的平臺主要基于CTCs的物理特性(如密度、電荷、變形能力)或生物學(xué)特性(主要為細(xì)胞表面的各種標(biāo)志物),而CellSearchTM是唯一通過美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證的CTCs檢測系統(tǒng)[4-5]。該系統(tǒng)主要利用CTCs表面的上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)對其進(jìn)行識別和檢測,但HCC患者中EpCAM陽性率較低,再加上存在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程,因此該方法可能低估CTCs的實(shí)際數(shù)量[5-6]。

    一項大型臨床研究檢測受試者(HCC和肝硬化/慢性乙型肝炎+健康對照)外周血中腫瘤相關(guān)基因的定量表達(dá),構(gòu)建了源于CTCs的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)評分用于HCC患者的診斷[7]。此研究證明該評分診斷HCC的效力高于AFP(截斷值為20 ng/ml):CTC-PCR評分診斷HCC的敏感度為72.5%,特異度為95%,受試者工作特征曲線下面積(AUC)為0.88,而該隊列中AFP診斷HCC的敏感度為57%,特異度為90%,AUC為0.77。此外,該評分診斷早期HCC的表現(xiàn)同樣可觀:BCLC 0期對應(yīng)的AUC為0.92,BCLC A期對應(yīng)的AUC為0.86。同時,也有研究發(fā)現(xiàn)CTCs聯(lián)合AFP可進(jìn)一步提高診斷HCC的能力:AFP以400 ng/ml為截斷值區(qū)分慢性肝病和HCC的AUC為0.67,CTCs對應(yīng)的AUC為0.77,而二者聯(lián)合之后的AUC被提高至0.82[6]。但總體而言,鑒于CTCs在患者外周血中的數(shù)量極少,且與原發(fā)腫瘤負(fù)荷呈正相關(guān),CTCs在HCC早期篩查、早期診斷方面的應(yīng)用存在較大挑戰(zhàn),更多的研究支持CTCs用于HCC的預(yù)后預(yù)測及疾病進(jìn)展、術(shù)后復(fù)發(fā)的動態(tài)監(jiān)測[8]。

    二、ctDNA

    談及ctDNA,不可避免地要先提到細(xì)胞游離DNA(cfDNA)。cfDNA長度約160~180 bp,主要源于循環(huán)中的淋巴細(xì)胞和其他死亡的良性宿主細(xì)胞。ctDNA則是特指源于壞死和凋亡的腫瘤細(xì)胞的DNA片段,在cfDNA中只占很小一部分[5]。目前的技術(shù)從cfDNA中分離ctDNA仍存在困難。ctDNA檢測技術(shù)可分為靶向(如PCR)和非靶向技術(shù)(如全基因組測序),前者對已知的特定基因敏感度高,后者可提供更為全面、綜合的遺傳信息[9]。因ctDNA包含與原發(fā)腫瘤相同的遺傳學(xué)改變(包括DNA甲基化、突變和拷貝數(shù)量變異),ctDNA檢測在HCC早期篩查、早期診斷方面展示出廣闊的應(yīng)用前景。

    DNA甲基化改變尤其是抑癌基因CpG島的甲基化改變,在HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。已有大量研究表明多種不同基因的甲基化異常對HCC的診斷效力優(yōu)于AFP。Xu等[10]檢測HCC患者和健康對照者外周血ctDNA特定位點(diǎn)的甲基化水平,開發(fā)了一個基于10個甲基化基因的HCC診斷模型,其在驗證集中檢出HCC的敏感度和特異度分別為83.3%、90.5%,AUC達(dá)0.944。另一項由HOXA1、EMX1、ECE1、AK055957、PFKP和CLEC11A等6個異常甲基化基因構(gòu)成的診斷模型,經(jīng)不同臨床隊列多期驗證,被證明可實(shí)現(xiàn)極高的HCC診斷效力:敏感度為95%,特異度為92%,AUC為0.96[11]。此外,也有研究報道5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)檢測技術(shù)在早期HCC診斷中也有著不錯的表現(xiàn)。Cai等[12]通過基于cfDNA全基因組5-hmC檢測數(shù)據(jù)開發(fā)并驗證了一個HCC診斷模型,其區(qū)分慢性肝病和早期HCC的AUC為0.85,明顯優(yōu)于AFP(AUC為0.69)。

    基因編碼區(qū)突變可致轉(zhuǎn)錄過程異常,最終可能引起蛋白質(zhì)序列改變及腫瘤發(fā)生,這為基因突變檢測用于HCC篩查提供了理論基礎(chǔ)[9]。但因腫瘤早期ctDNA入血含量低,且HCC驅(qū)動基因不明、異質(zhì)性高,使基于ctDNA突變檢測的方法篩查早期HCC的可行性面臨挑戰(zhàn),故研究中一般將其與蛋白標(biāo)志物聯(lián)合以提高診斷效能。2018年Cohen等[13]通過建立“CancerSEEK”的方法分析包括肝癌(HCC和肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌)在內(nèi)的多種腫瘤的16個高頻突變基因,同時檢測了8種蛋白標(biāo)志物,能夠有效地從對照組中識別腫瘤患者。CancerSEEK對其中44例肝癌的敏感度和特異度分別為97%和60%,對其中5例早期肝癌的敏感度為100%。2019年,一項基于社區(qū)人群的大型前瞻性研究通過聯(lián)合cfDNA的體細(xì)胞突變、HBV整合、cfDNA濃度及AFP、DCP與性別、年齡等多種因素開發(fā)了一個名為“HCCscreen”的液體活檢方法[14]。研究中將HBsAg陽性、AFP>20 ng/ml或(和)超聲檢測到肝臟可疑結(jié)節(jié),但增強(qiáng)MRI/CT未診斷為HCC的人群定義為高危人群。在此類高危人群組成的訓(xùn)練集中,HCCscreen顯示了良好的診斷效力(敏感度為85%,特異度為93%,AUC為0.93)。而在331例AFP正常、超聲未見可疑結(jié)節(jié)的HBsAg陽性患者組成的驗證集中,該模型成功識別出全部4例HCC患者,且4例均為腫瘤早期(結(jié)節(jié)直徑<3 cm),診斷敏感度為100%,特異度為94%。

    此外,全基因組測序/二代測序技術(shù)為我們提供了更加全面、綜合的cfDNA特征譜,可進(jìn)一步提高HCC的檢出率。2022年,Zhang等[15]通過全基因組測序獲取外周血漿中cfDNA的片段大小分布特征,經(jīng)生物信息學(xué)處理構(gòu)建了肝惡性腫瘤的診斷模型。在189例肝惡性腫瘤(絕大部分為HCC)和164例非腫瘤對照組成的驗證集中,該模型識別出肝惡性腫瘤的敏感度為96.8%,特異度為98.8%,AUC高達(dá)0.995。其對早期HCC的診斷同樣出色,對應(yīng)的敏感度為96.2%。除cfDNA片段大小分布,全基因組測序技術(shù)還可提供拷貝數(shù)變異、核小體印記、末端序列等更為豐富的特征參數(shù),多種cfDNA特征參數(shù)的聯(lián)合及與cfDNA甲基化、蛋白標(biāo)志物的聯(lián)合,也成為探索更精準(zhǔn)的HCC診斷模型的新方向。Chen等[16]在一個來自中國11個省份13家醫(yī)院、合計3 204例受試者的大型隊列中,基于全基因組測序和5-hmC檢測技術(shù)構(gòu)建了多組學(xué)多維度的HIFI評分系統(tǒng),系統(tǒng)內(nèi)包括5-hmC、末端序列、片段分布、核小體印記等多個參數(shù),其區(qū)分HCC和非HCC的敏感度達(dá)95.42%,特異度達(dá)97.83%,AUC高達(dá)0.996。值得一提的是,對于AFP或DCP陰性的患者,HIFI的敏感度也高達(dá)90.9%~96.9%,可有效降低HCC的臨床漏診率;而對于極早期(BCLC 0期)和早期(BCLC A期)HCC,HIFI的檢出敏感度和特異度(88.9%、94.4%)均顯著優(yōu)于AFP(22.2%、16.7%)及DCP(55.6%、61.1%)。

    三、cfRNA

    微小RNAs(miRNAs,miR)是一類由約22個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA,可與靶基因結(jié)合,通過抑制轉(zhuǎn)錄或降解mRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá),是近年來研究最廣泛的HCC生物標(biāo)志物之一[4]。目前已有至少超過70多種miRNAs被報道可作為HCC潛在的標(biāo)志物[17]。單一高水平表達(dá)的miRNAs中,似乎miR-21、miR-199和miR-122在HCC診斷中最有前景[18],然而有研究也顯示單一的miRNA診斷HCC的效力較有限,包含多種不同miRNAs的聯(lián)合診斷模型能夠大大提高HCC的檢出率。早在2011年,Zhou等[19]就構(gòu)建了一個由7種miRNAs(miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26a、miR-27a和miR-801)組成的綜合診斷模型,該模型可將HCC和健康對照、慢性乙型肝炎、肝硬化有效區(qū)分開,對應(yīng)的AUC分別為0.941、0.842、0.884;其診斷效力不受HCC分期的影響,檢出BCLC 0期、A期、B期和C期對應(yīng)的AUC分別為0.888、0.888、0.901和0.881?;诖私Y(jié)果,7種miRNAs檢測試劑盒已于2017年獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局的三類器械認(rèn)證,進(jìn)入臨床實(shí)際應(yīng)用。近年來包含不同miRNAs的綜合診斷模型不斷被不同的研究團(tuán)隊開發(fā)、驗證,進(jìn)一步確認(rèn)了miRNAs在HCC篩查和診斷中的巨大價值。近期一項研究提出了8種miRNAs組成的新型HCC診斷模型,在HCC高危人群中識別HCC的敏感度為97.7%,特異度為94.7%,幾乎所有(98%)檢出的HCC患者均處于疾病早期[20]。

    除miRNAs外,長鏈非編碼RNA(lncRNAs)和環(huán)狀RNAs(circRNAs)在HCC的早期篩查和診斷中也逐漸受到研究者的重視。lncRNA HULC是HCC領(lǐng)域內(nèi)研究最多的lncRNA之一,其在HCC組織內(nèi)和外周血漿中的表達(dá)水平明顯高于對照組,有望成為篩查和診斷HCC的新型潛在標(biāo)志物[21]。lncRNA CTBP和其他RNA組成的聯(lián)合模型[22],LINC00152、XLOC014172、RP11-160H22.5和AFP組成的綜合模型[23]等,都能以相當(dāng)高的準(zhǔn)確性將HCC患者和慢性肝病/肝硬化、健康對照者區(qū)分開。Li等[24]發(fā)現(xiàn)circSMARCA5表達(dá)水平在HCC患者血漿中明顯下調(diào),血漿circSMARCA5表達(dá)水平區(qū)分HCC和慢性肝炎、肝硬化的AUC分別為0.853、0.711,當(dāng)與AFP聯(lián)合后,對應(yīng)的AUC可提高至0.903、0.858。最新的研究中具有HCC潛在診斷價值的circRNAs還包括hsa_circ_0000437、hsa_circ_0006091、hsa_circ_0027089等[25-27]。

    四、外泌體

    外泌體是一種納米級大小的細(xì)胞外囊泡,其內(nèi)容物包含RNA、DNA和蛋白質(zhì),主要負(fù)責(zé)細(xì)胞間的信息交流,在HCC的發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[5]。由于磷脂雙層膜的保護(hù),外泌體的內(nèi)容物不易降解且較穩(wěn)定,使其在腫瘤診斷、預(yù)后評估等方面展現(xiàn)出獨(dú)特價值。然而相較于cfDNAs,外泌體在HCC早期篩查和診斷中的研究仍處于較為初級的階段,有待于更多數(shù)據(jù)的驗證。Cho等[28]的研究發(fā)現(xiàn)血清外泌體miR-10b-5p對早期HCC的診斷有較大潛力,其診斷敏感度為90.7%,特異度為75.0%,AUC為0.934。另一項研究基于機(jī)器學(xué)習(xí),使用血漿中8種外泌體lncRNAs構(gòu)建了一個“HCC分類器”,在訓(xùn)練集、驗證集、測試集中診斷HCC的AUC分別為0.953、0.983和0.963[29]。Sun等[30]研究顯示,外泌體hsa_circ_0004001、hsa_circ_0004123、hsa_circ_0075792可用于HCC的診斷,三者聯(lián)合后AUC可被提高至0.89,敏感度為90.5%,特異度為78.1%。除上述外泌體非編碼RNA(ncRNAs),外泌體中的蛋白質(zhì)組分也是診斷HCC的潛在標(biāo)志物之一,但目前相關(guān)研究數(shù)據(jù)較少[31]。

    五、挑戰(zhàn)和展望

    盡管越來越多的研究證實(shí)液體活檢技術(shù)在HCC早期篩查中具有廣闊的應(yīng)用前景,但現(xiàn)階段該技術(shù)距離真正進(jìn)入臨床仍面臨諸多挑戰(zhàn):(1)液體活檢包含的標(biāo)志物種類眾多,必然涉及到多種不同的方法學(xué)問題。從樣本的采集、保存、運(yùn)輸?shù)綐?biāo)志物的分離、檢測、分析等多個環(huán)節(jié),在不同的研究團(tuán)隊間尚未做到同質(zhì)化、標(biāo)準(zhǔn)化,使得研究結(jié)果的可比性、重復(fù)性存疑,因此針對某一類液體活檢標(biāo)志物建立一個相對簡易、重復(fù)性好、標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程,對推進(jìn)液體活檢臨床應(yīng)用的最終落地意義重大。(2)雖然AFP等傳統(tǒng)血清標(biāo)志物在HCC早期篩查中的表現(xiàn)無法令人滿意,但其成熟的檢測方法、低廉的檢測成本及廣泛的可及性,仍然使其成為HCC早期篩查不可或缺的手段之一。目前液體活檢技術(shù)需要更為專業(yè)的技術(shù)人員,檢測的經(jīng)濟(jì)成本和時間成本明顯高于AFP,這大大限制了其在臨床的推廣普及,故檢測方法的簡化、檢測成本的大幅下降,也是液體活檢必須跨過的一道門檻。(3)現(xiàn)有液體活檢相關(guān)研究中報道的可用于HCC早期篩查的標(biāo)志物或聯(lián)合診斷模型繁多,但多來自單中心、小樣本、回顧性研究,也缺少不同研究團(tuán)隊對同一潛在標(biāo)志物的交叉驗證。而某一新型診斷標(biāo)志物在進(jìn)入臨床前必須經(jīng)受住多中心、大樣本、前瞻性隊列研究的考驗,才有可能成為一個被廣泛接受的HCC早期篩查標(biāo)志物。(4)HCC篩查的主要目的是發(fā)現(xiàn)早期HCC患者,使更多患者獲得根治機(jī)會,改善長期預(yù)后。所以液體活檢的研究應(yīng)把重點(diǎn)放在盡可能地提高區(qū)分HCC和慢性肝炎/肝硬化等HCC高危人群的敏感度和特異度,尤其是對早期HCC(BCLC 0/A期)的鑒別能力方面。而先以aMAP、CAMD、PAGE-B等無創(chuàng)評分系統(tǒng)對慢性肝病患者進(jìn)行HCC的風(fēng)險分層,在中高風(fēng)險人群中再以液體活檢篩查HCC,可能進(jìn)一步提高液體活檢的陽性預(yù)測值,更加具有衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)價值。(5)某一個或某一類液體活檢標(biāo)志物對HCC診斷的效能往往比較有限,多維度多組學(xué)的綜合診斷模型是進(jìn)一步提高早期HCC檢出率的發(fā)展方向。液體活檢技術(shù)完全替代目前臨床常用的“AFP+腹部超聲”的篩查組合可能并不現(xiàn)實(shí),如何將液體活檢與現(xiàn)行篩查手段進(jìn)行有機(jī)整合,形成優(yōu)勢互補(bǔ),是一個值得臨床研究者思考的問題。(6)明確特定液體活檢技術(shù)的適用人群是普適性的還是病因特異性的是液體活檢走向臨床實(shí)際應(yīng)用前必須回答的另一個重要問題。

    綜上所述,相對于組織學(xué)活檢,液體活檢具有無創(chuàng)、采樣簡單、易于重復(fù)采樣、便于實(shí)時動態(tài)監(jiān)測、診斷效力明顯高于傳統(tǒng)腫瘤血清學(xué)標(biāo)志物及可獲得更多腫瘤生物學(xué)信息、克服HCC高度異質(zhì)性等優(yōu)勢。雖然目前液體活檢技術(shù)仍存在不少有待改進(jìn)的地方,但毋庸置疑,隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步、方法學(xué)的改進(jìn)、費(fèi)用的降低及更多高質(zhì)量前瞻性臨床研究的驗證,相信液體活檢將在不久的未來進(jìn)入臨床實(shí)際應(yīng)用階段,在HCC的早期篩查、早期診斷中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,極大優(yōu)化我國HCC患者的臨床管理,為提高HCC早期診斷率和根治率、改善患者長期預(yù)后帶來福音。

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