UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定珍菊降壓片中5種成分的含量

摘要：文中建立一種UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定珍菊降壓片中可樂(lè)定、蒙花苷、綠原酸、氫氯噻嗪、蘆丁含量。采用ACQUITY UPLC?BEH柱（C18 2.1mm×50mm 1.7μm），以0.1%甲酸水溶液-甲醇為流動(dòng)相梯度洗脫，流速：0.3mL·min-1，柱溫35℃，進(jìn)樣量2μL。質(zhì)譜采用ESI（電噴霧離子源），以正負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，可樂(lè)定、蒙花苷、綠原酸、氫氯噻嗪、蘆丁的線性范圍為0.02648～0.8472μg·mL-1、0.1011～3.235μg·mL-1、0.08055～2.578μg·mL-1、0.02600～0.8320μg·mL-1、0.1033～3.306μg·mL-1（r2為0.99167～0.99907），平均加標(biāo)回收率分別為95.1%、93.2%、91.7%、94.6%、92.8%，RSD為2.81%、2.02%、3.41%、3.15%、1.79%（n=6）。結(jié)果表明該方法操作簡(jiǎn)單、便捷、快速，可一次性實(shí)現(xiàn)多個(gè)不同成分的檢測(cè)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

關(guān)鍵詞：UPLC-MS/MS；珍菊降壓片；蒙花苷；綠原酸；蘆丁

Simultaneous Determination of Five Constituents in Zhenjujiangya Tablet by UPLC-MS/MS Method

CAI Zhenshi

（Quanzhou Institute For Food And Drug Control，Quanzhou 362000， Fujian， China）

Abstract： UPLC-MS/MS method was developed for the simultaneous determination of clonidine， linarin， chlorogenic acid， hydrochlorothiazide and rutin in Zhenjujiangya tablets. Methods of ACQUITY UPLC?BEH column （C18 2.1mm×50mm 1.7μm） will be used with 0.1% formic acid aqueous solution-methanol as mobile phase for gradient elution ， in which the flow rate was 0.3mL·min-1， the column temperature was 35℃， and the sample volume was 2μL. ESI （electrospray ionization source） was used in the mass spectrometry to monitor the Quantitative analysis of positive and negative ion multi-reaction mode. The results of the experiment show that the linear ranges of clonidine， linarin， chlorogenic acid， hydrochlorothiazide and rutin were 0.02648～0.8472μg·mL-1 ， 0.1011～3.235μg·mL-1， 0.08055～2.578μg·mL-1 ， 0.02600～0.8320μg·mL-1 ， 0.1033～3.306μg·mL-1 （r2 was 0.99167-0.99907） ; the average recoveries were 95.1%， 93.2%， 91.7%， 94.6%， 92.8%; RSD were 2.81%， 2.02%， 3.41%， 3.15%， 1.79% （n=6）. There comes a conclusion that the method is simple， convenient as well as fast and can detect multiple components at one time. In addition， the results are accurate and reliable.

Key Words： UPLC-MS/MS; Zhenjujiangya tablet; Linarin; Chlorogenic acid; Rutin

0 引言

珍菊降壓片由野菊花膏粉、珍珠層粉、氫氯噻嗪、蘆丁混勻，鹽酸可樂(lè)定加70%乙醇適量溶解，乙醇液均勻拌入上述混合粉中，充分混勻，制成顆粒，干燥，加入硬脂酸鎂適量，壓制成1000片，包糖衣或薄膜衣，即得[1]。珍菊降壓片為中西藥復(fù)方制劑，廣泛應(yīng)用于高血壓的藥物治療。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)為《國(guó)家藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-3925-98-2019》。該標(biāo)準(zhǔn)采用3種不同的高效液相色譜法分別對(duì)野菊花膏粉（以蒙花苷計(jì)）、鹽酸可樂(lè)定、氫氯噻嗪及蘆丁進(jìn)行含量測(cè)定及相應(yīng)的含量均勻度檢查，檢測(cè)方法操作繁瑣，步驟繁多；同時(shí)對(duì)野菊花膏粉僅以蒙花苷的含量作為質(zhì)量控制，無(wú)法對(duì)藥物質(zhì)量進(jìn)行全面控制。綠原酸及蒙花苷作為野菊花藥理作用的主要成分，能夠更好地反映藥材的質(zhì)量好壞。因此，文中選取珍菊降壓片中含有的3種中藥成分（蒙花苷、綠原酸、蘆丁）及2種功效確切的化學(xué)藥（鹽酸可樂(lè)定、氫氯噻嗪）進(jìn)行含量測(cè)定，通過(guò)建立UPLC-MS/MS法可同時(shí)測(cè)定這5種成分，能夠更快速、更方便、更全面地對(duì)珍菊降壓片進(jìn)行質(zhì)量控制。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試藥

鹽酸可樂(lè)定（批號(hào)：100071-201607）、氫氯噻嗪（批號(hào)：100309-201404）、蒙花苷（批號(hào)：111528-201911）、綠原酸（批號(hào)：110753-202018）、蘆丁（批號(hào)：100080-202012），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純（品牌：默克，規(guī)格：4L）、甲酸為色譜純（品牌：ROE，規(guī)格：1L）、水為蒸餾水（品牌：屈臣氏，規(guī)格：4L）。

1.2 樣品

珍菊降壓片，雷允上藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為：TC02017、UC02010、UC02013。

1.3 儀器

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（TripleQuad5500，美國(guó)SCIEX公司）

1.4 色譜與質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH（C18 2.1mm×"50mm 1.7μm）；流動(dòng)相：A相，水（含0.1%甲酸）；B相，甲醇；梯度洗脫（見(jiàn)表1）；柱溫：35℃；流速：0.3mL·min-1；進(jìn)樣量：2μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI（電噴霧離子源），正負(fù)離子模式同時(shí)采集；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；氣簾氣（CUR）：35 psi；離子化電壓（IS）：5500 V（正離子模式），-4500 V（負(fù)離子模式）；溫度（TEM）：550 ℃；噴霧氣（GS1）：50 psi；輔助加熱氣（GS2）：50 psi；各化合物質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

1.5混合對(duì)照品溶液的制備

精取5種對(duì)照品分別置50mL量瓶中，加入70%甲醇，超聲處理30min后，放冷，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得各對(duì)照品溶液。分別精取鹽酸可樂(lè)定對(duì)照品溶液0.2mL、氫氯噻嗪對(duì)照品溶液0.2mL、蒙花苷對(duì)照品溶液0.8mL、蘆丁對(duì)照品溶液0.8mL、綠原酸對(duì)照品溶液0.6mL，置同一50mL量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，配制成混合對(duì)照品溶液，混合對(duì)照品溶液各化合物濃度見(jiàn)表3。

1.6 供試品溶液的制備

取珍菊降壓片20片，精密稱定，研細(xì)，取約0.25g（一片重），精密稱定，置100mL量瓶中，加70%甲醇約70mL，超聲處理30min，放冷，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，精取續(xù)濾液10mL，置50mL量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得供試品溶液A（用于測(cè)定可樂(lè)定、蒙花苷及綠原酸）。精取供試品溶液A 1.0mL，置100mL量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得供試品溶液B（用于測(cè)定氫氯噻嗪及蘆?。?。

2 結(jié)果討論

2.1專屬性試驗(yàn)

精密移取混合對(duì)照品溶液1mL置5mL量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得系統(tǒng)適用性對(duì)照品溶液。分別取系統(tǒng)適用性對(duì)照品溶液、供試品溶液A及供試品溶液B，按“1.4”項(xiàng)下測(cè)定，記錄結(jié)果，見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示供試品與對(duì)照品中各組分色譜峰保留時(shí)間一致，且各組分間無(wú)干擾，表明專屬性良好。

2.2 線性關(guān)系試驗(yàn)

分別精密移取混合對(duì)照品溶液0.0625 、0.125、0.25、0.5、1、2mL置2mL量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得系列對(duì)照品溶液。按“1.4”項(xiàng)下測(cè)定，記錄結(jié)果。以對(duì)照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，各成分峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，分別計(jì)算得到5種成分的線性方程。結(jié)果見(jiàn)表4，表明5種成分在各自的線性濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn)

取“1.5”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“1.4”項(xiàng)下連續(xù)測(cè)定6次，分別記錄色譜峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果可樂(lè)定、蒙花苷、綠原酸、氫氯噻嗪、蘆丁色譜峰面積的RSD分別為0.61%、0.45%、0.46%、0.78%、0.58%（n=6），表明儀器的精密度符合分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[2]。

2.4重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)為UC02010的供試品，按“1.6”項(xiàng)下方法平行制備6份（同時(shí)含供試品溶液A及供試品溶液B），并按“1.4”項(xiàng)下測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算RSD，同時(shí)代入“2.2”項(xiàng)下線性回歸方程中計(jì)算平均含量，結(jié)果見(jiàn)表5，表明該方法的重復(fù)性符合分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[2]。

2.5 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.4”項(xiàng)下其中一份供試品溶液（含供試品溶液A及供試品溶液B），并于制備后0、2、4、8、16、24h分別按“1.4”項(xiàng)下條件測(cè)定，記錄色譜峰面積并計(jì)算6個(gè)時(shí)間點(diǎn)各個(gè)成分的RSD。結(jié)果可樂(lè)定、蒙花苷、綠原酸、氫氯噻嗪、蘆丁色譜峰面積的RSD分別為2.52%、1.41%、2.13%、1.14%、1.24%（n=6），表明該方法制備的供試品溶液中5種成分在24h內(nèi)的穩(wěn)定性較好。

2.6加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定批號(hào)為UC02010的供試品粉末6份，每份約0.125g，分別置100mL量瓶中，添加按“2.4”項(xiàng)下測(cè)得的平均含量的50%的對(duì)照品，并按“1.6”項(xiàng)下方法制備，按“1.4”項(xiàng)下測(cè)定，計(jì)算得平均加標(biāo)回收率。結(jié)果見(jiàn)表6，表明該方法的準(zhǔn)確性符合分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[2]。

2.7 供試品中5種成分的含量測(cè)定

取同一廠家珍菊降壓片3個(gè)不同批次供試品，按“1.6”項(xiàng)下供試品溶液的制備，分別制得供試品溶液A及供試品溶液B，并按“1.4”項(xiàng)下測(cè)定，同批次平行測(cè)定3份，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表7。

2.8 提取條件及供試品溶液制備

考察了分別以30%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、70%甲醇水溶液、純甲醇為溶劑超聲提取30min對(duì)提取效率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用70%甲醇水溶液及純甲醇為溶劑提取的供試品溶液中5種成分的色譜峰面積相當(dāng)且高于采用30%甲醇水溶液及50%甲醇水溶液為溶劑提取的供試品溶液。考慮到方法的經(jīng)濟(jì)性，以及盡可能減少有機(jī)溶劑的使用，因此選擇70%甲醇水溶液作為提取溶劑。

在供試品溶液制備中，氫氯噻嗪及蘆丁含量較高，若直接取供試品溶液A進(jìn)行測(cè)定，則系列對(duì)照溶液的濃度需為“2.2”項(xiàng)下所制系列對(duì)照溶液濃度的100倍，濃度過(guò)高，所測(cè)得的線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)不符合分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[2] ，因此需對(duì)供試品溶液A進(jìn)行稀釋，制得供試品溶液B用于測(cè)定氫氯噻嗪及蘆丁。

3 結(jié)論

目前，珍菊降壓片的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)采用3種不同的高效液相方法分別測(cè)定蒙花苷、可樂(lè)定、氫氯噻嗪及蘆丁，檢測(cè)方法操作繁瑣、步驟繁多，耗時(shí)長(zhǎng)。文中采用UPLC-MS/MS法對(duì)珍菊降壓片中的5種成分進(jìn)行含量測(cè)定，方法操作簡(jiǎn)單、便捷、快速，可一次性實(shí)現(xiàn)多個(gè)不同成分的檢測(cè)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以作為珍菊降壓片質(zhì)量控制的重要參考。

參考文獻(xiàn)

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).國(guó)家藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-3925-98-2019 [S].2019.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020年版，四部：480-483.

收稿日期：2022-03-07

作者簡(jiǎn)介：蔡振世，男，泉州市食品藥品檢驗(yàn)所，主管藥師，碩士