結構光照明相位/熒光雙模式顯微技術*

高兆琳 劉瑞樺 溫凱 馬英 李建郎 郜鵬

(西安電子科技大學物理學院,西安 710071)

本文提出了一種基于結構光照明的高分辨相位/熒光雙模式顯微成像方法.該方法利用一數(shù)字微鏡陣列(DMD)產(chǎn)生條紋結構光,并記錄樣品在結構光照明下的全息圖像和熒光圖像,最終可以重建出樣品的定量相位圖像和超分辨熒光圖像.此外,還提出了一種補償環(huán)境擾動對相位成像影響的數(shù)值方法,提高了成像系統(tǒng)的抗干擾能力.在該雙模式成像系統(tǒng)中,定量相位成像和熒光成像的空間分辨率分別為840 nm 和440 nm,為同一樣品提供互補信息.該方法有望被廣泛應用于生物醫(yī)學、工業(yè)和化學等諸多領域.

1 引言

定量相位顯微成像技術(quantitative phase microscopy,QPM)通過定量測量經(jīng)過透明樣品后的光波相位,實現(xiàn)對透明樣品實現(xiàn)高襯度、高分辨率的定量成像[1?5].數(shù)字全息顯微[6?11]是一種最為常用的定量相位顯微技術之一.傳統(tǒng)數(shù)字全息顯微通常采用平行于系統(tǒng)光軸的光束來對樣品進行垂直照明,因而其空間分辨率受到很大的限制.為了提高數(shù)字全息顯微技術的空間分辨率,科研人員們先后提出了多種方法,例如,通過傾斜照明和結構光照明來實現(xiàn)合成孔徑從而提高空間分辨率[12?14].另外,將微米尺度的介質微球運用到數(shù)字全息顯微成像中,可以顯著提高其空間分辨率和圖像對比度[15].值得一提的是,學者們提出了基于空間光調(diào)制器的條紋結構光照明[16,17]和散斑照明[18]數(shù)字全息顯微技術,不僅提高了數(shù)字全息顯微技術的空間分辨率和信噪比,還保證了其時間分辨率.為了簡化數(shù)字全息顯微裝置的結構并提高其空間分辨率,Latychevskaia 等[19]提出了一種基于全息圖外推方法的無透鏡數(shù)字全息顯微技術,隨后戎路等[20]將該方法成功應用于太赫茲同軸無透鏡數(shù)字全息顯微中.邸江磊等[21]在無透鏡數(shù)字全息顯微成像的基礎上,結合了線性CCD 掃描法和合成孔徑技術,極大地提高了數(shù)字全息顯微成像的空間帶寬積.

定量相位顯微技術無需熒光標記就可對透明樣品實現(xiàn)高襯度且定量化的成像,但同時也缺乏特異性.熒光顯微成像技術通過特異性的熒光標記技術,可對特定的亞細胞結構進行高分辨率且高對比度的成像[22].經(jīng)過多年的不懈努力,科學家們先后提出多種超分辨熒光顯微技術,例如,單分子定位顯微(STORM/PALM)[23,24]、受激發(fā)射損耗顯微鏡(STED)[25,26]及結構光照明顯微鏡(SIM)[27,28],這些技術使熒光顯微鏡的空間分辨率突破至幾十納米.其中,結構光照明顯微技術(structured illumination microscopy,SIM)是一種最適合用于活體樣品高分辨率成像的方法,其具有成像速度快、光毒性小、對熒光分子和標記方法沒有過多苛刻要求等優(yōu)點,因而受到眾多生物醫(yī)學科研工作者的青睞.然而,熒光顯微鏡仍然存在很多應用上的限制,例如,可同時觀察的通道數(shù)量有限(一般只有4—5 個通道);熒光標記在一定程度上都會對樣品造成影響,無法準確獲得活體樣品的動態(tài)信息;光毒性和光漂白性不利于活體樣品的長時間連續(xù)觀察.

將定量相位顯微技術和熒光顯微技術結合構成一種雙模式成像系統(tǒng)是大勢所趨,利用熒光顯微通道識別定量相位顯微通道中的各種結構,然后利用定量相位顯微通道對天然狀態(tài)下的樣品進行長時間的無損檢測,在不對樣品造成影響的情況下可以獲得樣品的多維信息.將無標記定量相位顯微技術和熒光顯微技術相結合還可以特異性地觀測樣品中特定的化學結構,為待測樣品提供互補的多模式信息[29].

本文提出了一種基于數(shù)字微鏡陣列的高分辨率定量相位和超分辨熒光雙模式顯微技術.在結構光照明下,數(shù)字全息顯微裝置可重構獲得待測樣品的高分辨率復振幅信息(振幅和相位),可再現(xiàn)樣品的三維形貌和折射率分布等信息,而熒光顯微通道可實現(xiàn)超分辨結構光照明顯微成像(SIM),可再現(xiàn)待測熒光樣品的精細結構.

2 實驗設置

基于結構光照明的相位/熒光雙模式顯微成像裝置如圖1(a)所示.中心波長為561 nm 的激光器(MLL-U-561,長春新產(chǎn)業(yè))出射的光束首先經(jīng)過一個透光系數(shù)可調(diào)節(jié)的中性密度濾光片NF,然后被耦合入一個一分二的光纖分路器.從光纖分路器的一端出射的光波用來對樣品進行照明,另一端出射的光波用作參考光.照明光束經(jīng)過透鏡L1擴展準直后,被反射鏡M1反射,并以一定的角度(24°)照射到一數(shù)字微鏡陣列(DMD)上.通過控制系統(tǒng)在數(shù)字微鏡陣列DMD (DLP F6500,1920 ×1080 像素,像素大小 7.56 μm,UPO-Labs)上依次加載方位角分別為mπ/4 (其中m=0,1,2,3)的4 組正弦條紋圖案.每組條紋圖像由相移量依次為n=2(k– 1)π/5 (其中k=1,2,···,5)的5 個條紋圖案所組成(如圖1(b)所示).經(jīng)過透鏡L2的傅里葉變換作用,被DMD 所調(diào)制的光波的頻譜出現(xiàn)在望遠鏡系統(tǒng)L2-L3的中間焦平面上.為了簡化重建過程,在望遠鏡系統(tǒng)L2-L3的中間焦平面處放置了一個特制的振幅掩膜片用來濾除0 級和±1 級以外的衍射光.如此一來,該照明光經(jīng)望遠鏡系統(tǒng)L2-L3和L4-MO1的成像后,樣品面上就產(chǎn)生結構化的條紋圖案.在結構光照明下,攜帶有樣品信息的物光波經(jīng)過望遠鏡系統(tǒng)MO2-L5成像到CCD1(4000 ×3000 像素,像素大小1.85 μm,DMK 33UX226,The Imaging Source)上.同時,從一分二光纖分路器出射的另一束光經(jīng)透鏡L6的準直作用變成平行光,然后通過分光棱鏡BS 后斜照射到CCD1上,形成參考光.物光和參考光干涉形成的離軸干涉圖樣被CCD1所記錄.為了提高全息圖的條紋對比度,在CCD1前放置了一個線偏振片(P)以使物光波和參考光擁有相同的偏振方向.圖2(a)是CCD1記錄的一幅干涉全息圖,從圖中放大區(qū)域可以看出全息圖的條紋對比度很高,V=0.64.進一步地,利用3.1 節(jié)所介紹的數(shù)值再現(xiàn)方法,就可以獲得待測樣品的高分辨振幅/相位圖像.

圖1 結構光照明相位/熒光雙模式顯微成像示意圖 (a) 光路原理圖;(b) 在DMD 上加載的正弦條紋圖案Fig.1.Experimental setup for dual-modality optical microscopy (including quantitative phase microscopy and super-resolution fluorescence microscopy) based on structured light illumination: (a) Optical setup of dual modality;(b) fringe patterns loaded on DMD.

圖1 所示的光路還可以用來實現(xiàn)超分辨熒光顯微成像.具體來說,在望遠鏡系統(tǒng)L2-L3的焦平面處放置一個振幅掩膜片,僅使±1 級衍射光通過,±1 級衍射光干涉形成的正弦條紋對樣品進行結構化照明.超分辨熒光顯微通道的照明光路和熒光探測光路由一個二向色鏡(DM)耦合.在結構光照明下產(chǎn)生的熒光信號沿與照明光相反的方向傳播,被探測物鏡MO1和透鏡L4收集后被CCD2(4096 ×3000 像素,像素大小 3.45 μm,Basler ace acA4112-20 μm,寶視納視覺技術有限公司)采集,為了進一步消除反射回的照明光,我們在CCD2前加了一個高通濾光片.具體超分辨熒光重建過程見3.2 節(jié).

3 原理與實驗

3.1 結構光照明定量相位顯微成像

為方便起見,這里使用φθ,n表示樣品平面內(nèi)的條紋結構光:

式中,θ=mπ/4 表示條紋的方向,m一般取0,1,2 和3;K1,K2表示結構光的直流分量和調(diào)制度;r=(x,y)表示樣品面內(nèi)的空間坐標;pθ=(pcosθ,psinθ)表示二維照明向量,這里,p=sinμ/λ,μ表示±1 級照明光與z軸之間的夾角,λ表示照明光的中心波長.為了最大化結構光照明下的數(shù)字全息顯微成像空間分辨率,設置DMD 上加載的條紋周期為5 個像素.實驗中進行了5 次相移操作,對應φn=2π(n– 1)/5,n=1,2,···,5.

其次,使用Ψθ,n(r) 表示待測樣品在結構光φθ,n(r)的照明下產(chǎn)生的物光波.此處,假定從樣品平面到CCD1平面的放大率為1.在CCD1平面內(nèi)物光和參考光波(R(r))發(fā)生干涉后產(chǎn)生的光強分布可以表示為Iθ,n(r)=|R(r)+Ψθ,n(r) |2.然后對CCD1記錄的全息圖進行二維空間傅里葉變換,可以得到如圖2(b)所示的頻譜分布.該頻譜包含位于頻譜中央的零級分量,以及位于兩側的原級項Ψθ,n(r)R*和共軛項(r)R.由于采用了結構光照明,全息圖零級分量、實像和共軛像中都分別出現(xiàn)了結構照明光0,±1 級衍射光的頻譜.通過窗口函數(shù)Wf選擇原級項Ψθ,n(r)R*對應的頻譜分布(如圖2(b)中白色圓部分),進而得到該結構光照明下的物光波[16]:

圖2 結構光照明定量相位顯微的圖像重構以及對蒼蠅翅切片的成像結果 (a)結構光照明數(shù)字全息顯微的全息圖;(b)圖(a)中全息圖的頻譜分布;(c)?(f) 條紋方向為0°,45°,90°和135°的結構光照明下得到的物光頻譜分布;(g)和(h) 平行光照明和結構光照明下的樣品頻譜分布;(i)和(j) 蒼蠅翅切片的振幅圖和相位圖,其中左/右半部分別為使用平行光照明/結構光照明對應的圖像;(k)和(l)圖(i)中虛框部位在平行光照明和結構光照明下恢復的振幅結果;(m)和(n)圖(j)中虛框部位在平行光照明和結構光照明下恢復的相位結果Fig.2.Image reconstruction of quantitative phase microscopy with structured light illumination and imaging results on fly wing sections: (a) Hologram of digital holographic microscopy (DHM) illuminated by structured light;(b) spectral distribution of the hologram in Fig.2(a);(c)?(f) spectra of the object waves obtained using 0°,45°,90° and 135° structured illumination;(g) and (h) frequency spectrum of samples under parallel and structured light illumination;(i) and (j) amplitude and phase images of a fly wing slice,where the left/right halves are images using parallel/structured light illumination,respectively;(k) and (l) the reconstructed amplitude results of the virtual box in the Fig.2(i) under plane-wave illumination and structured illumination;(m) and (n) reconstructed phase results of the dashed box in the Fig.2(j) under plane-wave illumination and structured illumination.

式中,RD(r)表示模擬的數(shù)字參考光波,FT{·}和IFT{·}分別表示空間傅里葉變換和傅里葉逆變換.需要注意的是,由(2)式計算得到的本質上是由沿著結構光φθ,n(r)的0,±1 級衍射光傳播的3 個物光(Aθ,0(r),Aθ,–1(r)和Aθ,+1(r))的線性組合:

依次改變條紋結構光的方向(θ=mπ/4,m一般取0,1,2 和3),可恢復4 個方向上Aθ,1(r),Aθ,–1(r)頻譜分布,分別如圖2(c)—(f)所示.然后將不同方向上的Aθ,1(r),Aθ,–1(r) 頻譜分量線性疊加在一起,得到合成孔徑的頻譜分布,如圖2(h)所示.通過對該頻譜進行逆傅里葉變換,可以獲得分辨率增強的振幅(圖2(l))和相位圖像(圖2(n)).這里,成像物鏡MO2的數(shù)值孔徑NAdet=0.3,照明數(shù)值孔徑NAillu=0.3.在平行于z軸的零級光下獲得的物體頻譜如圖2(g)所示,此時系統(tǒng)所能探測到的物體最大頻譜為NAdet/λ=0.3/0.561 μm–1=0.53 μm–1,如圖2(h)中黑色圓圈所示.相比而言,結構光照明下獲取到的物體頻譜分布包含了更多的高頻成分: (NAdet+NAillu)/λ=(0.3+0.3)/0.561 μm–1=1.10 μm–1,如圖2(h)中黑色圓圈和黃色圓圈所示.因此,在條紋結構光下,數(shù)字全息顯微成像的空間分辨率提升了1.10/0.53=2.07 倍.

為了驗證條紋結構光對數(shù)字全息顯微技術空間分辨率提升的有效性,對蒼蠅翅切片進行了成像.圖2(i)和圖2(j)的左側分別為使用平行于z軸的平行光照明所獲得的振幅圖和相位圖;圖2(i)和圖2(j)的右側分別為使用條紋結構光照明所獲得的振幅圖和相位圖.對比結果表明,條紋結構光照明下蒼蠅翅切片的圖像比在傳統(tǒng)的平行光照明下的圖像更加清晰,具有更多的細節(jié).

3.2 結構光照明熒光顯微成像

實驗中,采用方位角依次為π/4 的4 組條紋結構光對樣品進行照明,每組結構光依次進行5 次相移操作.在樣品平面上,照明光強分布為余弦條紋時,可表示為

式中,I0表示激發(fā)光的平均強度,m表示條紋的調(diào)制度,r表示位置向量,ki表示第i次條紋結構光對應的空間頻率(i=1,2,3,4),φj=2π(j– 1)/5表示條紋結構光第j次相移時對應的相移量(j=1,2,···,5).樣品在結構光Ii, j(r)照明下發(fā)出的熒光被成像到CCD2上.相機探測到的圖像可以使用以下公式表示:

式中,s(r)表示待測樣品的結構分布,h(r)表示非相干成像系統(tǒng)的點擴散函數(shù)(PSF),?表示卷積操作.對(7)式兩側進行空間傅里葉變換就可得到

式中,變量上方的波浪號表示該變量的空間頻譜分布,k表示頻域坐標,?h(k) 表示熒光顯微成像系統(tǒng)的光學傳遞函數(shù).把 (6)式代入 (8)式可得

為了最大化地獲得空間分辨率增強的樣品圖像,在DMD 上加載周期為5 個像素的正弦條紋.通過遮擋條紋的零級衍射級后,條紋結構光在樣品平面的空間頻率為1.06 μm–1(系統(tǒng)截止頻率為:1.29 μm–1).實驗中,采用五步相移(每次相移1 個像素,對應的相移量為φj=2π/5)來解調(diào)樣品的零級和±1 級頻譜分量[30]:

對女貞葉切片的同一位置分別進行了普通寬場熒光顯微和結構光照明熒光顯微成像.圖3(g)的左右兩側為寬場熒光顯微和結構光照明熒光顯微成像結果.圖3(h)和圖3(i)分別是圖3(g)中白色方框內(nèi)兩個模式成像結果的放大圖像.對比兩圖可發(fā)現(xiàn),結構光照明熒光顯微成像可以探測女貞葉切片更精細的結構.

圖3 結構光照明熒光顯微成像的圖像重構以及女貞葉切片的成像結果 (a)?(d) 條紋方向為0°,45°,90°和135°的結構光照明下得到的物光頻譜分布;(e)和(f) 平行光照明和結構光照明下的樣品頻譜分布;(g) 該圖左側和右側為使用平行光照明和結構光照明女貞葉切片的熒光圖像;(h)和(i)圖(g)中方框部位在使用平行光照明和結構光照明的熒光圖像放大圖Fig.3.Image reconstruction of structured light-illuminated fluorescence microscopy and imaging results of privet leaf slices: (a)?(d) Spectral distribution of object waves under structured light illumination with fringe directions of 0°,45°,90° and 135°;(e) and(f) spectral distribution of samples under parallel and structured light illumination;(g) the left and right halves of the figure are fluorescence images of privet leaf sections illuminated using parallel and structured light illumination;(h) and (i) magnified widefield and SIM images of the sample within the white-dash box in Fig.3(g).

4 實驗結果與討論

4.1 結構光照明數(shù)字全息顯微的空間分辨率驗證

實驗中,成像物鏡MO2的數(shù)值孔徑NAdet為0.3,所以當照明光是平行于z軸的平行光時,數(shù)字全息顯微成像的橫向空間分辨率為δ=0.82λ/NAdet=1.53 μm.另一方面,照明物鏡MO1的數(shù)值孔徑NAillum為0.4,所以結構光照明數(shù)字全息顯微成像時的最大空間分辨率可達δmax=0.82λ/(NAdet+NAillum)=0.66 μm.當DMD 加載周期為5 個像素的正弦條紋時,照射到樣品上的±1 級衍射光的照明角度為θillum=0.30 rad,此時結構光照明數(shù)字全息顯微的橫向分辨率δstr=0.82λ/(NAdet+sinθillum)=0.77 μm.

我們利用結構光照明數(shù)字全息顯微對直徑為500 nm 的二氧化硅小球進行了成像.圖4(a)的左/右側分別為使用平行于z軸的平行光照明/結構光照明時數(shù)字全息顯微獲得的振幅圖像.其中,白色虛框部位的兩個模式的放大圖如圖4(b)和圖4(c)所示.圖4(d)表示圖4(b)和圖4(c)中經(jīng)過同一二氧化硅小球中心的強度分布.通過對比可以發(fā)現(xiàn),條紋結構光照明可以顯著提高數(shù)字全息顯微成像的空間分辨率.為了定量分析兩個成像模式的空間分辨率,隨機選取了成像視場中的35 個二氧化硅小球,并通過高斯函數(shù)擬合測到一系列半高全寬,統(tǒng)計結果如圖4(e)所示.統(tǒng)計結果表明,使用平行于z軸的平行光照明時數(shù)字全息顯微成像的橫向空間分辨率為1.72 μm ± 0.13 μm,而結構光照明數(shù)字全息顯微成像的橫向空間分辨率為0.84 μm ±0.07 μm,使用結構光照明的方式可以將橫向空間分辨率提高2.04 倍.因此,結構光照明有效地提高了數(shù)字全息顯微成像的橫向空間分辨率.

圖4 基于平行光/結構光照明數(shù)字全息顯微對二氧化硅小球的成像結果 (a) 平行光(左)和結構光(右)照明時DHM 獲得的振幅圖像;(b)和(c)圖(a)中白色方框區(qū)域在使用平行光照明和結構光照明的重構結果;(d) 圖(b)和(c)中沿白色虛線的強度分布;(e) 平行光/結構光照明DHM 的空間分辨率比較,在圖(a)中隨機選擇35 個小球,并對其在兩個成像模式下半高全寬進行統(tǒng)計Fig.4.Plane-wave/structured-illumination based DHM imaging of SiO2 beads: (a) Images of SiO2 beads obtained by DHM with parallel illumination and structure illumination,respectively;(b) and (c) the magnified images within the white-box area in panel(a) obtained by plane-wave and structured illumination based DHM,respectively;(d) the intensity distributions along the white lines in panel (b) and (c);(e) statistics of lateral resolution of the two imaging modalities by randomly choosing and FWHM analysis of 35 beads for in panel (a).

4.2 結構光照明超分辨熒光顯微的空間分辨率驗證

由于物鏡MO1的數(shù)值孔徑NAillum=0.4,熒光樣品的發(fā)射波長λem為620 nm,因此傳統(tǒng)寬場熒光顯微成像的橫向空間分辨率為0.5λem/NAillum=0.78 μm.如前所述,實驗中給DMD 加載周期為5 個像素的正弦條紋,因此投影到樣品平面內(nèi)的正弦條紋周期PSIM=0.95 μm,在該結構光照明下SIM 的空間分辨率比平行光照明的成像模式提高了1.81 倍((2×NAillum/λem+1/PSIM)/(2×NAillum/λem)=1.81)[31].由此可得,SIM 的理論空間分辨率為0.43 μm.分別使用傳統(tǒng)的寬場顯微(平行光照明)和SIM 對直徑為500 nm 的熒光聚苯乙烯小球(RF500C,發(fā)射波長620 nm,中國上海輝質生物科技有限公司)進行成像.圖5(a)的左/右側分別為使用平行于z軸的平行光照明/結構光照明熒光顯微成像所獲得的熒光小球圖像.圖5(b)和圖5(c)分別是圖5(a)中白色虛框對應的寬場顯微和SIM的放大圖像.圖5(d)為圖5(b)和圖5(c)中白色虛線對應的強度分布.通過對比可以發(fā)現(xiàn),結構光照明熒光顯微成像能夠分辨而寬場熒光顯微成像無法分辨的兩個小球.進一步隨機選取35 個熒光小球,并測量了它們在寬場熒光成像和結構光照明熒光顯微成像下的半高全寬,結果見圖5(e)所示.統(tǒng)計結果表明寬場熒光成像的橫向空間分辨率為0.91 μm ± 0.02 μm,而結構光照明熒光顯微成像的橫向空間分辨率為0.44 μm ± 0.04 μm.因此,相比于傳統(tǒng)寬場熒光顯微成像,結構光照明熒光顯微成像的橫向空間分辨率提高了2.07 倍.

圖5 寬場顯微和SIM 對熒光小球的成像結果 (a) 寬場顯微(左)和SIM(右)圖像;(b)和(c)圖(a)中白色方框區(qū)域對應的寬場和SIM 圖像的放大圖;(d)圖(b)和(c)中沿白色虛線的強度分布;(e)圖(a)寬場和SIM 模式空間分辨率的統(tǒng)計,在圖(a)中隨機選擇35 個小球,并對其在兩個成像模式下半高全寬進行統(tǒng)計Fig.5.Wide-field and SIM imaging of fluorescent beads: (a) Wide-field (left) and SIM (right) images of the sample;(b) and (c) the magnified wide-field and SIM images of the sample within the white-box in panel (a);(d) the intensity distribution along the white lines in panel (b) and (c);(e) statistics of lateral resolution of the two imaging modalities by randomly choosing and FWHM analysis of 35 beads for in panel (a).

4.3 結構光照明相位/熒光雙模式顯微成像

本文所提出的結構光照明相位/熒光雙模式顯微成像技術,可以對同一透明熒光樣品進行高分辨率的相位/熒光檢測.在兩種成像模式中,DMD 上加載的條紋周期均為5 個像素.當條紋結構光照射到待測樣品上后,攜帶有透明樣品相位信息的物光波沿著透射光路被CCD1記錄.結構光在同一樣品激發(fā)的熒光經(jīng)過反射光路由CCD2記錄.利用上述兩種成像模式的重構算法可以得到待測樣品的高分辨相位和超分辨熒光圖.

首先使用3 個樣品進行雙模式成像,圖6(a)—(c)、圖6(d)—(f)和圖6(g)—(i)分別為迎春葉橫切、水稻葉和鼠尾橫切的結構光照明相位/熒光雙模式顯微成像結果,圖6(c),(f)和(i)是3 種樣品的相位/熒光合并圖.可以看出,同一樣品的相位/熒光圖像具有高度的一致性和互補性.為了進一步反映所提系統(tǒng)的高分辨率相位/熒光雙模式成像的能力,對SiHa 細胞進行了進一步的實驗.實驗中,首先用熒光染料(線粒體紅色熒光探針,C1049B-50 μg,碧云天生物)對SiHa 細胞內(nèi)的線粒體進行特異性地標記,然后使用4%的甲醛對整個細胞進行固定.圖6(j)是結構光照明下SiHa 細胞的相位圖像,圖6(k)是SiHa 細胞中線粒體的超分辨熒光圖像,圖6(l)是SiHa 細胞的相位/熒光模式合并圖像.通過對比可以看出,相位圖像可以反映細胞的整體形態(tài),而熒光圖像只能展示細胞核周圍的線粒體分布情況,兩種模式耦合后可以反映SiHa 細胞內(nèi)線粒體的分布情況,說明兩種成像模式具有一定的互補性.值得注意的是,結構光照明數(shù)字全息顯微可以得到待測樣品的振幅和相位信息,而結構光照明熒光顯微(尤其是借助熒光標記)可以更好地呈現(xiàn)樣品特定的功能結構.因此,采用本文所提的結構光照明相位/熒光雙模式顯微技術可以獲得待測樣品更全面的信息.

圖6 結構光照明相位/熒光雙模式顯微成像 (a)和(b) 迎春葉切片的相位和熒光圖像;(d)和(e)水稻葉的相位和熒光圖像;(g)和(h)鼠尾切片的相位和熒光圖像;(j) SiHa 細胞的相位圖像;(k) SiHa 細胞中的線粒體的熒光圖像;(c),(f),(i)和(l) 4 種樣品的相位/熒光融合圖Fig.6.Structured illumination based phase/fluorescence dual-mode microscopic imaging of spring leaves,rice leaves,and mouse tail transection: (a) and (b) Phase and fluorescence images of cross-sections of spring leaves;(d) and (e) phase and fluorescence images of rice leaves;(g) and (h) phase and fluorescence images of mouse tail transection;(j) phase image of SiHa cells;(k) fluorescence image of mitochondria in SiHa cells;(c),(f),(i) and (l) combined phase/fluorescence images of the four samples.

5 總結

本文提出了一種基于DMD 的結構光照明相位/熒光雙模式顯微技術,利用該裝置可以獲得待測樣品 (相位和熒光)雙模式圖像信息.在傳統(tǒng)相位重建方法中引入了針對環(huán)境擾動對相位成像影響的數(shù)值補償方法,提高了相位測量精度.高分辨相位顯微成像方法可以對透明樣品進行無標記、高襯度、高分辨率成像.超分辨熒光顯微成像方法借助熒光標記,可以看到樣品中特定的功能結構.將以上兩種方法結合可以獲得樣品的多維信息,更有利于科研人員對樣品結構和特性的深入研究.在接下來的工作研究中將繼續(xù)開展基于結構光照明的光學斷層掃描成像,獲得透明樣品的三維折射率分布.