不同泌乳期人乳外泌體miRNA 表達譜的研究

羅雨佳，黃子彧，林瑩瑩，郭慧媛，2*

（1 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 北京100083 2 中國農(nóng)業(yè)大學營養(yǎng)與健康系 北京100193 3 國家乳業(yè)技術創(chuàng)新中心 北京 100193）

母乳是新生兒最好的營養(yǎng)來源[1]，對嬰兒的胃腸道健康、神經(jīng)以及免疫系統(tǒng)的發(fā)育至關重要。母乳的功能與成分之間有密不可分的聯(lián)系。它不僅提供基礎的營養(yǎng)物質（如碳水化合物、脂肪、蛋白質等），還包含一些非營養(yǎng)性的生物活性因子，比如外泌體、乳鐵蛋白等，這些活性物質在人體的生長發(fā)育中同樣有著重要的作用。

外泌體是一類直徑約30～200 nm，具有脂質雙層結構的微小囊泡[2]。外泌體能夠攜帶一些信號分子，在細胞間的生物信息交流過程中發(fā)揮重要作用[3]。它存在于大部分體液中，如血液、尿液以及唾液等[4]。乳汁是一種豐富的外泌體來源。目前對于乳源外泌體的研究主要集中在疾病診斷物和藥物載體靶向治療方面[5]。乳源外泌體的生理功能是近年來的研究熱點，乳源外泌體在免疫調節(jié)[6]、炎癥預防[7-8]以及腸道發(fā)育[9]的功能已被證實。然而，這些研究大都針對內源性外泌體，對于外源性外泌體（例如乳源外泌體）的生理功能研究還處于初級探索階段。

外泌體主要的組成部分是蛋白質（膜連蛋白、肌動蛋白等）、核酸（micoRNA、lncRNA 等）和脂質。有研究表明，乳源外泌體有泌乳期特異性的特點，而乳源外泌體中的miRNA 被認為是乳源外泌體發(fā)揮生理功能的主要貢獻者[10-11]。每一種miRNA 都有其特定的生物學功能，而發(fā)揮功能需要達到特定的表達量[12-13]。據(jù)報道，泌乳期會影響乳源外泌體中miRNA 的種類與表達量[14]。了解不同泌乳期乳源外泌體中miRNAs 的表達情況，對探究不同泌乳期乳源外泌體的功能有重要意義。部分研究表明泌乳期影響乳源外泌體中miRNAs 的種類及表達量[15-16]。然而，這些研究大都集中在其它哺乳動物上（如牛乳、豬乳），目前關于泌乳期對人乳外泌體中miRNAs 種類及表達量的影響還鮮有報道。此外，乳源外泌體中還有大量與炎癥相關的miRNA[17-18]，這些miRNA 對嬰幼兒預防及抵抗炎癥疾病有著重要的意義，然而，目前未見有關泌乳期對乳源外泌體中炎癥相關miRNA 有影響的報道。

本研究采用超高速離心法獲得囊泡結構物質，從形狀、粒徑和標記蛋白3 個方面對外泌體進行鑒定。利用高通量測序分析比較不同泌乳期人乳外泌體中miRNA 的種類與表達量，在此基礎上篩選出表達量高和表達量變化有顯著差異的miRNA，以探究不同泌乳期間人乳外泌體中miRNA 的種類及表達水平的變化。將檢出的miRNA與數(shù)據(jù)庫比對，找到與炎癥相關的miRNA，探究人乳外泌體中與炎癥相關的miRNA 隨泌乳期的變化情況，為更好地研究不同泌乳期人乳外泌體生理功能提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

母乳樣品來自北京地區(qū)的15 位健康母親的母乳，采樣時間涵蓋產(chǎn)后泌乳期早期（3～14 d）、泌乳期中期（15 d～6 個月）與泌乳期晚期（7～9 個月）。當母親喂養(yǎng)嬰兒時，用滅菌的取乳器采集母乳后裝入無菌、無酶的離心管內，每份樣品的采集量為30 mL（初乳為20 mL）。母乳收集后立即放于-20 ℃保存，回到實驗室保存在-80 ℃，每份樣品的貯藏時間都在半年之內。

1.2 試劑

氯化鈉、十二水合磷酸氫二鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、無水乙醇、無水甲醇、三氯甲烷、異丙醇、十二烷基磺酸鈉（SDS）、過硫酸銨，購自北京化工廠；β-巰基乙醇、苯甲基磺酰氟（PMSF）、麗春紅，購自Sigma 公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、細胞裂解液Dnase/RNase-Free 去離子水、一抗稀釋液、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔抗體，購自上海碧云天公司；BCA 試劑盒，購自美國Thermo 公司；彩虹蛋白Marker，購自索萊寶公司；脫脂乳，購自伊利股份有限公司；ECL 顯影液，購自Millipore 公司；CD63 抗體、Hsp-70 抗體、TSG-101 抗體、Calnexin 抗體，美國CST 公司。

1.3 儀器與設備

Infinite M200 Pro 全波長酶標儀，瑞士TECAN 公司；1 000，200，100，10 μL 微量連續(xù)可調移液器，德國Eppendorf 公司；DK-8B 電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備有限公司；Revco UltimaⅡ低溫冰箱，美國Revco 公司；DK-98-Ⅱ2KW 超凈工作臺，天津泰斯特儀器廠；GL-206 低速離心機，上海安亭科學儀器廠；LDZM-40KCS 高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；Imager 600 凝膠成像儀，美國Amersham 公司；165-8001 電泳儀、164-5050 電泳槽，美國Bio-rad 公司；低溫高速離心機，美國Thermo 公司；低溫超高速離心機，美國Beckman 公司；JEM1200EX 電子透射電鏡，日本JEOL 公司；馬爾文粒徑儀，英國Malvern Nano-ZS公司；SCIENTZ-IID 超聲波破碎儀，中國寧波新芝生物科技公司。

1.4 方法

1.4.1 人乳外泌體的提取方法 樣品解凍后，于2 000×g、4 ℃下離心15 min 去除脂肪；接著在12 000×g、4 ℃下離心1 h 去除細胞碎片；接著在100 000×g、4 ℃下超高速離心1 h，重復3 次，得到的沉淀物即為外泌體。結束后倒出清液，添加PBS，于100 000×g、4 ℃下離心1 h 洗滌，重復2次。最后將PBS 倒出，離心管中加入無菌PBS 反復吹吸至外泌體基本溶解于PBS 緩沖液中，再分別轉移至EP 小管中，凍存于-80 ℃冰箱。

1.4.2 外泌體形態(tài)結構 從人乳外泌體原液中取10 μL 于200 μL 無菌無酶水中稀釋混勻，再取10 μL 稀釋液滴加到300 目的鎳網(wǎng)上。靜置10 min 后，用濾紙吸干鎳網(wǎng)周圍的水，干燥30 min 后滴加超純水。靜置10 min，用濾紙吸干后自然晾干30 min。以上步驟重復3 次。最后將鎳網(wǎng)置于透射電子顯微鏡80～120 kV 下觀察所提取外泌體的形態(tài)結構。

1.4.3 粒徑測定 將提取的人乳外泌體用超純水稀釋1 000 倍然后從稀釋液中取1 mL 放入馬爾文粒徑儀中測定外泌體粒徑大小分布。溶劑設定為水（折射率1.33，分散相為脂肪，折射率1.48）。根據(jù)Stockes-Einstein 方程式測算出人乳外泌體的流體力學直徑及分布。

1.4.4 蛋白質免疫印跡 將外泌體放入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液中裂解。蛋白濃度使用BCA 試劑盒進行測定。接著在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，然后轉移到PVDF 膜上。脫脂乳封閉2 h 后，抗體4 ℃孵育過夜。PBST（PBS 中補充吐溫20）洗膜，每次5 分鐘，重復5 次。使用辣根過氧化物酶標記山羊抗兔抗體孵育1 h，PBST洗膜（方法同上）。最后滴加ECL 顯影液后顯影。

1.4.5 文庫構建、測序及數(shù)據(jù)分析 由聯(lián)川生物科技有限公司對從外泌體提取出的RNA 進行轉錄組測序。連接3'adaptor 和5'adaptor 后合成第一鏈cDNA，再進行PCR 擴增。選擇大小合適的片段后在Agilent 2200 TapeStation 進行文庫質檢。通過質檢的文庫，上機進行樣本制備。測序程序結束后，采用聯(lián)川公司自主開發(fā)的ACGT101-miR 軟件對測序的結果進行分析。分析流程為：1）將3' 端接頭和垃圾序列去除，獲取有效序列。2）按照序列的長度，保留堿基長度在18～26 nt 的序列。3）將篩選后的序列與mRNA、Rfam 和Repbase 幾個數(shù)據(jù)庫里面的序列進行比對，將能比對上的序列去掉。4）余下的序列在miRBase 數(shù)據(jù)庫中，比對前體與基因組，得到miRNA 有效數(shù)據(jù)。5）進行miRNA差異性分析。miRNA 的聚類方法為層次聚類法complete-linkage。使用TargetScan 和miRanda 兩款軟件對測序得出的miRNA 分別進行靶基因預測，依據(jù)軟件各自的篩選標準，將TargetScan 的結果中contect score percentile 小于50 的靶基因和miRanda 的結果中Max Energy>-10 的靶基因去除后，取兩個軟件結果中的交集。然后在DAVID網(wǎng)站上對miRNA 靶基因的功能進行預測，把靶基因對應的功能及通路的基因數(shù)目統(tǒng)計出來，使用超幾何檢驗，將所選miRNA 對應的靶基因mRNA與數(shù)據(jù)庫中功能及通路對應的基因數(shù)量相比，以P<0.05 為閾值，查看該miRNA 是否與炎癥NFκB通路相關。將可能作用于NF-κB通路的miRNA 再放入web of science 數(shù)據(jù)庫中，若是能搜索出該miRNA 與炎癥的相關報道，則認為該miRNA 與炎癥相關。

1.4.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 結果均表示為平均數(shù)±標準誤。統(tǒng)計分析均采用SPSS 21.0 軟件進行。當兩組數(shù)據(jù)進行顯著性比較時，使用t 檢驗進行分析；當多組數(shù)據(jù)間進行顯著性比較時，使用單因素方差分析（oneway ANOVA）伴隨鄧肯（Duncan）多重比較，當P<0.05 認為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 人乳外泌體的鑒定

如圖1a 所示，在透射電鏡下觀察到經(jīng)過超高速離心法得到的人乳外泌體是呈橢圓形、有雙層膜結構的囊泡，粒徑大小在100 nm 以內。圖1b 表明，人乳外泌體粒徑的峰值為（68.18±8.24）nm，該結果與在透射電鏡下觀察到的結果相符。從前人的結果可知，外泌體為30～150 nm 的囊泡結構[3-4]，從粒徑大小上，本研究中的提取物符合外泌體的標準。

圖1 人乳外泌體的鑒定與表征Fig.1 Identification and characterization of human milk exosomes

由于乳中粒徑在100 nm 的成分可能為脂肪球、外泌體或者細胞碎片，因此本文對提取物進行標記蛋白的檢測。由圖1c 可知，提取物能檢測出外泌體表面標志蛋白CD63、CD81、Alix 和TSG-101 的表達，排除了脂肪球的可能性。此外，在提取的外泌體中未檢測到Calnexin 蛋白的表達，該蛋白是一種內質網(wǎng)來源蛋白，在提取的外泌體中檢測不到它，說明樣品沒有或者很少存在其它細胞器（如內質網(wǎng)）產(chǎn)生的囊泡小體的污染。綜合以上結果，可以證明采用超高速離心法能夠成功提出人乳外泌體。

2.2 不同泌乳期外泌體miRNA 的表達情況

2.2.1 不同泌乳期miRNA 的種類表達情況 由圖2 可知，人乳外泌體中共檢測出852 種miRNA，其中泌乳期早期檢測出390 種miRNA，泌乳期中期檢測出656 種miRNA，泌乳期晚期檢測出474 種miRNA。有283 種miRNA 在整個泌乳期中均能檢測出，它們的表達量占外泌體中總表達量的99%。此外，任何泌乳期都有自己獨有的特異性miRNA。泌乳中期人乳外泌體中所含的特有miRNA 最多，其次是泌乳末期人乳外泌體，特異性miRNA 種類最少的為泌乳早期外泌體。然而，這些特異性miRNA 在人乳外泌體中的表達量并不高，表達量處于每段泌乳期的末位，在外泌體中的總表達量小于1%。一般情況下，miRNA 的表達情況與其功能息息相關，關于這些在整個泌乳期間都高表達的miRNA 所行使的功能還尚未可知，需要進一步進行研究。泌乳期會影響人乳外泌體中低表達miRNA 的種類變化，然而由于表達量過低，這些miRNA 能否發(fā)揮生理調控作用有待研究。

圖2 早、中、晚泌乳期外泌體中共有及特異性表達的miRNAFig.2 Mutual and different miRNA in early，middle and late lactation of human milk exosomes

2.2.2 不同泌乳期表達水平前10 位的miRNA 表達量的變化 為了探究泌乳期是否會影響人乳外泌體中高表達miRNA 的表達，將每個miRNA 的表達量以lg10 取對數(shù)后再經(jīng)過將數(shù)值中心化后以-2 到3 表示表達量的大小（圖3）。乳外泌體中表達量最豐富的miRNA 是miR-148a-3p，在任何泌乳期，該miRNA 的含量都排在首位，遠高于其它miRNA，超過總miRNA 表達量的14%。表達量處于前10 位的miRNA 占整體外泌體中miRNA序列表達量的50%以上。

圖3 不同泌乳期外泌體中表達水平最豐富的前10 名miRNAFig.3 Top 10 miRNA in early，middle and late lactation of human milk exosomes

此外，不同的泌乳期中，表達量處于前10 位miRNA 的種類雖然會有一些變化，但變化不大。如在早期乳中出現(xiàn)的miR-423、中期乳中miR-30b-5p、晚期乳中出現(xiàn)的miR-29a，雖然在其它時期內沒有排在前10 位之中，但是能在其它時期的第10～15 位中找到。對不同時期乳外泌體中上述miRNA 的含量進行分析，結果如圖4 所示。圖中每個小方格表示一個基因，其顏色表示基因表達量的大小，顏色越紅說明該miRNA 的表達量越高，顏色越藍說明該miRNA 的表達量越低。miR-30b-5p 含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢；miR-320a-3p 的表達量呈現(xiàn)一直下降的趨勢；let-7b-5p、miR-21-5p 和miR-30a-5p 呈現(xiàn)先上升后平緩的趨勢，而其它miRNA，如miR-148a-3p 和let-7g-5p 的表達量基本不變。對這些數(shù)據(jù)進行顯著性分析發(fā)現(xiàn)它們并無顯著性變化。以上結果表明泌乳期對人乳外泌體中高表達miRNA 的表達量變化無明顯影響，它們在整個泌乳期都穩(wěn)定表達，可能它們對機體的生長發(fā)育十分重要。研究表明，這些在整個泌乳期中都表達穩(wěn)定的miRNA 在機體器官發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、能量代謝以及免疫調節(jié)中發(fā)揮重要的作用[15，19]。乳外泌體中含量最高的miR-148a-3p 能夠通過作用于靶基因賴氨酸特異性脫甲基酶6B 來促進成骨細胞的分化[20]。let-7b能夠靶向神經(jīng)生長因子促進周圍神經(jīng)的生長[21]。miR-22-3p 能夠靶向Wnt 通路中的轉錄因子7，進而增加肝臟糖異生途徑酶的表達，對碳水化合物的代謝有調節(jié)作用[22]。miR-30b-5p 對氨基半乳糖胺轉移酶（GALNT7）靶基因的表達有抑制作用，當其上調時能夠增加細胞因子（IL-10）的分泌量，進而激活免疫細胞[23]。對于乳源外泌體中含量豐富且穩(wěn)定表達的miRNA 的功能，尤其是它們對于新生兒影響還有待進一步探索。

圖4 含量最高miRNA 在早、中、晚期表達量的變化Fig.4 Changes of expression levels of miRNA with the highest content in early，middle and late lactation

2.3 不同泌乳期人乳外泌體中表達量顯著變化的miRNA

不同泌乳期表達量顯著變化的miRNA 往往與該階段嬰幼兒的生理需求密切相關，可能對嬰幼兒的生理行為有較大的調控作用，值得關注。通過比較早、中、晚泌乳期人乳外泌體中miRNA 的表達譜，找到了表達量變化極顯著（P<0.01）的8個miRNA，如圖5 所示，它們分別是：hsa-let-7ip3、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-103a-5p、hsamiR-874-3p、mmu-mir-3968-p3、hsa-miR-369-3p、hsa-miR-190a-5p、hsa-miR-3615-3p。除hsamiR-190a-5p 的表達量在中期最高外，其它miRNA 均是在早期與中期表達量不變，而在晚期表達量顯著升高。將3 個泌乳期間各個miRNA 按表達量從大到小進行排序，可以看出這些miRNA 的排名并不靠前，甚至位于末端，可見它們在乳外泌中的表達量不高。通過查閱文獻，我發(fā)現(xiàn)這些miRNA 大多具有抗癌功能。例如，當miR-1271 過表達時，能夠有效地抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲[24]。miR-874-3p 在肝癌細胞過表達時，在體外試驗中能夠抑制細胞生長和聚集形成，促進細胞凋亡[25]。miR-190a 能夠抑制間充質-上皮細胞轉化，并影響肝癌細胞的遷移和侵襲能力[26]。miR-369-3p 可以抑制乳頭狀甲狀腺癌細胞的侵襲、遷移和上皮間質轉化[27]。然而，這些miRNA 為何在泌乳期末期表達量迅速增加，它們的功能與嬰幼兒的生長發(fā)育需求有什么關聯(lián)，還需要進一步探討。此外，不少研究者認為當miRNA 的表達量大于1 000 拷貝數(shù)時[28]，它們才有調控機體生理活動的作用，而這7 個miRNA 的表達量在乳外泌體中的表達量并不高，它們能否在飲用者的體內發(fā)揮作用還有待進一步研究。

圖5 不同泌乳期之間表達量變化顯著的miRNA 及在各個泌乳期的排名Fig.5 miRNA with significant expression changes between different lactation periods and their ranking in each lactation period

2.4 不同泌乳期人乳外泌體中表達量顯著變化的miRNA

乳外泌體中含有豐富的與炎癥相關的miRNA，本研究測序結果顯示與炎癥相關的miRNA分布在不同泌乳時期，其中在早、中、晚期外泌體中均有表達的miRNA 共有65 個，占外泌體中miRNA 總表達量的54%，即乳外泌體含有大量且豐富的與炎癥相關的miRNA。如圖6 所示，與炎癥相關且表達量高（排名處于前10 位）的miRNA如hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-30b-5p、hsa-miR-22-3p 等，在不同泌乳期間的表達量沒有顯著改變。例如has-miR-148a-3p，它在3 個泌乳期均是人乳外泌體中表達量最高的miRNA，在早、中、晚期的表達量分別為15.8%，14.8%和18.2%，并沒有顯著變化（P>0.05）。以上結果表明，泌乳期對乳外泌中與炎癥相關的miRNA 的影響較小，這些miRNA 在不同的泌乳期均能穩(wěn)定表達，由此推測它們對機體炎癥調節(jié)十分重要，哺乳動物能夠通過飲用乳汁來調節(jié)體內炎癥。

圖6 不同泌乳期外泌體中與炎癥相關的miRNAFig.6 Inflammation-related miRNA in the exosomes of different lactation stages

3 結論

通過形狀、粒徑和標記蛋白確定超高速離心法能有效分離提取人乳外泌體。通過高通量測序得到人乳外泌體中miRNAs 在不同泌乳期（早、中、晚期）的表達譜。通過比較3 個時期人乳外泌體miRNAs 表達譜發(fā)現(xiàn)，高表達miRNAs 占總體表達量的50%以上。這些高表達的miRNAs 在泌乳期早期、中期和晚期中均能穩(wěn)定表達，表達量無顯著差異。相反，泌乳期對低表達的miRNAs 影響顯著，這些miRNAs 的種類與表達量在不同泌乳期中會有改變，他們的功能以及表達量變化原因值得進一步探究。此外，生物學分析表明人乳外泌體中含有豐富的與炎癥相關的miRNA，這些miRNAs 的表達量不隨泌乳期的變化而變化。人乳外泌體可能具有調控炎癥的功能，這為更好地研究不同泌乳期人乳外泌體生理功能提供參考。