基于UHPLC-QE-MS 代謝組學(xué)分析小粒種咖啡豆特征成分

苗 玥，譚 超，彭春秀，龔加順*

（1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 昆明650201 2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院 昆明 650201）

咖啡作為全球最重要的經(jīng)濟(jì)作物，主要包括3 大種植區(qū)——亞洲的太平洋地區(qū)、非洲和拉丁美洲，有3 大原生種——阿拉比卡種、羅布斯塔種和利比里亞種。阿拉比卡種（小粒種）咖啡無論是種植產(chǎn)量還是消費(fèi)量都居于三大原生種之首。中國98.3%的咖啡主要種植在云南省，產(chǎn)量占全國總量的99.3%[1]。云南兼具亞熱帶季風(fēng)氣候、熱帶季風(fēng)氣候、高原山地氣候的特點(diǎn)，區(qū)域差異和垂直變化十分明顯[2]，使得云南小?？Х瘸尸F(xiàn)莓果、柑橘、草本、花香、茶等多樣化品質(zhì)特點(diǎn)。埃塞俄比亞是咖啡的發(fā)源地，盛產(chǎn)獨(dú)特而出眾的咖啡豆，帶著奔放的花香與果香味，受到咖啡從業(yè)人員的青睞以及消費(fèi)者的喜愛。研究云南咖啡與埃塞俄比亞咖啡之間的差異物質(zhì)，揭示云南咖啡豆特征成分，尋找云南小?？Х葍?yōu)勢，可為云南咖啡樹立自身品牌提供數(shù)據(jù)支撐。

為了明確生物內(nèi)源性代謝物的性質(zhì)及含量，探究其對內(nèi)、外因變化的應(yīng)答規(guī)律，代謝組學(xué)已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于食品研究中，尤其是食品安全性、防偽評估以及植物源性食品的品質(zhì)鑒定、檢測原料中不易揮發(fā)性化合物及動態(tài)監(jiān)控食品代謝物構(gòu)成[3]。代謝組學(xué)是通過整體分析植株中化合物分布，進(jìn)而尋找各組別間差異代謝產(chǎn)物的一種行之有效的分析方法[4]。挖掘可能發(fā)生變化的代謝通路，掌握植物生理信息，能對果實(shí)的營養(yǎng)品質(zhì)進(jìn)行監(jiān)控并提供初步的理論支持[5]。較多的代謝組學(xué)方法：例如核磁共振（NMR）[6]、同位素比率質(zhì)譜（IRMS）[7]、電子噴霧電離-質(zhì)譜【（ESI）-（HR）MS】[8]、拉曼光譜[9]、近紅外光譜[10]、LC-MS/MS[11]和GC/MS[12]等，已被廣泛用于咖啡品質(zhì)評價和尋找特征標(biāo)記物的研究中。由于液-質(zhì)聯(lián)用方法性能穩(wěn)定，目前被廣泛用于代謝組學(xué)分析。本研究采用的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-QE-MS）靈敏度高、特異性強(qiáng)、用時短、能同時鑒定多種化合物[13]。

本文以云南5 個主產(chǎn)區(qū)咖啡豆以及埃塞俄比亞咖啡豆為研究對象，采用代謝組學(xué)法全面分析、闡釋不同區(qū)域云南小?？Х戎g以及與埃塞俄比亞咖啡豆特征差異物的差異，挖掘云南地區(qū)咖啡豆特征成分以及代謝通路的變化，以期對中國咖啡品質(zhì)質(zhì)量評價體系的建立，以及產(chǎn)地溯源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小粒種咖啡豆（見表1）由云南德潞咖啡有限公司提供，在咖啡豆分析測試之前均儲存于-20℃冰箱。

表1 咖啡豆樣本Table 1 Coffee bean samples

甲醇、乙腈、乙酸銨、乙酸均為色譜純級，購自CNW Technologies 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、高分辨質(zhì)譜、離心機(jī)均來自賽默飛公司；天平、研磨儀，上海凈信科技有限公司；純水儀，Merck Millipore 公司；超聲儀，深圳市方奧微電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 稱取20 mg 經(jīng)液氮研磨后的樣品放于樣品瓶中同時加入1 mL 提取液（V甲醇：V乙腈：V水=2∶2∶1），渦旋混勻30 s；35 Hz、4 min 研磨處理，冰水浴超聲5 min；重復(fù)以上提取步驟3次；于-40 ℃放置1 h，之后于4 ℃、12 000 r/min 條件下離心15 min；取上清液上機(jī)檢測。

1.3.2 色譜條件 使用Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）液相色譜柱對目標(biāo)化合物進(jìn)行分離。A 相：水+5 mmol/L 乙酸銨+5 mmol/L 乙酸；B 相：甲醇。進(jìn)樣量2 μL；洗脫梯度如下：0～1.2 min，1% B；1.2～9.5 min，1%～99%B；9.5～11.8 min，99% B；11.8～12.0 min，99%～1%B；12～15 min，1% B。

1.3.3 質(zhì)譜條件 利用Thermo Q Exactive HFX質(zhì)譜儀進(jìn)行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。詳細(xì)參數(shù)如下：鞘層氣體流量和輔助氣體流量分別為30 Arb和10 Arb，毛細(xì)管溫度為350 ℃，全MS 分辨率：60 000，MS/MS 分辨率為7 500，NCE 模式下碰撞能量：10/30/60，噴霧電壓：4 kV（正離子模式）、3.8 kV（負(fù)離子模式）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 代謝產(chǎn)物鑒定 利用ProteoWizard 軟件將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成mzXML 格式，之后用R 程序包（內(nèi)核為XCMS）進(jìn)行峰識別、提取、對齊和積分等處理，然后通過與BiotreeDB（V2.1）自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配并進(jìn)行物質(zhì)注釋，Cutoff 值為0.3。然后利用公共PlantCyc 數(shù)據(jù)庫、KEGG 數(shù)據(jù)庫對物質(zhì)進(jìn)行功能注釋[4]。

1.4.2 差異代謝產(chǎn)物的篩選 利用SIMCA 14.1對代謝組學(xué)結(jié)果分析，進(jìn)行單變量和多變量分析，從而獲得組間差異代謝物。

1.4.3 代謝通路圖的繪制 通過差異代謝產(chǎn)物的KEGG 號，登錄KEGG（https：//www.kegg.jp/），使用KEGG Mapper、Search Pathway 分析，數(shù)據(jù)庫會匹配與化合物相關(guān)的代謝通路圖，并繪制相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝產(chǎn)物的代謝組學(xué)分析結(jié)果

在超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測到的所有代謝產(chǎn)物中，能同時與數(shù)據(jù)庫物質(zhì)的一級m/z 和數(shù)據(jù)庫的碎片離子（二級）m/z 匹配到的物質(zhì)，正離子模式下有18 622 個，負(fù)離子模式下有12 618 個。采用主成分分析對7 組咖啡樣品進(jìn)行鑒別。由圖1 可知，QC（質(zhì)量控制）樣本重合度較高，說明本試驗(yàn)方法穩(wěn)定性強(qiáng)且數(shù)據(jù)質(zhì)量高。兩個主成分（PCs）解釋了大部分的變化，PC1 和PC2 分別為正離子模式的37.5%和12.2%，負(fù)離子模式的40.9%和16.6%。然而，存在個別樣品處于在置信區(qū)間外，如在正離子模式下AS 組咖啡豆大多數(shù)樣品未在置信區(qū)間內(nèi)，可能是由于AS 是早期阿拉比卡咖啡豆，而云南小?？Х仁遣ㄅ宰兎N和鐵畢卡變種的混合群體，因此二者之間存在較多差異物。圖中存在重疊樣品，說明樣本中某些分子組成、濃度相近，可能的原因是相同品種間的聚集或不同品種間組分含量相近。綜上，PCA 無監(jiān)督分析方法所存在一定的組內(nèi)誤差，需要進(jìn)一步分析研究消除無關(guān)的隨機(jī)誤差。

圖1 PCA 得分圖Fig.1 PCA scores

2.2 云南咖啡豆與埃塞俄比亞咖啡豆相比的特征成分

利用監(jiān)督性正交偏最小二乘判別分析將與分類信息無關(guān)的噪音濾除，充分提高了模型的有效性和解析能力，排除樣本之間的誤差及其它的隨機(jī)誤差，并使組間的差異得到最大化[14]。由表2 可知，6 個分組模型的評價指標(biāo)R2Ycum、Q2cum 均>0.9，說明所建模型良好。

表2 云南小粒咖啡與埃塞俄比亞咖啡相比OPLS-DA 模型質(zhì)量參數(shù)Table 2 OPLS-DA quality parameters of Yunnan coffee beans compared with Ethiopian coffee bean

將P-value 值<0.05，F(xiàn)old change≥2 或≤0.5以及VIP 值>1 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選得到差異代謝物306 個。利用火山圖分析云南不同區(qū)域咖啡豆與埃塞俄比亞咖啡豆306 種差異代謝物的變化情況，在右上角象限內(nèi)說明該類化合物上調(diào)，而左上角說明該類化合物相對下調(diào)。如表3 及圖2 可知最終一共篩選得到36 種顯著差異代謝物，其中包括表兒茶素、3-O-咖啡酰-1-O-甲基奎寧酸等16 種多酚，十八碳三烯酸等8 種脂質(zhì)類，牡荊甙、水楊素等6 種糖類，乙酸異丁酸蔗糖酯等2 種有機(jī)酸類，生物堿類：6-羥基-1H-吲哚-3-乙酰胺、吲哚-3-羧酸，萜類（2 種）。這些物質(zhì)可作為區(qū)分云南小?？Х扰c埃塞俄比亞咖啡的潛在標(biāo)志物，其中有24 種化合物含量云南地區(qū)顯著高于埃塞俄比亞地區(qū)，包括10 種多酚類化合物如：3-O-咖啡酰-1-O-甲基奎寧酸、3-O-咖啡酰莽草酸等，這些物質(zhì)具有清除自由基，抗菌，消炎，抗病毒，降糖，降血脂，保肝利膽等多種功效[15]。7 種脂質(zhì)類物質(zhì)如（9S，10E，12Z，15Z）-9-羥基-10，12，15-十八碳三烯酸、（Z，E，Z）-9，11，13-十八碳三烯酸等具有優(yōu)異的生物學(xué)活性，如抗癌，減少脂肪堆積，降血壓和消炎等[16]。Castro-Moretti 等[17]使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法監(jiān)測到咖啡果蛀蟲侵襲會導(dǎo)致阿拉比卡種子中綠原酸含量的增加，而羅布斯塔中的有機(jī)酸和糖醇含量也會增加。

圖2 UHPLC-QE-MS 的火山圖Fig.2 Volcanic map of UHPLC-QE-M

2.3 云南不同地區(qū)咖啡豆的差異代謝產(chǎn)物分析

利用單維分析與多維分析相結(jié)合的方法，根據(jù)OPLS-DA 分析計(jì)算的變量權(quán)重重要性排序值（VIP）來篩選組間差異代謝物（VIP＞1），VIP 值與樣品組間分類判別的影響強(qiáng)度以及解釋能力成正比，VIP 值越大，解釋能力以及影響強(qiáng)度越強(qiáng)[18]。使用s-plot 圖對變量進(jìn)行鑒別，且每個變量與模型之間的相關(guān)性以及協(xié)變性也可由s-plot 圖體現(xiàn)。如圖3 所示，紅色標(biāo)識為所篩選得到的106 種差異代謝物。利用t 檢驗(yàn)判別篩選的106 種物質(zhì)在兩組之間是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并排除P>0.05 的變量。最終篩選得到44 種差異代謝物（圖4），包括谷氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等14 種氨基酸，棕櫚酰胺、花生酸、亞油酸等11 種脂質(zhì)類，3-羥基香豆素、綠原酸、奎寧酸等10 種多酚，富馬酸、蘋果酸、琥珀酸等3 種有機(jī)酸，糖類：海藻糖、水蘇糖，萜類：赤霉素A113、藏紅花酸，醇類：肌醇，其它類：Cafamarine。有研究通過HILIC-MS 代謝組學(xué)方法分析得到綠原酸、異綠原酸C、隱綠原酸、奎寧酸、咖啡酸、3-O-p-香豆?？鼘幩岬任镔|(zhì)也可作為咖啡烘焙豆的潛在生物標(biāo)記物[19]?？Х戎械陌被犷愇镔|(zhì)在美拉德反應(yīng)中扮演了重要的角色，它是產(chǎn)生吡啶、吡咯等芳香化合物的重要前體物質(zhì)；糖類物質(zhì)會影響咖啡在沖泡過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味組分；脂質(zhì)類物質(zhì)可以降低咖啡中的苦味及澀味組分進(jìn)而使口感圓潤豐滿[20]。UHPLC-（Q）TOFMS 法發(fā)現(xiàn)棕櫚酸、5-咖啡酰-奎尼酸、咖啡醇、N-乙酰-L-苯丙氨酸、3-羥基辛酸及1-O-Sinapoylglucose 可以作為鑒別哥倫比亞地區(qū)咖啡豆的特征成分標(biāo)記物[21]。咖啡中的二萜類化合物具有抗血管生成、抗腫瘤和抗炎的作用，Hu 等[22]采用LCMS/MS 技術(shù)對云南小?？Х群姹憾怪械妮祁愇镔|(zhì)進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)多種貝殼杉烷二萜類物質(zhì)，該發(fā)現(xiàn)為開發(fā)功能型咖啡提供理論依據(jù)。有研究對8 種不同成熟度咖啡豆進(jìn)行1H NMR 代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)糖、咖啡酰奎尼酸、咖啡因、葫蘆巴堿和奎寧酸可以作為咖啡豆成熟度的標(biāo)記物[23]。

圖3 UHPLC-QE-MS 的OPLS-DA s-plot 圖Fig.3 OPLS-DA s-plot of UHPLC-QE-MS

圖4 差異代謝物熱圖Fig.4 Heatmap of the differential metabolites

2.4 差異代謝產(chǎn)物在代謝通路中的分布分析

生物體中的復(fù)雜代謝反應(yīng)是由不同的蛋白質(zhì)和基因形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)和通路，其對其調(diào)控并不是單獨(dú)進(jìn)行的，不同蛋白質(zhì)和基因間的相互影響最終導(dǎo)致代謝組發(fā)生系統(tǒng)性的改變。京都基因與基因組百科全書Pathway 數(shù)據(jù)庫[24]將代謝反應(yīng)和代謝過程中基因和基因組所對應(yīng)的蛋白相串聯(lián)用于展示細(xì)胞的能量代謝、物質(zhì)運(yùn)輸、信號傳遞、細(xì)胞周期調(diào)控等生理生化過程和同系保守的子通路信息。通過綜合分析法（富集分析、拓?fù)浞治觯Σ町惔x物所在通路進(jìn)行篩選，找到與代謝物差異相關(guān)性最高的關(guān)鍵通路[25]。通過綜合分析法共標(biāo)注到7 個較為重要的代謝途徑，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，色氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，苯丙氨酸代謝，酪氨酸代謝，異喹啉生物堿生物合成，吲哚生物堿生物合成（圖5）。氨基酸和蛋白質(zhì)是環(huán)境脅迫下氮、硫代謝的主要產(chǎn)物，這些生物分子也是三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑以及糖酵解的中心，作為許多次級代謝物（如谷胱甘肽、生物堿和牛磺酸）的前體[26]。谷氨酸是合成谷氨酰胺的底物，而γ-氨基丁酸、精氨酸和脯氨酸的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)是由谷氨酸的碳骨架和α-氨基組成的。對于細(xì)胞壁蛋白形成和滲透調(diào)節(jié)而言，脯氨酸是必不可少的，此外，脯氨酸還是氮的儲存物質(zhì)和恢復(fù)生長的能源[27]。酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸用于蛋白質(zhì)的合成，是許多天然產(chǎn)物的前體，如生物堿、激素和細(xì)胞壁成分。此外，色氨酸還是硫代葡萄糖苷、生長素、抗毒素和生物堿等許多次級代謝物的前體，這些物質(zhì)可增強(qiáng)芳香化合物的生物合成；苯丙氨酸參與苯丙酸途徑中幾種植物化學(xué)物質(zhì)和抗氧化劑的生物合成。生物堿類物質(zhì)具有許多有益的生物活性作用，其積累受到生物和非生物環(huán)境的控制，一般將生物堿分為5 大類，天然異喹啉生物堿具有鎮(zhèn)痛、抗菌等作用[28]，吲哚類生物堿具有抗腫瘤、舒張血管的作用[29]。

圖5 氣泡圖Fig.5 Bubble chart

從表4 可以看出，不同地區(qū)氣溫、降水量有較大差異?？Х葮錇榱烁玫卦诋a(chǎn)地生長，會通過調(diào)節(jié)代謝水平進(jìn)而適應(yīng)外部環(huán)境的改變，導(dǎo)致咖啡中各種代謝物的含量和品質(zhì)有所差異，然而，產(chǎn)地影響咖啡代謝途徑及其機(jī)理的研究未見報道，有待進(jìn)一步研究。

表4 云南各地區(qū)地理環(huán)境特點(diǎn)Table 4 Geographical characteristics of various regions in Yunnan

3 結(jié)論

本研究基于UHPLC-QE-MS 的代謝組學(xué)技術(shù)對云南5 個區(qū)域及埃塞俄比亞地區(qū)的咖啡樣品進(jìn)行代謝組學(xué)分析，探究不同產(chǎn)地對咖啡代謝產(chǎn)物的影響。經(jīng)歸一化分析篩選后共鑒定出17 072個代謝產(chǎn)物，對樣品進(jìn)行PCA 和OPLS-DA 等多元分析，云南地區(qū)與埃塞俄比亞的樣品相比共有36 種差異物質(zhì)，其中Mammeigin、牡荊甙、3-O-咖啡酰-1-O-甲基奎寧酸、3-O-咖啡酰莽草酸、2，2-二甲基丁二酸、十八碳三烯酸等24 種化合物含量顯著高于埃塞俄比亞地區(qū)樣品，脂氧素、柚皮苷、表兒茶素、決明子苷等12 種化合物含量顯著低于埃塞俄比亞地區(qū)樣品，且從差異代謝物結(jié)果中可知云南小粒咖啡的多酚類物質(zhì)顯著高于埃塞俄比亞地區(qū)樣品。與不同地區(qū)云南小?？Х认啾裙埠Y選得到差異代謝物質(zhì)44 種，且倍數(shù)在1.01～4.96倍之間，這些差異代謝物可將不同地區(qū)咖啡豆樣品進(jìn)行較好地區(qū)分，說明在咖啡的代謝產(chǎn)物中可能含有其產(chǎn)地信息。綜上所述，基于UHPLC-QEMS 技術(shù)的代謝組學(xué)方法用于分析不同區(qū)域咖啡豆的特征代謝產(chǎn)物具有一定的可行性，可為因環(huán)境條件不同進(jìn)而導(dǎo)致的咖啡品質(zhì)差別提供一定的理論基礎(chǔ)。本研究結(jié)果表明利用基于UHPLCQE-MS 技術(shù)并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析的方法，可用于分析不同環(huán)境條件對咖啡代謝產(chǎn)物的影響，為咖啡豆的產(chǎn)地溯源提供理論依據(jù)。