紫菜復合酶解液改善飲食誘導肥胖和調節(jié)腸道菌群作用

程梟杰，張玉瑩，常耀光，薛長湖，唐慶娟

（中國海洋大學食品科學與工程學院 山東青島 266003）

近年來，肥胖及相關代謝疾病已成為全球性疾病。腸道菌群組成和功能的變化與肥胖的發(fā)生息息相關[1]，是通過膳食干預改善肥胖的重要靶點。海藻提取物等精加工產(chǎn)品可調節(jié)腸道菌群，輔助改善肥胖等慢性病，是食品行業(yè)的研究熱點之一[2]。紫菜隸屬于紅藻類，營養(yǎng)價值高，是一種藥食同源的藻。然而，當前對于紫菜產(chǎn)品的研究多集中于初加工產(chǎn)品，為數(shù)不多的精深加工產(chǎn)品主要有紫菜醬、紫菜油和紫菜飲料。目前，紫菜飲料的制作主要通過水提或蛋白酶降解制備紫菜原液，并利用食品添加劑調節(jié)風味[3]。該方法制作工藝簡單，然而，其中含有高分子質量紫菜多糖，導致產(chǎn)品黏度較大，不利于后續(xù)的澄清過濾[4]。

紫菜多糖具有降血脂、調節(jié)免疫等多種生物活性[5]。通過物理法、化學法或酶法降解多糖，是充分發(fā)揮其生物活性，提高相關產(chǎn)品穩(wěn)定性的有效途徑[6]。酶解法條件溫和且分子質量易控制，然而，專一酶不易獲得[7]。沈照鵬等[8]利用市售瓊膠酶降解紫菜，發(fā)現(xiàn)酶解可促進紫菜中營養(yǎng)物質溶出，尤其是總糖和還原糖含量顯著增加。本實驗室前期從海洋細菌中克隆一種新型GH16 β-紫菜酶，并將其與中性蛋白酶一同用于降解壇紫菜，所得復合酶解液與單純蛋白酶酶解液相比黏度更低、紫菜轉化率更高[9-10]。然而，其紫菜酶解液的生物活性仍需進一步研究。

綜上，本研究利用中性蛋白酶和紫菜多糖酶制作紫菜復合酶解液，并通過高脂飲食小鼠模型探究其對飲食誘導肥胖的影響，以及對腸道菌群的調節(jié)作用。研究結果可為提高壇紫菜的附加值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

壇紫菜，東山縣遠揚藻業(yè)有限公司。SPF 級C57BL/6J 小鼠（雄性，6 周齡，n=40），濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。10%低脂飼料、45%高脂飼料，南通特洛菲飼料科技有限公司，飼料配方見表1。中性蛋白酶，南寧東恒華道生物科技有限責任公司；紫菜多糖酶Por16A_Wf，實驗室自制。蘇木精伊紅（HE）染液，武漢賽維爾生物科技有限公司；Trizol 試劑，美國Invitrogen 公司；總膽固醇（TC）測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；RNA 純化試劑盒，自天根生化科技有限公司；5×All-In-One RT 裂解反轉錄一體試劑盒和Eva Green Express 2×q PCR Master Mix，abm 公司。

表1 動物實驗飼料成分Table 1 Ingredients of laboratory animal diets

1.2 儀器與設備

電動熒光顯微鏡（NIKON/Ni-E），日本尼康公司；酶標儀（SPARK 10M），瑞士TECAN；Nanodrop 2000/2000C（分光光度計），美國Thermo Scientific公司；Miseq 測序平臺，美國Illumina 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紫菜酶解液的制備

1）紫菜單一酶解液 向40 g 紫菜中加入800 mL pH 6.5 的蒸餾水，靜置復水，加入中性蛋白酶酶解。酶解條件為：按照10 500 U/g 的加酶量添加中性蛋白酶2 g，在45 ℃酶解6 h；酶解結束后，在100 ℃水浴10 min 滅酶，取出后自然沉降，4 000 r/min 離心15 min，所得上清液即紫菜單一酶解液。

2）紫菜復合酶解液 向酶解液中添加紫菜多糖酶Por16A_Wf 繼續(xù)酶解。酶解條件：加酶量0.5 U/g，35 ℃酶解2 h，于100 ℃水浴中加熱10 min 滅酶，然后4 000 r/min 離心15 min，所得上清液即紫菜復合酶解液。

1.3.2 紫菜酶解液理化性質分析

1）紫菜的酶解利用率 將紫菜酶解液離心，所得沉淀凍干稱重，計算沉淀占干紫菜粉的比重。

2）紫菜酶解液黏度的測定 使用流變儀在25 ℃下測定樣品黏度，剪切速率為0～100 s-1。

3）紫菜酶解液離心分離率及靜置分層率測定 取10 mL 酶解液于離心管中，于4 ℃中放置7 d，8 000 r/min 離心10 min，取出上層溶液測定體積。離心分離率（%）=（上層溶液體積/總體積）×100。取10 mL 酶解液于刻度試管中，于4 ℃放置7 d，測定析出水層的高度（Lw）和飲料總高度（Ls）。靜置分層率（%）=（Lw/Ls）×100。

4）紫菜酶解液中紫菜還原糖含量的測定 采用羥基苯甲酰肼（pHBH）法測定紫菜蛋白酶解液和紫菜復合酶解液中還原糖的含量。

1.3.3 動物飼養(yǎng)與取樣 動物實驗經(jīng)中國海洋大學食品科學與工程學院動物倫理委員會批準后進行（編號SPXY2020061602）。將32 只雄性C57BL/6J 小鼠暫養(yǎng)1 周后，按照其體重隨機分為4 組，低脂飲食組（LFD）、高脂飲食組（HFD）、紫菜單一酶解液組（SPEH）、紫菜復合酶解液組（CPEH），每組8 只（圖1）。除LFD 組飼喂10%低脂飼料，其余各組均飼喂45%高脂飼料。飼喂1 周后，LFD 組和HFD 組均灌胃生理鹽水，SPEH 組和CPEH 組分別灌胃兩種紫菜酶解液【300 mg/（kg bw）】。小鼠兩只1 籠，飼養(yǎng)環(huán)境為室溫（23 ± 2）℃，濕度55%～58%。第10 周結束時，處死小鼠，取小腸、肝臟等組織，于-80°C 保存。

圖1 動物實驗設計圖Fig.1 Schematic illustration of animal experiment

1.3.4 小鼠體重、攝食量及體脂率的測定 飼養(yǎng)期間，每兩天檢測1 次小鼠體重和攝食量。小鼠處死后，分別剝離皮下脂肪、附睪脂肪和腎周脂肪計算體脂率[11]。

1.3.5 血清脂質水平的測定 取小鼠血漿于滅菌離心管中，15 000 r/min 離心10 min 后取上清。用1.1 節(jié)中的試劑盒測定TC、HDL-c 水平，操作方法參照說明書。

1.3.6 脂肪組織HE 病理學分析 取白色脂肪組織用4%多聚甲醛固定，將其切成4 μm 的玻片，用HE 染色[11]。使用電動熒光顯微鏡觀察脂肪細胞形態(tài)并拍照。各組選定5 個切片，每個切片隨機選取8～10 個視野，采用Image J 軟件統(tǒng)計脂肪大小，取平均值。

1.3.7 熒光定量PCR 分析 使用Trizol 提取肝臟、白色脂肪中的總RNA。使用RNA 純化試劑盒去除蛋白質、無機鹽離子等。使用5× All-In-One RT 反轉錄試劑盒制備cDNA。實時熒光定量PCR 按照EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix試劑盒說明書操作。擴增條件：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，20 s，95 ℃，15 s（45 個循環(huán)）；5 ℃升溫至95 ℃（0.5 ℃/10 s），mRNA 相對表達量用2-ΔΔCT法計算。引物序列（表2）參考之前的研究進行設計[12-13]。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

1.3.8 短鏈脂肪酸（SCFAs）分析 采用Cao 等[14]的方法檢測糞便中SCFAs 含量。稱取糞便樣品，加入超純水（0.1 g ∶600 μL）后攪碎，漩渦振蕩混勻。加入50%硫酸酸化處理后離心，取上清，分別加入內標二乙基丁酸和等體積無水乙醚，取1 μL用于氣相色譜分析（安捷倫GC 6890）。載氣為高純氮氣，所選色譜柱為安捷倫CB-FFAP（30 m ×0.25 mm，0.25 μm）。檢測器為氫火焰離子化檢測器（FID）。

1.3.9 16S rRNA 擴增子測序分析 以提取的糞便DNA 為模板，采用細菌515F/926R 引物擴增16S rRNA 的V4～V5 高變區(qū)序列。參考李晶等[15]的方法，進行PCR 純化和擴增，所得PCR 產(chǎn)物采用Agencourt Ampure XP beat kit 核酸純化試劑盒純化回收。純化后的擴增產(chǎn)物使用Tru Seq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進行文庫構建，文庫合格后，使用Miseq 測序平臺上機測序。

采用MiSeq 控制軟件MCS 2.4.1 進行數(shù)據(jù)的預處理。FastQC0.11.2 軟件進行測序原始數(shù)據(jù)的質量控制。隨后雙端讀長的序列經(jīng)PandaSeq 2.8 軟件拼接成Contigs。由QIIME pipeline 1.9.1 去除接頭和引物序列后，測序數(shù)據(jù)使用Green Gene 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)信息進行快速多序列比對，進行物種注釋分析，所得的OTU 表用于后續(xù)分析。利用R 3.6.1 中的ANCOMBC 程序包分析科水平上的顯著差異菌，用selbal 程序包做balance 分析，并用Tax4Fun 程序包做腸道菌群功能預測分析。利用STAMP 軟件篩選具有顯著差異的腸道菌群功能（通路和酶）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)均用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析，作圖均采用GraphPad Prism 8.0 專業(yè)軟件，結果以平均值±標準差表示，組間差異采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 紫菜酶解液理化性質

2.1.1 紫菜的酶解利用率 單一酶解液和復合酶解液的紫菜酶解利用率分別為63%和78%，表明紫菜多糖酶的使用有利于對紫菜的充分利用。

2.1.2 紫菜酶解液黏度 圖2 為剪切速率對紫菜酶解液黏度的影響。在剪切速率為0～100 s-1的條件下，紫菜單一酶解液的黏度為2～15 Pa·s，紫菜復合酶解液的黏度為1.9～8.5 Pa·s。由此可知，在紫菜多糖酶的作用下，復合酶解液的流變性與水接近，表明紫菜多糖酶顯著降低了酶解液的黏度。

圖2 紫菜酶解液黏度Fig.2 Viscosity of the porphyra enzymatic hydrolysate

2.1.3 紫菜酶解液的穩(wěn)定性 如表3 所示，兩種酶解液離心分離率和靜置分層率間存在明顯的差異，表明在不添加食品穩(wěn)定劑時，復合酶解液放置7 d 后穩(wěn)定性高于單一酶解液。

表3 紫菜酶解液穩(wěn)定性Table 3 The stability of the porphyra enzymatic hydrolysate

2.1.4 紫菜酶解液中還原糖含量 如表4 所示，與紫菜單一酶解液相比，復合酶解液中還原糖含量增加了17.5%（以干質量計）。這說明在紫菜溶脹復水及蛋白酶酶解過程中，紫菜多糖被溶出，并在紫菜多糖酶的作用下被水解。

表4 紫菜酶解液還原糖含量Table 4 Reducing sugar content in the porphyra enzymatic hydrolysate

2.2 紫菜酶解液對肥胖小鼠體重、攝食量及能量攝入量的影響

肥胖的發(fā)生是因長期能量攝入過剩，臨床上以體重增加和脂肪異常堆積為主要特點。飼養(yǎng)期間小鼠的體重和攝食量變化見圖3a 和3b，各組小鼠體重保持穩(wěn)定增長。攝入高脂飲食后，HFD 組小鼠體重增長率顯著高于LFD 組（P<0.001），CPEH組小鼠體重增長率明顯低于HFD 組（P<0.05），而CPEH 干預對HFD 小鼠能量攝入無明顯影響。

圖3 紫菜酶解液對高脂飲食小鼠體重、攝食量、體重增長率及能量攝入量的影響Fig.3 Effects of the porphyra enzymatic hydrolysate on body weight，food intake，body weight growth rate and mean energy intake in high fat diet-fed mice

2.3 紫菜酶解液對肥胖小鼠血脂水平的影響

長期攝入高脂膳食導致血清TC 水平上升，同時用于轉運膽固醇的HDL-c 含量下降[16]。如圖4所示，用紫菜酶解液干預后，SPEH 組和CPEH 組的血脂水在一定程度上得到改善，其中CPEH 改善血脂水平效果更為顯著（P<0.05）。

圖4 紫菜酶解液對高脂飲食小鼠血清脂質水平的影響Fig.4 Effects of the porphyra enzymatic hydrolysate on serum lipid levels in high fat diet-fed mice

2.4 紫菜酶解液對肥胖小鼠脂肪細胞形態(tài)和體脂率的影響

脂肪細胞形態(tài)和尺寸的變化是脂肪沉積的重要特征[17]。如圖5 所示，LFD 組小鼠細胞面積小，各細胞間大小均勻；HFD 組小鼠脂肪面積大，大小不均勻且細胞形態(tài)不規(guī)則。紫菜酶解液干預后，SPEH 組小鼠脂肪細胞形態(tài)、尺寸均未得到明顯改善；CPEH 組與LFD 組脂肪的大小和數(shù)量較為接近?？傊喜藦秃厦附庖嚎捎行Ц纳聘咧嬍痴T導的肥胖，且效果優(yōu)于單一酶解液。

圖5 紫菜酶解液對高脂飲食小鼠脂肪細胞形態(tài)、大小及體脂率的影響Fig.5 Effects of the porphyra enzymatic hydrolysate on adipocyte morphology and size，and body fat percentage of high fat diet-fed mice

2.5 紫菜酶解液對肥胖小鼠脂代謝相關基因的影響

飲食誘導脂代謝紊亂主要表現(xiàn)為脂肪合成水平升高，而脂肪分解利用水平下降。肝臟是人體內源性TG 合成的重要場所。二脂酰甘油?；D移酶（DGAT1 和DGAT2）能催化TG 合成的最后一步[18]。如 圖6 所 示，與HFD 組 比 較，CPEH 組 肝 臟DAGT1 的mRNA 的表達水平降低了31.62%，且肝臟DAGT2 的mRNA 的表達水平顯著降低（P<0.05）。

圖6 紫菜酶解液對高脂飲食小鼠脂代謝相關基因表達的影響Fig.6 Effects of the porphyra enzymatic hydrolysate on genes related to lipid metabolism of high fat diet-fed mice

脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）和激素敏感脂肪酶（HSL）是參與細胞內TG 降解的關鍵酶[19]。與HFD 組比較，SPEH 組的白色脂肪ATGL 和HSL的mRNA 的表達水平顯著升高（P<0.05）。結果表明，紫菜復合酶解液干預顯著改善飲食誘導的脂代謝紊亂。

2.6 紫菜酶解液對SCFAs 合成的影響

SCFAs 是腸道菌群的主要代謝產(chǎn)物，在宿主脂質代謝調節(jié)中發(fā)揮積極的作用[20]。如圖7 所示，與LFD 組相比，HFD 組的乙酸、丙酸和丁酸水平分別下降了45.9%，40.6%和38.3%。與HFD 組相比，CPEH 組的乙酸、丙酸、異丁酸的水平顯著增加（P<0.05）?？傊?，紫菜復合酶解液干預10 周，可促進HFD 小鼠結腸內SCFAs 的產(chǎn)生，說明復合酶解液干預或許有助于調節(jié)HFD 小鼠腸道菌群。

圖7 紫菜酶解液對高脂飲食小鼠糞便中SCFAs 含量的影響Fig.7 Effects of the porphyra enzymatic hydrolysate on fecal SCFAs content in high fat diet-fed mice

2.7 紫菜酶解液對肥胖小鼠腸道菌群結構和組成的影響

2.7.1 對肥胖小鼠厚壁菌門和擬桿菌門比例的影響 研究表明，肥胖人群中厚壁菌門和擬桿菌門比例（Firmicutes/Bacteroidetes，F(xiàn)/B）升高，并且通過飲食干預可降低F/B 比例[21]。圖8 可知，與HFD組相比，CPEH 組小鼠腸道菌群中F/B 比例顯著降低（P<0.5）。

圖8 紫菜酶解液對高脂飲食小鼠厚壁菌門和擬桿菌門（F/B）比例的影響Fig.8 Effects of the porphyra enzymatic hydrolysate on the ratio of Firmicutes to Bacteroidetes（F/B）in high fat diet-fed

2.7.2 對肥胖小鼠腸道菌群組成的影響 利用ANCOM 來分析組間顯著差異的腸道細菌，結果見表5。與LFD 組比較，HFD 組鏈球菌科（Streptococcaceae）等相對豐度顯著增加（校正后的P 值（Adjusted P value）小于0.01），紅蝽菌科（Coriobacteriaceae）等相對豐度顯著減少（校正后的P值小于0.01））。SPEH 組紅蝽菌科等相對豐度顯著高于HFD 組（校正后的P 值小于0.01）。與HFD組相比，CPEH 組Muribaculaceae 和螺桿菌科（Helicobacteraceae）等相對豐度顯著增加（校正后的P值小于0.01），鏈球菌科相對豐度顯著減少（校正后的P 值小于0.01））。以上結果表明紫菜酶解液的干預對高脂飲食小鼠腸道菌群組成影響顯著。

表5 基于ANCOM 分析的科水平上組間顯著差異的腸道細菌Table 5 Differentially abundant taxa at family level between groups identified by ANCOM

采用Selbal 分析，研究高脂飲食和兩種紫菜酶解液顯著調節(jié)的腸道細菌特征。如圖9a 所示，由葡萄球菌科和毛螺菌科組成的整體平衡，準確預測了低脂飲食小鼠和高脂飲食小鼠之間微生物特征的變化（AUC=1.0）。由圖9b 可知，厭氧菌科（Anaerovoracaceae）和鏈球菌科組成的平衡可以解釋復合酶解液調節(jié)的微生物特征。鏈球菌科和厭氧菌科之間的平衡值為正值，較低的平衡值表明CPEH 減少了鏈球菌科的相對豐度。類似的，由消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）和Muribaculaceae 組成的平衡對SPEH 處理具有很高的預測準確性（AUC=0.953，圖9c）。

圖9 紫菜酶解液對高脂飲食小鼠腸道菌群特征的影響Fig.9 Effects of the porphyra enzymatic hydrolysate on gut microbial feature of high fat diet-fed mice

2.8 紫菜酶解液對微生物功能的影響

將16s 測序數(shù)據(jù)與KEGG 數(shù)據(jù)庫比對，對腸道菌群進行功能注釋，進而將菌群功能與宿主代謝相聯(lián)系。利用STAMP 軟件分析組間顯著差異的KEGG 通路，尤其是與脂代謝相關的通路。由圖10a～10c 可知，與LFD 組相比，HFD 組有3 條通路（“脂代謝”“膦酸酯和次膦酸酯代謝”和“甘油酯代謝”）被抑制。此外，紫菜復合酶解液干預顯著上調了“甘油酯代謝”。

值得注意的是，在HFD 組和CPEH 組間具有顯著差異的酶，多與能量代謝、脂代謝等有關。由圖10d～10f 可知，其中3 種酶（K00057“甘油-3-磷酸脫氫酶[EC：1.1.1.94]”，K01755“精氨酸代琥珀酸裂解酶[EC：4.3.2.1]”和K01940“精氨基琥珀酸合酶[EC：6.3.4.5]”）在HFD 組中顯著富集。而與HFD 組相比，CPEH 組中的3 種酶的豐度均顯著降低（P<0.5）。CPEH 干預影響了腸道菌群的功能。

圖10 紫菜酶解液對高脂飲食小鼠腸道菌群功能的影響Fig.10 Effects of the porphyra enzymatic hydrolysate on gut microbial function of high fat diet-fed mice

表6 基于ANCOM 分析的科水平上組間顯著差異的腸道細菌Table 6 Differentially abundant taxa at family level between groups identified by ANCOM

表7 基于ANCOM 分析的科水平上組間顯著差異的腸道細菌Table 7 Differentially abundant taxa at family level between groups identified by ANCOM

綜上，攝入紫菜復合酶解液可以調節(jié)腸道菌群組成，改善腸道細菌脂質代謝功能，從而有助于預防高脂飲食誘導的肥胖。

3 結果與討論

本研究表明，紫菜多糖酶的使用提高了紫菜的酶解利用率，改善了酶解液的黏度和穩(wěn)定性。此外，紫菜復合酶解液可有效預防高脂飲食誘導的肥胖，其機制是在轉錄水平上抑制肝臟脂肪的合成，促進脂肪組織中脂肪水解，進而降低血清脂質水平，減少體脂蓄積。

SCFAs 主要由乙酸組成，可參與調節(jié)宿主代謝調節(jié)，減少脂肪堆積[22]。紫菜復合酶解液提高了糞便中SCFAs（尤其是乙酸和丙酸）的水平。Xu等[23]利用壇紫菜多糖作為唯一碳源培養(yǎng)腸道菌群，發(fā)現(xiàn)腸道菌群可以降解紫菜多糖，從而促進SCFAs 合成。由此推測，與紫菜單一酶解液相比，復合酶解液中含有被降解的多糖，更容易被腸道菌群利用，增加了SCFAs 的產(chǎn)量，從而有助于改善飲食誘導的脂代謝紊亂。

肥胖患者腸道菌群組成會發(fā)生顯著變化[24]。紫菜復合酶解液的干預可以降低高脂飲食小鼠腸道內F/B 比例，或許有助于改善宿主的能量代謝[25]。有研究指出，長期攝入高脂飲食會導致Muribaculaceae 和螺桿菌科豐度降低，而鏈球菌科豐度增加[26]。復合酶解液干預有助于提高Muribaculaceae和螺桿菌科的相對豐度，很可能與飲食誘導肥胖的改善有關[27]。根據(jù)功能預測的結果，紫菜復合酶解液干預可以改善脂代謝相關通路（如“甘油酯代謝”）。Cao 等[28]研究表明“甘油酯代謝”通路與高脂飲食誘導肥胖的發(fā)生密切相關，表明復合酶解液干預可以促進腸道菌群分解、利用脂質。總之，腸道菌群在紫菜復合酶解液改善飲食誘導脂質代謝中發(fā)揮了重要的作用。

4 結論

紫菜復合酶解液干預可以改善腸道菌群結構和組成，調節(jié)與脂質代謝相關的腸道菌群功能，并且預防高脂飲食誘導的肥胖。后續(xù)研究將在復合酶解液的基礎上，添加輔料制備紫菜飲料，并進一步探究其生物活性。