玉米大斑病菌高效原生質(zhì)體的制備方法研究

陳緒遙

（重慶市渝中區(qū)綠化維護(hù)管理處，重慶 400010）

玉米是重要的糧食作物和重要的飼料來源，也是全世界總產(chǎn)量最高的糧食作物，可用作飼料、食物和工業(yè)原料。玉米籽?？梢约庸榫凭?，玉米稈可用于造紙和制墻板，苞葉可作填充材料和草藝編織，玉米穗軸可作燃料，也用來制作工業(yè)溶劑，莖葉除用作牲畜飼料外，還是沼氣池的原料。

我國(guó)自16 世紀(jì)初引入玉米以來，已有近500 年的種植歷史，目前全國(guó)各地都有種植。在我國(guó)，玉米已不再是主要的口糧作物，更重要的是作為發(fā)展畜牧業(yè)的優(yōu)良飼料，也是輕工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)的重要原料，近年來又成為生物質(zhì)能源的重要原料。因此，玉米生產(chǎn)不僅影響到農(nóng)業(yè)，而且影響到社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的許多方面。

1 玉米大斑病簡(jiǎn)介

玉米大斑病是世界玉米生產(chǎn)中發(fā)生普遍和嚴(yán)重的一種葉枯性病害，主要分布于較冷涼的玉米種植區(qū)，多雨和多露年份常引起病害流行，造成嚴(yán)重減產(chǎn)[1]。玉米大斑病菌屬半知菌亞門真菌。大斑病菌分兩種專化型，一種是對(duì)玉米有專化致病性的玉米?；?，一種是對(duì)高粱有專化致病性的高粱?；蚚2]。溫度20～25 ℃、相對(duì)濕度90%以上利于病害發(fā)展。氣溫高于25 ℃或低于15 ℃、相對(duì)濕度小于60%，持續(xù)幾天則病害的發(fā)展會(huì)受到抑制。

玉米大斑病菌稱大斑凸臍蠕孢，屬半知菌亞門真菌。玉米大斑病菌的分生孢子梗自氣孔伸出，單生或2～3 根束生，褐色不分枝，正直或膝曲，基細(xì)胞較大，頂端色淡，有2～8 個(gè)隔膜。分生孢子呈梭形或長(zhǎng)梭形，欖褐色，頂細(xì)胞鈍圓或長(zhǎng)橢圓形，基細(xì)胞尖錐形，有2～7 個(gè)隔膜，臍點(diǎn)明顯，突出于基細(xì)胞外部。有性態(tài)稱為玉米毛球腔菌。自然條件下一般不產(chǎn)生有性世代。成熟的子囊果黑色，橢圓形至球形，外層由黑褐色擬薄壁組織組成。子囊果殼口表皮細(xì)胞產(chǎn)生較多短而剛直、褐色的毛狀物。內(nèi)層膜由較小透明細(xì)胞組成。子囊從子囊腔基部長(zhǎng)出，夾在擬側(cè)絲中間，圓柱形或棍棒形，具短柄。子囊孢子無色透明，老熟呈褐色，紡綞形，多為3 個(gè)隔膜，隔膜處縊縮[3]。

玉米大斑病又稱條斑病、煤紋病、枯葉病、葉斑病等[4]，主要為害玉米的葉片、葉鞘和苞葉。葉片染病先出現(xiàn)水漬狀青灰色斑點(diǎn)，然后沿葉脈向兩端擴(kuò)展，形成邊緣暗褐色、中央淡褐色或青灰色的大斑。后期病斑常縱裂。嚴(yán)重時(shí)病斑融合，葉片變黃枯死。潮濕時(shí)病斑上有大量灰黑色霉層。下部葉片先發(fā)病。在單基因的抗病品種上表現(xiàn)為褪綠病斑，病斑較小，與葉脈平行，色澤黃綠或淡褐色，周圍暗褐色，有些表現(xiàn)為壞死斑。

玉米大斑病的防治應(yīng)以種植抗病品種為主，加強(qiáng)農(nóng)業(yè)防治，輔以必要的藥劑防治[5]。要選擇抗病品種，適期早播，避開病害發(fā)生高峰。施足基肥，增施磷鉀肥。對(duì)于價(jià)值較高的育種材料及豐產(chǎn)田玉米，可在心葉末期到抽雄期或發(fā)病初期噴灑50%多菌靈可濕性粉劑500 倍液或50%甲基硫菌靈可濕性粉劑600 倍液、75%百菌清可濕性粉劑800 倍液、25%苯菌靈乳油800 倍液、40%克瘟散乳油800～1 000 倍液、農(nóng)抗120 水劑200 倍液，隔10 d 噴施1 次，連續(xù)防治2～3 次[6]。

2 材料和方法

2.1 試驗(yàn)材料

供試菌株、質(zhì)粒與培養(yǎng)基分別為玉米大斑病菌、PDA 固體培養(yǎng)基土豆20%（w/v）、葡萄糖1.8%（w/v）、瓊脂1.8%（w/v）。

試劑為纖維素酶、蝸牛酶。

試驗(yàn)儀器為超凈工作臺(tái)、超純水器（MillIPORE，美國(guó)）、立式高速離心機(jī)（Himac CR22F，日本）、低溫臺(tái)式離心機(jī)（SoRVall fresco，德國(guó)）、搖床、恒溫培養(yǎng)箱、移液槍、電子天平、破碎儀、電擊儀等。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 試驗(yàn)菌株單孢菌落的獲取

采用平板培養(yǎng)玉米大斑病菌或者單孢分離方法獲取菌株單孢菌落。常用的單孢分離方法主要有平板稀釋法、眉毛針挑取法、微塊注射法、直接挑取法。

本試驗(yàn)利用玉米大斑病菌試驗(yàn)株的玉米大斑病葉，將病葉上的病斑剪下，再剪成邊長(zhǎng)為1 cm 的正方形，以便培養(yǎng)。

將剪成的正方形病斑葉片放入盛有75%酒精的燒杯中消毒，重復(fù)3 次，最后用無菌水沖洗1 次，將洗好的病葉放入干凈培養(yǎng)皿中備用。

配制PDA 培養(yǎng)基，稱取200 g 去皮洗凈的土豆，切成正方體小塊，取600 mL 蒸餾水倒入鍋中，將切好的土豆放入鍋中，將土豆塊煮到熟而不爛的程度，注意在此過程中一定要小心，不要黏鍋，隨時(shí)用玻璃棒攪拌，必要時(shí)候加入少許蒸餾水以防黏鍋。煮好后過濾，將土豆濾除，加入10 g 葡萄糖，定容至1 000 mL，分裝至4 個(gè)錐形瓶中，封口，滅菌備用。將玉米大斑病菌放入PDA培養(yǎng)基中逐步分離純化，即得到玉米大斑病菌的單孢子，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 載體制備

單孢分離之前，制作孢子載體用于試驗(yàn)。操作方法：將水瓊脂培養(yǎng)基倒入直徑為65 mm 的干凈滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，控制培養(yǎng)基厚度在1～2 mm 為最佳；待培養(yǎng)基凝固后，用已消毒的潔凈小手術(shù)刀將已經(jīng)倒入培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基劃分成寬度相等的3 條帶，挑出一條置于載玻片上備用。

2.2.3 孢子選取

如果病葉上的孢子較多，可直接將病葉在距離孢子載體上方大約10 cm 的高度輕輕用手敲打葉片，使病葉上的玉米大斑病菌孢散落在孢子載體上。

如果葉片上的孢子不是很多，用病葉輕輕地在孢子載體上擦拭，然后將載體轉(zhuǎn)移到4 倍顯微鏡觀察是否為單孢子，如不是，用已滅菌的干凈涂布器蘸取少許無菌水從孢子載體的一端向另一端輕輕涂布，直到在4 倍顯微鏡下觀察到一個(gè)個(gè)單孢子為止。

2.2.4 蘸取單孢

將挑孢針燒紅，待針頭超微冷卻下來，右手拿挑孢針在顯微鏡頭下輕輕用針頭接近孢子載體，慢慢移動(dòng)，直到在鏡頭下看不到單孢子的存在，便成功地挑取了單孢子。

2.2.5 轉(zhuǎn)移單孢

提前在直徑為90 mm 的PDA 培養(yǎng)皿（加入適量硫酸鏈霉素）上用黑色記號(hào)筆做出4 個(gè)標(biāo)記，將實(shí)驗(yàn)室自制的挑孢針針尖在一個(gè)標(biāo)記處輕輕劃動(dòng)4～5 次，將孢子轉(zhuǎn)移出來。用相同的方法在另外3 個(gè)培養(yǎng)皿的標(biāo)記處接種，然后用封口膜將培養(yǎng)皿封存保護(hù)好，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為26 ℃。

2.2.6 轉(zhuǎn)移大斑病菌菌落

在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)了4 d 之后，得到玉米大斑病菌的單株菌落。在1～4 個(gè)培養(yǎng)基中，2 號(hào)菌株長(zhǎng)勢(shì)最好，故選擇2 號(hào)培養(yǎng)基中的菌株，將其轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)基中，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.7 配制滲透壓穩(wěn)定劑

STC 溶液：含有1.2 mol/L 山梨醇、0.01 mol/L Tris、0.05 mol/L CaCl2，調(diào)整pH 值為7.5。

NaCl 溶液：0.3 mol/L、0.5 mol/L、0.7 mol/L、1.0 mol/L、1.2 mol/L。

甘露醇溶液濃度：0.3 mol/L、0.4 mol/L、0.5 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/L。

MgSO4溶液濃度：0.3 mol/L、0.5 mol/L、0.7 mol/L、0.9 mol/L，用0.02 mol/L 磷酸緩沖液配制而成。

山梨醇溶液濃度：0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/L、1.2 mol/L、1.4 mol/L。

以上溶液均用去離子水配制。

2.2.8 單孢子菌株的獲得

玉米大斑病菌在25 ℃下活化3 d，用調(diào)針挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的一部分菌體接入至150 mL PD 液體培養(yǎng)基中，放入25 ℃的真菌專用搖床中，將搖床的速度設(shè)定為150 r/min，培養(yǎng)6 d 之后取出。經(jīng)歷5 次重復(fù)后，得到性狀穩(wěn)定的單孢子菌株。

2.2.9 裂解玉米大斑病菌的細(xì)胞壁

裂解酶為纖維素酶、蝸牛酶。

將實(shí)驗(yàn)室制備好的供試玉米大斑病菌的供試菌株接種于5 mL 的PD 液體培養(yǎng)基中，在25 ℃溫度下放入搖床（200 r/min）中振蕩培養(yǎng)24 h。取出菌體切斷菌體并將其轉(zhuǎn)接于50 mL 液體培養(yǎng)基中繼續(xù)在搖床中再次振蕩培養(yǎng)24 h，離心收集菌體。加入滅菌的滲透壓穩(wěn)定劑，再用無菌水沖洗兩次。在離心之前，本試驗(yàn)用50 目尼龍篩過濾后收集菌體。無菌水洗滌2～3 次，試驗(yàn)采用的是離心洗滌，將速度和時(shí)間分別設(shè)定為8 000 r/min、10 min。稱取已經(jīng)制備好的純化1 g 玉米大斑病菌菌體，輕輕移入無菌試管離心管組織勻漿器中緩慢研磨。磨碎后離心，速度和時(shí)間分別設(shè)定為5 000 r/min、10 min。將菌體的下層的沉淀物轉(zhuǎn)移至5 mL 刻度離心管中，加入2 mL 裂解酶及適量滲透穩(wěn)定劑，靜置酶解。記錄數(shù)據(jù)，便于以后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。將菌體溶于兩倍體積的滲透壓穩(wěn)定劑中，加入細(xì)胞壁降解酶或細(xì)胞壁降解酶組合，使其終濃度分別為10 mg/mL、20 mg/mL和40 mg/mL。置于28 ℃振蕩酶解3 h 后，用20 mm 孔徑的濾膜過濾經(jīng)酶解處理菌體，取濾液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算原生質(zhì)體的濃度。

3 結(jié)果與分析

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，可以得出不同濃度的組合酶對(duì)原生質(zhì)體形成的作用效果不同的結(jié)論。分別觀察用5 mg/mL 纖維素酶+5 mg/mL 蝸牛酶、10 mg/mL 纖維素酶+10 mg/mL 蝸牛酶、20 mg/mL 纖維素酶+20 mg/mL蝸牛酶、30 mg/mL 纖維素酶+30 mg/mL 蝸牛酶處理的玉米大斑病菌原生質(zhì)體在電鏡下的狀態(tài)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在26 ℃下，以20 mg/mL 纖維素酶+20 mg/mL 蝸牛酶組成的混合酶酶解3 h。試驗(yàn)從菌體菌齡、溫度、酶解時(shí)間、酶的種類及濃度、滲透壓穩(wěn)定劑及濃度的影響，對(duì)玉米大斑病菌高效原生質(zhì)體產(chǎn)出的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。20 mg/mL 纖維素酶和20 mg/mL 蝸牛酶的組合酶，在26 ℃時(shí)利用CM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，可以得到數(shù)量級(jí)為1×106的玉米大斑病菌高效原生質(zhì)體。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，以0.8 mol/L 甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑，加入20 mg/mL 纖維素酶+20 mg/mL 蝸牛酶的混合酶，有助于裂解酶裂解細(xì)胞壁。

4 結(jié)論與討論

4.1 酶的種類及濃度對(duì)于產(chǎn)出玉米大斑病菌原生質(zhì)體的影響

26 ℃條件下，以0.8 mol/L 甘露醇作為滲穩(wěn)劑，選用纖維素酶、蝸牛酶兩種酶的等量混合物來檢測(cè)檢驗(yàn)不同生物酶系統(tǒng)對(duì)玉米大斑病菌高效原生質(zhì)體產(chǎn)出率高低的影響。裂解酶種類及濃度與產(chǎn)出的玉米大斑病菌的高效原生質(zhì)體個(gè)數(shù)情況如下：5 mg/mL 纖維素酶+5 mg/mL蝸牛酶產(chǎn)生的高效原生質(zhì)體數(shù)量為6.7×106個(gè)，10 mg/mL 纖維素酶+10 mg/mL 蝸牛酶產(chǎn)生的高效原生質(zhì)體的數(shù)量為7.0×106個(gè)，20mg/mL纖維素酶+20mg/mL蝸牛酶產(chǎn)生的高效原生質(zhì)體的數(shù)量為7.4×106個(gè)，30 mg/mL 纖維素酶+30 mg/mL 蝸牛酶產(chǎn)生的高效原生質(zhì)體的數(shù)量為6.0×106個(gè)。

4.2 不同培養(yǎng)基對(duì)于原生質(zhì)體培養(yǎng)效果的影響

培養(yǎng)基影響原生質(zhì)體的分離效率。依次列出不同的酶組合在不同培養(yǎng)基下的數(shù)據(jù)結(jié)果：5 mg/mL 纖維素酶+5 mg/mL 蝸牛酶分離效率為48%，10 mg/mL 纖維素酶+10 mg/mL 蝸牛酶分離效率為56%，20 mg/mL 纖維素酶+20 mg/mL 蝸牛酶分離效率為50%，30 mg/mL纖維素酶+30 mg/mL 蝸牛酶分離效率為54%。

4.3 酶解時(shí)間對(duì)于玉米大斑病菌高效原生質(zhì)體產(chǎn)出的影響

纖維素酶和蝸牛酶的混合酶溶液在26 ℃條件下處理玉米大斑病原體細(xì)菌，酶解時(shí)間對(duì)等離子體系統(tǒng)效應(yīng)在1～2 h 觀察玉米大菌斑的細(xì)菌原生質(zhì)體數(shù)量變化不顯著；從3 h 開始，原生質(zhì)體突然達(dá)到大約1×106數(shù)量級(jí)，然后逐漸趨于穩(wěn)定；4～7 h 玉米大菌斑的細(xì)菌原生質(zhì)體數(shù)量一直保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)；7 h 后觀察可見原生質(zhì)體已經(jīng)開始逐漸萎縮，逐步減少數(shù)量，顯示大菌斑細(xì)菌原生質(zhì)體的玉米已經(jīng)開始死亡。因此，最適酶解時(shí)間為3 h。

4.4 溫度對(duì)各種酶以及組合酶影響的比較

用20 mg/mL 纖維素酶和20 mg/mL 蝸牛酶的組合的混合酶液試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)置了4 個(gè)溫度梯度，即23 ℃、26 ℃、33 ℃、37 ℃。數(shù)據(jù)表明，23 ℃時(shí)，原生質(zhì)體的數(shù)量級(jí)為1×102；26 ℃時(shí)達(dá)到高峰，為1×106；33 ℃時(shí)逐漸下降，為1×104；37 ℃時(shí)開始凋亡，又回到1×103。

4.5 滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)于高效原生質(zhì)體制備的影響

分別選擇不同的濃度梯度（STC）解決方案和氯化鈉溶液、甘露醇、山梨醇溶液和MgSO4+磷酸緩沖溶液、滲透壓穩(wěn)定劑在26 ℃和20 mg/mL 纖維素酶+20 mg/mL蝸牛酶的混合酶處理細(xì)菌。分析比較不同滲透壓穩(wěn)定劑的原生質(zhì)體產(chǎn)量和尺寸，0.8 mol/L 甘露醇作穩(wěn)定劑產(chǎn)生的原生質(zhì)體數(shù)量最大、質(zhì)量最好，能夠達(dá)到1×106數(shù)量級(jí)。

4.6 對(duì)菌齡的調(diào)查研究

菌齡長(zhǎng)短是影響原生質(zhì)體產(chǎn)生時(shí)間的關(guān)鍵因素。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，菌體較為幼嫩有利于原生質(zhì)體的釋放，如果玉米大斑病菌的菌體培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞老化不易被酶解，從而導(dǎo)致試驗(yàn)失??；時(shí)間過短則菌體量不夠，也不是制備玉米大斑病菌的原生質(zhì)體的最佳時(shí)間。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，如果純化得到的菌體量過少，在試驗(yàn)中菌體研磨程度不好，會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。

4.7 結(jié)論分析

本試驗(yàn)表明，在26 ℃條件下，以20 mg/mL 纖維素酶和20 mg/mL 蝸牛酶的組合混合酶液處理玉米大斑病菌，利用0.8 mol/L 甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑在CM培養(yǎng)基下酶解3 h，將高效得到玉米大斑病菌的原生質(zhì)體。