中西藥聯(lián)合應(yīng)用對銅綠假單胞菌抗菌作用的研究進(jìn)展①

(桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541199)

銅綠假單胞菌是一種常見的院內(nèi)感染條件致病菌。近年來，由于抗生素的不規(guī)范使用等原因，造成銅綠假單胞菌的耐藥現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，多重耐藥和泛耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，給臨床治療工作帶來了極大的困難。

我國中草藥資源豐富，使用歷史悠久，具有相對可靠的使用安全性。由于清熱解毒類中草藥成分特殊、復(fù)雜，抗菌作用和機(jī)制原理不單一，所以很少發(fā)現(xiàn)其耐藥性，但存在抑菌作用有限、抑菌效果不穩(wěn)定、抑菌機(jī)制不清楚等問題。中西藥的使用各有優(yōu)缺點(diǎn)，而中西藥物合用則可以優(yōu)勢互補(bǔ)，所以中草藥和抗生素的聯(lián)合應(yīng)用具有廣闊的研究空間和開發(fā)前景。

1 銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制

1.1 基因突變改變通道蛋白和外膜通透性

Pa菌株細(xì)胞膜上的通道蛋白相對較少，孔徑狹窄，通透性差，多數(shù)抗菌物質(zhì)難以進(jìn)入菌體，使其天然對多種抗生素耐藥。oprD2 是細(xì)胞膜上容許亞胺培南通過的通道蛋白。oprD2 編碼基因的缺失突變，改變通道蛋白結(jié)構(gòu)，使 Pa 對亞胺培南耐藥[1]。

1.2 菌株酶類改變抗生素活性結(jié)構(gòu)

耐藥Pa菌株能通過編碼多種水解酶類和修飾性酶類而破壞或修改抗生素的活性結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)耐藥。相關(guān)酶類的編碼基因可由 Pa基因組攜帶，也可通過質(zhì)?；蛘献荧@得。耐藥 Pa 菌株通過編碼多種β-內(nèi)酰胺酶基因而對多種β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，當(dāng)前被編碼的β-內(nèi)酰胺酶類基因主要有以下幾種。①頭孢菌素酶(AmpC)基因：位于所有的 Pa 菌株染色體上，低水平表達(dá)，在β-內(nèi)酰胺類抗生素的誘導(dǎo)下，表達(dá)水平激增[2]；其他多種類型的 AmpC 酶也可由質(zhì)粒編碼，實(shí)現(xiàn)對大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素的天然耐藥[3]。②超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extend-spectrum β-lactamases， ESBLs)基因：部分耐藥Pa 菌株可由基因組編碼，也可由質(zhì)粒編碼，水解青霉素類、窄譜和超廣譜頭孢菌素[4]。③金屬β-內(nèi)酰胺酶基因(metallo-β-lactamases， MBL)：MBL依賴金屬離子發(fā)揮活性，編碼基因可由耐藥菌株染色體攜帶，也可由質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子攜帶，可對碳青霉烯類抗生素、大部分β-內(nèi)酰胺類抗生素和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類抗生素耐藥。MBL 類型多樣，是多重耐藥耐藥 Pa 菌株出現(xiàn)的原因之一[5-6]。耐藥Pa菌株編碼的修飾性酶類主要是氨基糖苷類修飾酶，耐藥Pa菌株通過編碼氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶(aminoglycoside acetyltransferase， AAC)、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(aminoglycoside phosphate transferase， APH)和氨基糖苷核苷轉(zhuǎn)移酶(aminoglycoside nucleoside transferase， ANT)對進(jìn)入菌內(nèi)的氨基糖苷類抗生素進(jìn)行修飾，使其失活。AME(aminoglycoside modifying enzymes， AME)編碼基因廣泛存在于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子都元件中，可在細(xì)菌種內(nèi)和種間傳播[7]。

1.3 基因突變或編碼酶類改變藥物作用靶位

細(xì)菌細(xì)胞膜上的青霉素結(jié)合蛋白(penicillin binding protein， PBPs)參與細(xì)胞壁肽聚糖的合成，也是β-內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶位。β-內(nèi)酰胺類抗生素與 PBP 結(jié)合，使細(xì)胞壁合成受阻，進(jìn)而使細(xì)菌死亡。Pa菌株的 PBP 基因發(fā)生基因突變，改變 PBP 蛋白結(jié)構(gòu)，降低或消除其與β-內(nèi)酰胺類抗生素的親和力，使其對該類抗生素耐藥。拓?fù)洚悩?gòu)酶的相關(guān)基因突變也可以改變拓?fù)洚悩?gòu)酶結(jié)構(gòu)，使 Pa 菌株對喹諾酮類抗生素耐藥[8-9]。

1.4 過度表達(dá)外排泵相關(guān)基因

外排泵是位于Pa菌株細(xì)胞膜上的質(zhì)子泵，能夠選擇性地把進(jìn)入菌體內(nèi)部的抗生素排出。一個(gè)外排泵一般由3種蛋白質(zhì)組成。①膜外通道蛋白：形成通道門，用于排出藥物。②通道蛋白：連接膜內(nèi)、外蛋白，形成通道。③膜內(nèi)蛋白：識(shí)別藥物，并把它轉(zhuǎn)運(yùn)出菌體。這3種蛋白質(zhì)共同作用發(fā)揮外排作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 13 種外排系統(tǒng)，不同的外排的外排泵系統(tǒng)，識(shí)別和外排的抗生素底物有一定的特異性[10-12]。

1.5 形成生物被膜

生物被膜(biofilm)是細(xì)菌及其分泌的胞外多糖和胞外蛋白組成的混合物，使其覆蓋在物體或機(jī)體腔道表面，形成膜狀結(jié)構(gòu)。生物膜是細(xì)菌耐藥的機(jī)制復(fù)雜。生物膜里的藻酸鹽多糖能夠抵御抗菌藥物的滲透，使抗菌藥物難以接觸菌體。生物膜含有的多種酶類也能夠使多種抗生素失活，使 Pa菌株對相應(yīng)抗生素耐藥[13]。

1.6 整合子

整合子是一種類似于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子的可移動(dòng)遺傳單位。在Pa菌株耐藥基因的獲得和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。同質(zhì)粒不同，整合子能通過攜帶的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，使整合酶從周圍環(huán)境中捕獲耐藥基因盒，并把它們組裝在一起，形成巨大的耐藥基因多基因座，使細(xì)菌具有多重耐藥性，并在細(xì)菌種內(nèi)和種間傳播、擴(kuò)散[14]。

2 中草藥對銅綠假單胞菌的抑制作用

抗生素大量使用之前，中草藥資源，特別是清熱解毒類中草藥在抗感染治療中曾發(fā)揮重要作用。耐藥菌大量出現(xiàn)，抗生素不斷面臨新挑戰(zhàn)，提醒科研人員使用現(xiàn)代科學(xué)方法篩選、 驗(yàn)證傳統(tǒng)藥用植物的抗菌效果，嘗試尋找新型抗生素。臨床感染中，革蘭陽性的金黃色葡萄球菌和革蘭陰性的大腸埃希菌最為常見，銅綠假單胞菌耐藥現(xiàn)象普遍。在藥用植物抑菌作用的篩選和驗(yàn)證中，它們是最常用的實(shí)驗(yàn)對象。

綜合前人研究[15-22]，在傳統(tǒng)藥用植物中，至少在黃連、黃芩、黃柏、夏枯草、連翹、金銀花、大黃、苦參、虎杖和薄荷等 50 多種中藥中發(fā)現(xiàn)對銅綠假單胞菌的抑菌作用。雖然很多中草藥對銅綠假單胞菌有抑菌作用，但中草藥對銅綠假單胞菌的抑制作用還存在很多缺陷，主要表現(xiàn)在以下兩個(gè)方面。

(1)中草藥成分復(fù)雜，抗菌機(jī)制不單一。研究中，一種藥材抑菌作用的有無對研究人員的實(shí)驗(yàn)方法和使用菌株有明顯的依賴性。①實(shí)驗(yàn)方法依賴性：藥材有效成分的萃取，通常有水煎法和醇提法，研究中出現(xiàn)水煎法提取物有效、醇提法提取物有效、水煎法和醇提法的提取物均有效、兩種方法的提取物均無效等4 種情況。乙醇提取法中，不同的乙醇濃度也會(huì)影響提取物的有效性，K-B法或和稀釋法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)不一致。②實(shí)驗(yàn)菌株的依賴性：在不同的研究中，當(dāng)實(shí)驗(yàn)菌株較少時(shí)，同種藥材用同種方法萃取有效成分，在不同的實(shí)驗(yàn)中，有效性截然不同。當(dāng)實(shí)驗(yàn)菌株數(shù)量較多時(shí)，抑菌效果從完全無效到效果明顯，效果跨度很大。以上現(xiàn)象都顯示對不同的實(shí)驗(yàn)菌株，某一藥材的具體有效成分和作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制可能不盡相同，這可能是造成抑菌效果不穩(wěn)定，抑菌機(jī)制不清楚的原因。

(2)中草藥有效成分含量低，血藥濃度難以達(dá)到。同現(xiàn)有抗生素相比，有效成分的有效性往往偏低，這造成抑菌效果相對有限。根據(jù)有效抑菌濃度，結(jié)合人體體液含量和提取方法濃縮比例，推算達(dá)到有效血藥濃度時(shí)，所需的中藥原藥量往往較大，在臨床上難以實(shí)現(xiàn)[15]。

3 中藥和抗生素的聯(lián)合應(yīng)用對銅綠假單胞菌的抗菌作用

銅綠假單胞菌的耐藥現(xiàn)象愈發(fā)嚴(yán)重以及中草藥抗菌效果相對有限等問題促使人們考慮二者的聯(lián)合使用，以達(dá)到優(yōu)勢互補(bǔ)作用。徐海瑛等[23]發(fā)現(xiàn)雙黃連口服液聯(lián)用慶大霉素對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌藥敏結(jié)果均呈相加作用；王淋荊等[24]的研究發(fā)現(xiàn)黃芩、金銀花和夏枯草可以通過促進(jìn)外排泵基因表達(dá)而使環(huán)丙沙星對銅綠假單胞菌有拮抗作用，穿心蓮和五倍子也能促使慶大霉素對銅綠假單胞菌表現(xiàn)出拮抗作用；胡芳等[25]將雙黃連粉針與青霉素等多種抗生素聯(lián)用作用于非耐藥菌，使雙黃連對細(xì)菌的MIC 下降了?？股氐?MIC 下降，說明中西藥聯(lián)合應(yīng)用對銅綠假單胞菌有明顯的協(xié)同抑菌作用。

由于細(xì)菌基因型和中藥成分的多樣性，使得中草藥和抗生素的聯(lián)合應(yīng)用效果在不同的細(xì)菌感染中，甚至在同種細(xì)菌不同菌株的感染中呈現(xiàn)的相互作用類型也不一致。中草藥和抗生素的聯(lián)用機(jī)制尚需很多更深層次的研究，而尋找能對細(xì)菌共有靶點(diǎn)起拮抗作用的有效成分非常必要，是保證中草藥抑菌效果穩(wěn)定性的基礎(chǔ)。

中藥和抗生素的協(xié)同抑菌作用，以及耐藥菌株經(jīng)中藥處理后能恢復(fù)對相應(yīng)抗生素的敏感性，表明中藥在某種程度上具有逆轉(zhuǎn)耐藥菌抗性的能力。其逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性機(jī)制有以下幾點(diǎn)。①消除耐藥質(zhì)粒：耐藥質(zhì)粒通常攜帶多種耐藥基因，賦予了細(xì)菌多重耐藥性，可以在細(xì)菌種內(nèi)和種間穿梭，也可以被物理方法、化學(xué)試劑生物學(xué)手段從細(xì)菌內(nèi)部清除。據(jù)研究，黃連、白花丹、白頭翁、黃芩、金銀花、大黃、馬齒莧、車前子、黃白等都有不同程度的質(zhì)粒消除作用[26-27]。②抑制耐藥相關(guān)基因表達(dá)：蔣文捷等研究證明，黃芩提取物可以降低 16SrRNA 甲基化酶 mRNA 轉(zhuǎn)錄，提高耐藥菌對抗菌藥物的敏感性[28]；穿心蓮內(nèi)酯對 PA 外排泵 MexAB-OprM 轉(zhuǎn)錄表達(dá)具有抑制作用， 可扭轉(zhuǎn) PA 的部分耐藥性[29]。③降低耐藥相關(guān)酶活性：高潔等研究發(fā)現(xiàn)芪歸銀方能減慢β-內(nèi)酰胺酶水解速率，提示芪歸銀方可能是通過抑制銅綠假單胞菌的β-內(nèi)酰胺酶的水解活性實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)其對亞胺培南的耐藥性，雙黃連注射液在體外對β-內(nèi)酰胺酶存在抑制作用[30]。這顯示中草藥可能通過抑制相關(guān)酶活性在一定程度非徹底地實(shí)現(xiàn)耐藥性逆轉(zhuǎn)。④抑制生物膜合成：董必英等發(fā)現(xiàn)黃芩苷能破壞銅綠假單胞菌已形成的生物膜，與頭孢哌酮-舒巴坦鈉聯(lián)用時(shí)能顯著増強(qiáng)其對銅綠假單胞菌生物被膜的殺菌作用[31]。

4 結(jié)語

由于抗生素的濫用，使得細(xì)菌的耐藥現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，特別是耐碳青霉烯銅綠假單胞菌的耐藥性現(xiàn)已成為臨床上亟需解決的難題，它常導(dǎo)致臨床治療困難。當(dāng)前中草藥的藥用價(jià)值是亟待深入研究和開發(fā)的寶貴資源。不少種類的中草藥，特別是清熱解毒類中藥在臨床具有明顯的抗炎和清熱解毒效果，應(yīng)列為優(yōu)先研究和開發(fā)對象。 黃芩、雙黃連不但對銅綠假單胞菌有抑菌作用，對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌都有一定的抑菌作用。黃芩、雙黃連與頭孢哌酮-舒巴坦鈉聯(lián)用對銅綠假單胞菌的抑菌效果目前尚未見報(bào)道，本研究擬將黃芩、雙黃連與頭孢哌酮-舒巴坦鈉等藥物聯(lián)用將為臨床治療耐藥菌和開發(fā)新的抗耐藥菌藥物提供實(shí)驗(yàn)參考，同時(shí)為臨床治療銅綠假單胞菌引起的感染提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)，具有一定的理論指導(dǎo)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。