角膜新生血管治療研究進展

王 舒，丁芝祥

(桂林醫(yī)學院，廣西 桂林 541199)

在正常生理條件下，角膜在光學上是透明的，由于炎癥、創(chuàng)傷、營養(yǎng)不良或先天性異常等原因，影響角膜的透明度，從而影響視力。正常情況下，角膜在促血管生成和抗血管生成因子之間保持動態(tài)平衡，使其在正常的穩(wěn)態(tài)條件下保持無血管[1]。在病理情況下，毛細血管超越角膜緣進入角膜透明區(qū)，角膜的“血管赦免”狀態(tài)被打破，使角膜產(chǎn)生新生血管[2]。角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)是一種常見的病理改變，它可在角膜移植、角膜炎、佩戴角膜接觸鏡等不同的臨床背景下發(fā)生，通過破壞角膜免疫赦免加劇炎癥反應，進而損害視功能[3]。Chen等[4]的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，CNV致盲率高達57.4%。因此，CNV的治療一直受到國內(nèi)外學者的關注，是一個亟待解決的難題。目前，隨著大量研究的開展，CNV的治療研究已取得很大的進展。本文主要圍繞CNV的發(fā)病機制及治療最新進展進行綜述。

1 角膜新生血管的形成機制

角膜新生血管的發(fā)生是一個復雜的過程，其具體的發(fā)生機制尚不明確，目前的研究表明角膜新生血管的發(fā)生可能與炎癥性疾病、角膜移植物排斥反應以及角膜接觸鏡相關的缺氧、堿燒傷、基質(zhì)潰瘍、無虹膜和角膜緣干細胞缺乏等疾病有關[1]。

1.1 角膜新生血管形成的病理生理學

角膜新生血管由纖維結(jié)締組織網(wǎng)絡(由纖維蛋白、纖維連接蛋白和其他結(jié)締組織成分組成)支持。血管形成早期表現(xiàn)出不穩(wěn)定性和滲漏性，它缺乏周細胞、平滑肌細胞、血管內(nèi)皮細胞之間的緊密連接以及與細胞外基質(zhì)的穩(wěn)定結(jié)合，而這種緊密連接與穩(wěn)定結(jié)合恰恰是成熟血管的特征。如果促血管生成因子在新生血管中不再占優(yōu)勢，那么正常的穩(wěn)態(tài)就會得以重建，這些新生成的血管就有可能會退縮。然而，在存在慢性炎癥的情況下，早期的CNV可以成為永久性的。發(fā)展中的CNV侵蝕血管生成和相對免疫原性的赦免區(qū)，加劇和擴大引發(fā)CNV的炎癥。因此，即使是低水平的慢性、未查出的角膜或角膜旁炎癥也可能導致嚴重的CNV。

1.2 角膜新生血管相關細胞因子

目前認為角膜新生血管形成的主要原因有缺氧、炎癥等。缺氧使組織產(chǎn)生和釋放大量新生血管形成因子，從而刺激 CNV 形成。炎癥在新生血管的形成中起著直接或間接作用，在炎性角膜組織損傷后，多種細胞類型(包括角膜上皮細胞和內(nèi)皮細胞、角膜基質(zhì)細胞、免疫細胞如T細胞和巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞)會釋放大量促血管生成細胞因子[5]。

研究發(fā)現(xiàn)，促新生血管形成的因子很多，主要有血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor， EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，MMPs)等。其中，VEGF是目前公認的在眾多血管調(diào)控因子中功能最強的促血管形成因子，也是內(nèi)源性角膜血管生長因子之一，是CNV形成過程中的關鍵血管因子[6]。

抗新生血管形成因子大多為促新生血管形成因子的拮抗劑，包括內(nèi)皮抑素(endostatin)、色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor， PEDF)、凝血酶敏感蛋白(thrombospondins)、組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases， TIMPs)等。其中，內(nèi)皮抑素是作用最強、效果最好的血管生成抑制劑，它能特異性抑制血管內(nèi)皮細胞在bFGF 誘導下的增殖和遷移，促進內(nèi)皮細胞凋亡。而TIMPs則是MMPs的特異性抑制劑，它以共價鍵的形式與MMPs結(jié)合成為復合體，從而抑制MMPs的活性。

生理情況下，正常角膜組織的促血管生成因子和抗血管生成因子之間保持動態(tài)平衡， 病理狀態(tài)下，二者之間的平衡狀態(tài)被打破，從而導致CNV。

1.3 角膜新生血管形成相關信號通路

角膜新生血管形成相關信號通路復雜多樣，已有一些研究通過特異性調(diào)控其信號通路用于角膜新生血管的治療，取得了一些進展。

1.3.1 VEGFR2(VEGF受體2，VEGF receptor 2)/STAT3信號通路VEGFR2(VEGF受體2，VEGF receptor 2)/STAT3信號通路是血管生成中非常重要的一個信號通路，STAT3是一種轉(zhuǎn)錄因子，可被多種細胞因子和生長因子激活。激活后，STAT3易位入核，調(diào)控凋亡、增殖、遷移及核內(nèi)相關基因的表達[7]。在腫瘤血管內(nèi)皮細胞中，VEGFR2通過上調(diào)STAT3，導致STAT3移位進入細胞核，導致腫瘤血管生成[8]。Shen等[9]通過研究發(fā)現(xiàn)，黃嘌呤通過下調(diào)VEGFR2的表達水平抑制STAT3的核定位和蛋白磷酸化，抑制下游PI3K/Akt信號通路的激活，從而抑制堿燒傷誘導的大鼠角膜新生血管的形成。

1.3.2 Notch信號通路 Notch信號通路是通過調(diào)控細胞增殖和分化影響細胞命運的重要信號轉(zhuǎn)導通路[10]。Notch配體和受體在內(nèi)皮細胞中表達，其中Notch 1受體和DLL4配體在促進血管生成中起基礎性作用。葛秩睿[11]的研究表明，在堿燒傷誘導的大鼠角膜新生血管模型中，Notch1/DLL4信號通路在角膜新生血管的形成階段高度表達，且特異性抑制DLL4后成功阻斷了Notch信號在角膜新生血管中的表達。

1.3.3 p38信號通路 p38是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的一個亞族，因其分子量為38kd而得名，p38信號轉(zhuǎn)導通路是MAPK信號系統(tǒng)的重要分支。p38信號通路在炎癥反應中起著重要作用[12]，而炎癥因素在新生血管形成中又起著重要作用。p38在許多組織中均有表達，MAPK激酶通過雙重磷酸化激活p38，活化后的p38進入細胞核，激活多種蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生生物學效應[13]。張海峰[14]通過角膜縫線法建立大鼠角膜新生血管模型，檢測p38的表達從而證實p38信號轉(zhuǎn)導通路參與調(diào)控大鼠CNV生長。

2 角膜新生血管的治療

原則上，促血管生成因子或抗血管生成因子均可作為預防和治療CNV的治療靶點。目前CNV的治療主要包括藥物治療和手術(shù)治療，藥物包括有抗VEGF藥物(如雷珠單抗、康柏西普、貝伐單抗等)、類固醇激素、非甾體抗炎藥、免疫抑制劑、普萘洛爾等，手術(shù)治療主要有細針透熱療法(FND)、激光治療、光動力療法(PDT)、角膜緣干細胞移植等。

無血管角膜移植手術(shù)可能是治療CNV最顯著的方法，雖然原則上角膜移植可以在CNV病例中恢復一個清晰的中心視軸，但由于CNV存在的高排斥風險，以及CNV在移植物邊緣迅速侵入新組織的風險，角膜移植的臨床應用可能受限。在血管系統(tǒng)相對成熟的情況下，藥物療法可能無效，可以考慮激光物理消融術(shù)、細針透熱療法或光動力療法(PDT)。研究發(fā)現(xiàn)，上述這些技術(shù)本身就是破壞性的，存在對周圍角膜和角膜緣干細胞造成附帶損害的風險。

與手術(shù)治療相比，藥物治療更方便，副作用更少，更容易被患者接受。外用類固醇藥物通常是局部制劑，幾十年來一直是CNV治療的中流砥柱，它通過阻止血管內(nèi)皮細胞和包括巨噬細胞在內(nèi)的炎癥細胞的激活、遷移和招募來抑制CNV。類固醇還可能通過抑制血管平滑肌細胞VEGF的表達而具有直接的抗血管生成作用，并可能抑制VEGF信號的下游效應，目前仍是臨床治療CNV的首選藥物。但由于其存在眼壓升高、引發(fā)白內(nèi)障等不良副作用，不宜長期服用。因此，需要探索效果更好、不良反應更少的角膜新生血管治療方法。

2.1 基因靶向治療

基因治療是指利用病毒和非病毒載體將目的基因轉(zhuǎn)移到細胞中，以糾正細胞功能障礙或恢復細胞功能。角膜獨特的解剖位置和相對的免疫特權(quán)，使其成為基因治療的理想組織[15]?；虔煼ㄖ委烠NV可以通過抗血管生成因子的轉(zhuǎn)基因表達或通過基因沉默使促血管生成因子失活來實現(xiàn)[16]。腺相關病毒(adeno-associated viral， AAV)載體介導具有抗血管生成作用的基因，如內(nèi)皮抑制素和血管抑制素，轉(zhuǎn)染角膜上皮細胞，在兔角膜新生血管模型中成功降低了CNV的發(fā)生及生長。Chen等[17]的研究表明，通過結(jié)膜下注射重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導的mEndo和msFlk-1基因能有效抑制小鼠堿燒傷引起的角膜新生血管。Liu等[18]發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，基質(zhì)內(nèi)傳遞針對人類VEGF基因唯一相同序列的siRNA可抑制55.7%角膜中VEGF的表達，69.5%白細胞浸潤以及CNV形成。Han等[19]進一步證明了以可還原支化聚乙烯亞胺(rBPEI)為基礎的納米顆粒系統(tǒng)作為一種新的siRNA載體有望用于治療CNV。盡管大量的研究表明基因治療能有效治療角膜新生血管，但其尚存在安全性、可控性、復雜性、低效及倫理等問題。

2.2 熱敏水凝膠治療

在過去的幾十年里，各種聚合物載體被廣泛用于持續(xù)和控制藥物的遞送。接觸鏡、植入物、聚合物納米顆粒、脂質(zhì)體、樹狀大分子和水凝膠在眼部用藥方式引起了廣泛關注。Xu等[20]的研究結(jié)果表明，Ava-PECE(avastin-poly-ethyleneglycol-poly-?-caprolactone-poly-ethyleneglycol)水凝膠的應用可明顯降低縫線誘導的兔角膜新生血管的生長。因此，Ava-PECE水凝膠作為一個持續(xù)的藥物傳遞系統(tǒng)可能是一個有前途的治療角膜新生血管的載體。Liu等[21]的研究中，以聚D， l -乳酸-乙醇酸-聚乙二醇-聚D， l -乳酸-乙醇酸(PLGA-PEG-PLGA)共聚物為藥物傳遞載體，分別在體外和體內(nèi)證明了可生物降解的熱敏水凝膠聯(lián)合二甲雙胍(metformin，MET)和鹽酸左氧氟沙星(levofloxacin hydrochloride， LFH)治療可以增強CNV的抑制作用。由以上研究可知，熱敏水凝膠是一種隨著溫度變化而發(fā)生可逆溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變的新型水凝膠，提供了一種局部、高效的用藥方式，且毒性低、生物相容性好，有很大潛力加速治療眼部新生血管形成，但目前尚未應用于臨床。

2.3 血管生成抑制劑—富馬西林

富馬西林是由煙曲霉產(chǎn)生的一種自然分泌的水溶性抗生素，可有效抑制包括溶組織內(nèi)阿米巴在內(nèi)的腸原生動物[22]。富馬西林也被證明可以抑制被煙曲霉污染的培養(yǎng)物中的內(nèi)皮細胞增殖，并被鑒定為血管生成抑制劑[23]。在Emoto等人[24]的體外研究中被證實富馬西林可以抑制子宮癌細胞中VEGF的表達。其中有一項關于CNV的研究強調(diào)了TNP-470(一種合成的富馬西林類似物)可以抑制C57BL6小鼠的炎性角膜血管生成。雖然目前有許多研究表明富馬西林在抑制新生血管生成方面有一定療效，但是由于其毒性特征，在人體內(nèi)療效仍存在爭議。

2.4 酪氨酸激酶抑制劑—阿西替尼

阿西替尼是一種有效的合成分子，它可以穩(wěn)定非活性構(gòu)象中的激酶結(jié)構(gòu)域，從而阻斷VEGF信號轉(zhuǎn)導通路[25]。阿西替尼是一種來自吲唑(mw 386.47 Da)的強效小酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKI)，已被證明在多種腫瘤中具有優(yōu)勢，包括黑素瘤、結(jié)直腸癌、胰腺、甲狀腺、乳腺和肺腫瘤。在皮摩爾濃度下，它是VEGF酪氨酸激酶受體(VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3)的一種有效和高度選擇性抑制劑。在納摩爾濃度下，它還能抑制血小板衍生的生長因子受體(抑制PDGF-α和PDGF-β)。Lledo等[26]通過觀察不同濃度的阿西替尼治療角膜新生血管的療效發(fā)現(xiàn)，阿西替尼的作用是通過與VEGF受體的激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使其穩(wěn)定在非活性構(gòu)象中，從而抑制VEGF信號轉(zhuǎn)導。阿西替尼已被證實可以抑制新生血管，但其作用機制、最佳劑量和不良反應等問題有待進一步研究。

2.5 腺苷酸活化蛋白激酶激活劑—二甲雙胍

二甲雙胍是糖尿病一線降糖藥物，近來發(fā)現(xiàn)其在抑制腫瘤細胞增殖和新生血管形成方面均有很好的藥理作用。朱麗華等[27]通過動物實驗研究證實二甲雙胍能抑制堿燒傷誘導的大鼠角膜新生血管的生成，其主要與二甲雙胍降低促血管生成因子表達量和增加抑血管生成因子表達量有關。Garrido等[28]的研究中，二甲雙胍在細胞系中抑制了神經(jīng)生長因子誘導的增殖和促血管生成作用。Han等[29]的研究證明二甲雙胍可以直接抑制人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞(human retinal vascular endothelial cells，hRVECs)的血管生成，并阻止TNF誘導的hRVECs中多種炎性細胞因子表達的上調(diào)。綜合各種研究結(jié)果，二甲雙胍有望成為治療角膜新生血管的新藥物。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，CNV的形成是由多種因素共同作用的結(jié)果，目前臨床上大部分藥物仍處于實驗研究階段，對其安全用量、不良反應、臨床應用機制等方面還需進一步研究。隨著對CNV形成機制認識的深入，CNV的治療將不斷完善，未來將開發(fā)多種機制藥物的聯(lián)合應用，探索更為安全、有效、不良反應低的治療方法。