外泌體在腫瘤中的作用及其臨床應(yīng)用

白金權(quán)，潘炫豪，張譯丹，陸雨清，蘆圣情

(吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院普通外科，吉林 吉林 132013)

外泌體是由磷脂雙分子層包裹而成的直徑在30～150 nm之間的膜性小泡。外泌體的相關(guān)蛋白包括其表面的四跨膜蛋白家族(CD9、CD37、CD63、CD81)[1]和介導(dǎo)多囊泡體形成及腔內(nèi)小泡出芽的內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復(fù)合體(endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)的相關(guān)組成蛋白：腫瘤易感基因-101、熱激蛋白-70(heat shock proteins 70，Hsp70)等。外泌體分布極為廣泛，幾乎所有的細胞均有分泌外泌體的功能，且天然的體液如尿液、乳汁、血液、腦脊液等中也存在外泌體。分泌外泌體是細胞自我調(diào)節(jié)細胞外環(huán)境的一種方式，在細胞通信、疾病傳播、腫瘤的侵襲中都發(fā)揮著不可或缺的作用[2]。

1 外泌體的生物發(fā)生

1.1 外泌體的形成過程

外泌體的形成一般經(jīng)歷細胞膜內(nèi)陷形成內(nèi)體、內(nèi)體膜凹陷形成管腔囊泡、多囊泡體的形成這樣三個階段。其中第二個階段需要借助ESCRT才能成功完成管腔囊泡向多囊泡體的轉(zhuǎn)化，并將多囊泡體釋放到胞外這一系列過程。ESCRT由ESCRT-0、ESCRT-1、ESCRT-2和ESCRT-3四部分組成[3],并按照一定的先后順序，相互配合發(fā)揮分選作用。首先由ESCRT復(fù)合體ESCRT-0中的肝細胞生長因子調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶蛋白聚合體和STAM 1/2(signal transducing adaptor molecule 1/2)識別已經(jīng)泛素化的運輸?shù)鞍?，之后ESCRT-1和ESCRT-2與ESCRT-0結(jié)合，形成親和性極高的復(fù)合體，去接納已經(jīng)泛素化的蛋白。最后ESCRT-3中的腫瘤易感基因101識別二硫鍵誘導(dǎo)內(nèi)體膜變形和脫落形成外泌體[4]。而缺乏ESCRT復(fù)合體的細胞則依靠膜上的CD63蛋白，作為一種獨立、非ESCRT依賴性的分選機制，進行多囊泡體與內(nèi)體膜分離的過程[4]。

1.2 受體細胞對外泌體的攝取

受體細胞對外泌體的攝取，很大程度上依賴于跨膜蛋白。最近的研究表明，細胞膜上的四肽CD151-α3/α6整合素復(fù)合物、細胞間黏附分子-1均能使外泌體與靶細胞精準(zhǔn)結(jié)合[5]。T細胞釋放的外泌體上鑲嵌有CD3復(fù)合物(T細胞受體)和趨化因子受體CXCR4表明，可通過受體-配體間的相互作用調(diào)節(jié)外泌體釋放和攝取的過程。此外，外泌體還可通過以肌動蛋白-細胞骨架和磷脂酰肌醇3-激酶依賴方式，與靶細胞的細胞膜直接發(fā)生融合，使其內(nèi)容物直接釋放到細胞質(zhì)中[6]。

2 外泌體與腫瘤發(fā)生發(fā)展的聯(lián)系

2.1 外泌體誘導(dǎo)正常細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化

由于腫瘤細胞釋放外泌體中其內(nèi)容物的多樣性，外泌體已經(jīng)在各種類型癌癥中被廣泛研究。在膠質(zhì)母細胞瘤中，外泌體被證實可轉(zhuǎn)移功能性表皮生長因子受體Ⅷ蛋白(the epidermal growth factor receptor Ⅷ，EGFRⅧ)，使野生型細胞系發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[7]。與之相類似的，乳腺癌細胞可以借助外泌體的分泌來富集細胞非依賴性的miRNAs，并在外泌體中將miRNAs加工成熟。利用成熟的miRNAs，通過依賴核糖核酸內(nèi)切酶(Dicer，屬于RNaseⅢ家族)的方式干擾細胞的正常轉(zhuǎn)錄，致使正常細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[8]。另外腫瘤細胞釋放的外泌體還會攜帶一定數(shù)量的致癌因子，這些致癌因子通過血液循環(huán)，存在一定的侵染機體內(nèi)其他細胞的概率。在一般的情況下，機體內(nèi)的抑癌基因可通過修復(fù)DNA來保護基因組，同時限制靶細胞對外泌體的繼續(xù)攝取。但如果機體的抑癌基因發(fā)生突變，會增加靶細胞對癌細胞分泌的外泌體的攝取，導(dǎo)致原位癌的轉(zhuǎn)移。

2.2 外泌體調(diào)節(jié)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移前微環(huán)境

外泌體在將某些器官作為轉(zhuǎn)移前微環(huán)境，促進原位癌轉(zhuǎn)移方面起著突出的作用[9]。黑色素瘤細胞釋放的外泌體誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移前部位的血管破壞，促進其肺轉(zhuǎn)移。胰腺癌細胞釋放的外泌體可誘導(dǎo)肝星狀細胞分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β并募集特定的巨噬細胞群，從而在肝臟中建立轉(zhuǎn)移前微環(huán)境。而在發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的乳腺癌中，腫瘤微環(huán)境內(nèi)的星形膠質(zhì)細胞分泌含有miRNAs的外泌體，特異性沉默PTEN基因并導(dǎo)致乳腺腫瘤的腦轉(zhuǎn)移。而在卵巢癌的腹膜轉(zhuǎn)移中，惡性腹水來源的外泌體其內(nèi)含有CD24和上皮細胞黏附分子可作為癌細胞遷移的有效誘導(dǎo)劑[10]。

2.3 外泌體對腫瘤免疫反應(yīng)的調(diào)控

在腫瘤的發(fā)生中，腫瘤所處的微環(huán)境與腫瘤細胞之間相互依存、相互作用，是調(diào)控腫瘤發(fā)生的一個不容忽視的因素。腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞分泌各種趨化因子、細胞因子、生長因子、蛋白水解酶，調(diào)節(jié)腫瘤的免疫逃避或主動殺死腫瘤細胞。最近研究表明：致癌信號的傳導(dǎo)可以引起由免疫系統(tǒng)激活所導(dǎo)致的外泌體釋放，如樹突細胞作為機體內(nèi)功能最強的抗原呈遞細胞，其分泌的外泌體可以激活T淋巴細胞和間接活化B淋巴細胞，從而清除腫瘤細胞[11]。但同時腫瘤細胞釋放的外泌體也可以通過誘導(dǎo)IL-6釋放來破壞樹突細胞，導(dǎo)致抗原的呈遞作用減弱，或下調(diào)NK相關(guān)蛋白的表達來抑制NK細胞增殖。甚至影響免疫細胞表面的受體分布，誘導(dǎo)T淋巴細胞凋亡，最終使T淋巴細胞和T效應(yīng)細胞喪失正常的分裂增殖和自我凋亡能力，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的失衡[12]。

2.4 外泌體促進腫瘤細胞耐藥的發(fā)生

腫瘤細胞依靠外泌體降低其自身對化療藥物的敏感性，是腫瘤細胞對抗化療藥物的一種新型方式。一方面，外泌體可以通過各種藥物轉(zhuǎn)運蛋白直接進行藥物的外排[13]。如Fletcher等已經(jīng)證明耐藥的腫瘤細胞來源的外泌體可將藥物外排泵轉(zhuǎn)移至藥物敏感細胞，導(dǎo)致受體細胞內(nèi)藥物外排，從而降低藥物毒性。且在眾多的藥物外排泵中，乳腺癌耐藥蛋白(BRCP/ABG2)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A3及多藥耐藥相關(guān)蛋白1(MRP1/ABC1)、P-糖蛋白[14]在外泌體參與的耐藥性轉(zhuǎn)運中的作用已經(jīng)得到有效證實。另一方面，外泌體內(nèi)所攜帶的MicroRNA也與腫瘤細胞耐藥的發(fā)生密切相關(guān)。如miRNA-1238在對替莫咪唑耐藥的多形性膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)細胞分泌的外泌體中表達量很高，而miRNA-1238的直接靶點是細胞質(zhì)膜微囊蛋白1(caveolin-1，Cav-1)，因而通過miRNA-1238/Cav 1途徑就可以調(diào)節(jié)GBM敏感細胞對替莫咪唑的敏感性[15]。在卵巢癌中，與卵巢癌發(fā)生有關(guān)的脂肪細胞和成纖維細胞釋放的外泌體中的miRNA-21，通過激活miRNA-21/凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor-1，APAF-1)通路,以分泌外泌體的方式激活miRNA-21下游的靶點APAF-1導(dǎo)致卵巢癌細胞對紫杉醇產(chǎn)生耐藥[16]。而對順鉑耐藥的肺癌細胞，其分泌的外泌體中的miRNA-100-5p是低表達的，即耐藥的細胞以依賴外泌體外排miRNA-100-5p的方式存活，所以通過調(diào)控抑制miRNA-100-5p的外排，可提高肺癌細胞對于順鉑的敏感性。

3 外泌體的臨床應(yīng)用

3.1 外泌體作為生物標(biāo)志物

由腫瘤細胞釋放的外泌體，在血液和包括尿液在內(nèi)的其他體液中含量豐富，而且很大程度上可反映腫瘤細胞的組成。因此通過外泌體對腫瘤進行非侵入性實時分析，這一想法已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注[17]。如在胰腺癌中，從癌前病變或胰腺癌患者的血液中分離出的外泌體含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖1重組蛋白，該蛋白被證明是早期胰腺疾病非常敏感和特異的標(biāo)記物[18]。Skog等已經(jīng)證明，當(dāng)親代膠質(zhì)母細胞瘤細胞表達某種突變體時，循環(huán)血清中的外泌體內(nèi)含的EGFRⅢ是陽性的。因此，通過對外泌體的小血清樣本中EGFR狀態(tài)的確定，即可確定膠質(zhì)母細胞瘤細胞是否發(fā)生突變。另外Taylor也相繼報道，與良性疾病或健康對照相比，卵巢癌患者的血清外泌體水平顯著升高，且外泌體來源的miRNA和相應(yīng)腫瘤來源的miRNA之間圖譜顯示的218個可檢測miRNA中有43個表達失調(diào)[19]。因此，通過對外泌體內(nèi)含的各種核糖核酸進行分析，對患者進行風(fēng)險評估，量身定制癌癥治療方案，可能會在不遠的將來得到實現(xiàn)。

3.2 外泌體作為潛在的治療靶點

目前，如何將外泌體應(yīng)用于臨床治療腫瘤仍是亟待解決的問題。Fabbri等實驗發(fā)現(xiàn)，將患有肺癌的小鼠用GW4869(非競爭性中性鞘磷脂酶2抑制劑)治療后，極大的減少了肺癌的遠處轉(zhuǎn)移[20]。而在結(jié)腸癌中通過GW4869抑制腫瘤相關(guān)纖維母細胞中外泌體的分泌，同樣降低了結(jié)腸癌的克隆發(fā)生和生長[21]。因此利用GW4869靶向調(diào)控神經(jīng)酰胺的生物合成，限制多囊泡體向內(nèi)出芽的過程，對由外泌體介導(dǎo)的腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移可能有較好療效。另外基于樹突狀細胞相關(guān)外泌體(DC-derived exosomes,Dex)的免疫療法，Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗已經(jīng)在惡性黑色素瘤中進行，盡管到目前為止療效有限，但Dex免疫療法作為一種新的癌癥治療方法的前景仍然非常有希望[22]。

3.3 外泌體作為藥物載體存在的臨床價值

此外，將外泌體作為新型的藥物載體，也存在著諸多的優(yōu)勢。如外泌體受到磷脂雙分子層的特殊保護，核糖核酸酶難以將其降解，而且外泌體毒性較低，擁有很好的組織耐受性。將外泌體作為藥物載體的優(yōu)勢在于：可以極大的提高藥物負荷，使血藥濃度維持在一個較高水平，并減少藥物對主要器官的損害。而且外泌體的直徑相當(dāng)小，以外泌體作為藥物載體，藥物就很容易穿過血腦屏障。目前實驗階段，主要通過轉(zhuǎn)染、電穿孔等方法直接把藥物轉(zhuǎn)入外泌體，并在外泌體表面安置靶向分子，這樣就可以起到靶向運輸藥物的作用[23]。近些年來，將外泌體作為藥物載體的臨床研究也相繼展開。如Zhang等于2007年成功將姜黃素搭載于外泌體，發(fā)現(xiàn)其在誘導(dǎo)NK細胞損傷和逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞對幾種化療藥物的敏感性方面具有功效。Aspe等于2010年也報道了搭載生存素T34A的外泌體在促進胰腺導(dǎo)管腺癌PDACs細胞凋亡和誘導(dǎo)癌細胞對吉西他濱敏感性方面的作用[24]。

3.4 外泌體作為抗腫瘤免疫反應(yīng)的佐劑

腫瘤或正常細胞來源的外泌體也可以刺激抗腫瘤免疫反應(yīng)，充當(dāng)能夠?qū)⒛[瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigens，TAA)傳遞給樹突狀細胞的抗原呈遞囊泡。外泌體攜帶的TAA很容易被樹突狀細胞吸收，使得MHC分子上的抗原有效地呈遞給同源的T細胞。另外抗原呈遞細胞(如B細胞或DC細胞)釋放的外泌體可誘導(dǎo)和維持抗腫瘤免疫反應(yīng)的能力也已得到充分證明[25]。如來自胰腺癌和肝細胞癌的外泌體含Hsp70其可以直接激活NK細胞,隨后NK細胞通過顆粒酶B在腫瘤中啟動凋亡。另外Andre等將離體的樹突細胞與來自患者自體腹水的外泌體共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)自體腹水中的外泌體可刺激樹突狀細胞活化，促進對抗腫瘤特異性的淋巴細胞增殖。這些研究均指向腫瘤細胞來源的外泌體可激活免疫系統(tǒng)，未來可能基于外泌體，研發(fā)抗腫瘤疫苗的佐劑[26]。

4 展 望

在過去的10年里，外泌體被發(fā)現(xiàn)可作為一種新型的信息搭載體，用于細胞間的信息傳遞，參與調(diào)節(jié)正?；虍惓＜毎姆肿雍瓦z傳特征的調(diào)節(jié)。而其中腫瘤細胞釋放的外泌體更是引起廣泛關(guān)注。細胞間以外泌體為載體構(gòu)成了一個信號傳遞的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，介導(dǎo)腫瘤細胞之間或者腫瘤細胞與間質(zhì)細胞之間的相互作用，從誘導(dǎo)正常細胞的惡性轉(zhuǎn)化、參與TEM的調(diào)節(jié)，影響腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生，到對腫瘤轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的調(diào)控，可以發(fā)現(xiàn)外泌體與腫瘤發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。同時腫瘤細胞釋放的外泌體也可以激活免疫細胞，引發(fā)機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。所以說外泌體既可以是腫瘤發(fā)展的促進劑也可以作為腫瘤發(fā)展的抑制劑。這為將來研發(fā)通過抑制腫瘤細胞來源的外泌體來遏制腫瘤生長，或?qū)ν饷隗w進行藥物搭載，靶向治療等諸多療法提供無限可能。外泌體的功能正在被不斷的發(fā)掘，如何更有效的利用外泌體，通過人為的調(diào)控外泌體的釋放，對藥物代謝進行干預(yù)將是一個值得關(guān)注的問題。將外泌體作為一種藥物的載體進行靶向作用，為癌癥的治療提供新思路是當(dāng)前亟待解決的問題。但對外泌體的這種調(diào)控必須是高度選擇性與特異性的，將外泌體作為治療靶點或生物學(xué)標(biāo)志物，未來還有很長的路要走。