肺炎鏈球菌熱休克蛋白40在誘導樹突細胞成熟中的作用

劉敬敬，陳 雷

(廈門市兒童醫(yī)院，福建 廈門 361006)

肺炎鏈球菌(S.pn)又稱肺炎雙球菌，可引起急性肺泡炎癥性疾病，健康人鼻咽部70%以上存在S.pn。正常情況下S.pn無致病性，當機體防御功能減退、抗病能力減弱、球菌毒力和致病力增強時可引發(fā)伴有寒戰(zhàn)高熱、咳嗽、咯血痰、胸痛、呼吸困難等癥狀的肺炎，嚴重情況下可發(fā)展為腦膜炎、敗血癥等侵入性疾病[1]。在機體內(nèi)，S.pn 可加速活化被抗原提呈細胞(APC)，將抗原肽遞呈給T 細胞，啟動適應性免疫應答。肺炎鏈球菌熱休克蛋白40又稱Dna J，是分子伴侶的一種，該蛋白為S.pn的一種毒力因子，參與細胞免疫應答機制[2]。樹突細胞(DCs)是機體專職呈遞抗原的細胞，分為未成熟DCs(iDCs)和成熟DCs(mDCs)兩大類，其中mDCs與促炎性細胞因子水平、病情嚴重程度密切相關[3]。研究表明，CD11c是一類高表達于DCs的表面分子,DCs及B淋巴細胞表面的主要組織相容性復合體Ⅱ型分子(MHCⅡ)在細胞完成抗原呈遞，活化CD4+的T淋巴細胞中發(fā)揮重要作用。Shin等發(fā)現(xiàn)，iDCs成熟過程中，MHCⅡ會從晚期內(nèi)含體和溶酶體中釋放并遷移至質(zhì)膜，可見，在iDCs中MHCⅡ主要存在于細胞內(nèi)，而在mDCs中卻大量表達于細胞質(zhì)膜上。Chan等報道，隨著DCs的成熟，IL-12的分泌是增加的，IL-12不僅可以促進DCs數(shù)量的增加，而且還會促進成熟[4-5]。研究表明，DCs細胞質(zhì)膜上MHCⅡ和共刺激分子含量的增加意味著活力的增強，可促進DCs的成熟[6]。Dna J與DCs的成熟相關，但在成熟過程中的免疫應答機制尚不清楚。本文通過試驗研究分析DnaJ誘導單核細胞來源DCs成熟過程中細胞表面分子的表達情況，探討DnaJ在機體免疫應答中的作用機制。

1 資料與方法

1.1研究對象:我院檢驗科體檢的0～18歲健康兒童。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

1.2主要儀器及試劑:電子天平(梅特勒-托利多，ME203E/02);細胞培養(yǎng)箱(Thermo，BC-J80S)；流式細胞儀(貝克曼公司 FACS，Calibur); 胎牛血清(Gibco,1640958)；RPMI1640細胞培養(yǎng)基(上海微科生物，S00000L0500)；重組小鼠粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)(上海恒斐生物科技有限公司，415-ML-050)；重組小鼠白細胞介素-4(rmIL-4)(上海玉博生物,CYT-282)；異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗CD11c抗體、藻紅蛋白(PE)標記的人類白細胞DR抗原(HLA-DR)、CD11c、CD86抗體、外周血單個核細胞分離試劑盒均來源于北京博奧森生物科技有限責任公司。

1.3方法

1.3.1Dna J的制備:①肺炎鏈球菌rHSP40基因合成：密碼子優(yōu)化軟件MaxCodon TM Optimization Program (V13)對提供的肺炎鏈球菌熱休克蛋白氨基酸序列進行優(yōu)化，采用全基因合成方法，限制性酶切位點 NdeⅠ和HindⅢ將肺炎鏈球菌rHSP40基因插入到表達載體pET30a中，酶切法和測序確認最終表達載體的準確性。②肺炎鏈球菌rHSP40蛋白誘導表達：將構(gòu)建的表達載體分別轉(zhuǎn)到 Top10 克隆菌株和 BL21(DE3)表達菌株中，通過異丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導表達肺炎鏈球菌rHSP40。③肺炎鏈球菌rHSP40蛋白純化：通過親和層析(Ni-IDA 樹脂)純化肺炎鏈球菌rHSP40。④肺炎鏈球菌rHSP40蛋白祛除內(nèi)毒素：最后通過對甲氧基芐基(PMB)柱去除內(nèi)毒素，獲得目標蛋白。

1.3.2DCs的誘導成熟:①外周血單核細胞分離：抽取兒童外周血2 ml于負壓采血管，按照外周血單個核細胞分離試劑盒說明書提取外周血單個核細胞。②DCs培養(yǎng)： 10%胎牛血清(FBS)的1640完全培養(yǎng)基(內(nèi)含刺激因子濃度為15ng/ml的rmGM-CSF和rmIL-4)培養(yǎng)細胞，細胞計數(shù)板計數(shù)濃度為5×105/ml后接種于6孔培養(yǎng)孔板，每孔體積為4 ml。37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后，輕輕晃動六孔板，吸棄培養(yǎng)液、懸浮、半懸浮細胞，保留貼壁細胞，經(jīng)PBS洗滌后，每孔加入含10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基(內(nèi)含刺激因子濃度為15 ng/ml的rmGM-CSF和rmIL-4)4 ml繼續(xù)培養(yǎng)3 d。③DCs誘導成熟：收集培養(yǎng)3 d后體系中的懸浮及半懸浮細胞，1 500 r/min，離心5 min，PBS洗滌，將細胞接種于六孔板，當細胞濃度為 1×107/ml，用15 μg/ml的肺炎鏈球菌rHSP40對細胞進行刺激，10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基(內(nèi)含刺激因子濃度為5 ng/ml的rmGM-CSF和rmIL-4)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h，胰酶消化收集細胞。

1.3.3細胞表面分子檢測：將FITC標記的抗CD11c抗體、PE標記的抗HLA-DR、CD11c、CD86抗體按照使用說明書進行稀釋。收集陰性對照組細胞及rHSP40刺激組細胞1×107個，PBS洗滌1遍，分別加入稀釋后抗體，4℃冰箱避光孵育30 min。PBS洗滌2遍，離心除去未吸附抗體。1 ml滅菌移液槍輕柔吹打兩組細胞懸液，用流式細胞儀進行分析檢測。

2 結(jié)果

2.1肺炎鏈球菌rHSP40基因合成與構(gòu)建情況：瓊脂糖電泳確認質(zhì)?；螂娪緱l帶及目的基因電泳條帶，見圖1目的基因質(zhì)量控制結(jié)果、圖2目的基因構(gòu)建結(jié)果。

注:泳道1為質(zhì)粒電泳的基因片段，泳道2為目的基因DT3198電泳基因片段，泳道3為DNA Marker電泳條帶

圖2 目的基因構(gòu)建結(jié)果圖解

2.2肺炎鏈球菌rHSP40誘導表達結(jié)果的鑒定：考馬斯亮莉染色法對肺炎鏈球菌rHSP40蛋白染色鑒定，脫色至背景清晰確定最佳誘導條件。加終濃度0.2 mmol/L IPTG，15℃誘導16 h后可作為誘導條件，用于肺炎鏈球菌rHSP40放大培養(yǎng)，見圖3。

泳道M:蛋白Marker,泳道 0:陰性對照，泳道1:15℃誘導 16 h，泳道2:37℃誘導 16 h

2.3肺炎鏈球菌rHSP40蛋白純化：SDS-PAGE 分析經(jīng) Ni-IDA 親和層析純化，收集純度相對較高的條帶8～10中，將其透析到 1×PBS(pH值8.0)中，下一步嘗試 PMB 柱去除內(nèi)毒素，分析結(jié)果見圖4。

泳道 M:蛋白 Marker；泳道 1:全菌破菌離心后上清；泳道 2:上清同 Ni-IDA 孵育后流出液；泳道 3～7:50 mmol咪唑的洗脫組分；泳道8～10:100 mmol咪唑的洗脫組分；泳道11～13:300 mmol咪唑的洗脫組分

2.4PMB柱去除內(nèi)毒素結(jié)果：通過凝膠法內(nèi)毒素檢測試劑盒測定，得出內(nèi)毒素去除的實驗檢測結(jié)果濃度：C=3.18 mg/ml(Bradford法測定原始數(shù)據(jù)),本批鱟試劑靈敏度：λ=0.25 EU/ml；樣品中所含內(nèi)毒素限值：L=1 EU/μg;最大稀釋倍數(shù):MVD= C*L/λ;實驗結(jié)果分析：Chaperone蛋白的內(nèi)毒素水平<1 EU/μg，結(jié)果如下：稀釋倍數(shù)10、100、1 000結(jié)果為凝固；稀釋倍數(shù)12 000、16 000時，結(jié)果為未凝固。

2.5肺炎鏈球菌rHSP40刺激后的細胞表面分子CD11c、HLADR、CD80及CD86表達情況：肺炎鏈球rHSP40刺激外周血單個核細胞，10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基(內(nèi)含刺激因子濃度為5 ng/ml的rmGM-CSF和rmIL-4)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h，收集細胞進行細胞表面分子檢測CD11c、HLADR、CD80及CD86表達情況，結(jié)果如下圖5，結(jié)果顯示肺炎鏈球菌HSP40刺激后的細胞表面分子CD11c、HLADR、CD80及CD86高表達。見圖5。

圖5 CD11c、HLADR、CD80及CD86表達情況

3 討論

DCs是機體最主要的專職APC。有研究表明，根據(jù)DCs的成熟狀態(tài)可以將其分為未成熟DCs(iDCs)和成熟DCs(mDCs)，CD11c是一類高表達于DCs的表面分子[7-9]。DCs及B淋巴細胞表面的HLA-DR在細胞完成抗原呈遞，活化CD4+的T淋巴細胞中發(fā)揮重要作用[10-12]。Shin等發(fā)現(xiàn)，iDCs成熟過程中，HLADR會從晚期內(nèi)含體和溶酶體中釋放并遷移至質(zhì)膜，可見，在iDCs中HLADR主要存在于細胞內(nèi)，而在mDCs中卻大量表達于細胞質(zhì)膜上[13-15]。同時，細胞表面的共刺激分子CD80和CD86是活化效應T細胞的重要第二信號，也與DCs的成熟相關。DCs細胞質(zhì)膜上HLADR和共刺激分子含量的增加意味著細胞活力的增強[16-17]。研究表明，在感染應激條件下 S.pn 高表達HSP40以適應外界環(huán)境變化，HSP40是S.pn 重要的毒力因子，參與細胞免疫應答機制[18]。但HSP40在單核細胞來源的DCs成熟過程中的研究至今在國內(nèi)外未見報道。本課題旨在通過研究HSP40在誘導兒童外周血單個核細胞來源的DCs成熟過程中細胞表面分子分泌情況，以期指導兒童重癥肺炎的治療。

研究通過肺炎鏈球菌rHSP40基因合成與構(gòu)建獲得準確的表達載體，將構(gòu)建好的含有肺炎鏈球菌rHSP40基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，通過IPTG誘導表達肺炎鏈球菌rHSP40，之后通過親和層析(Ni-IDA樹脂)純化肺炎鏈球菌rHSP40，最終通過PMB柱去除內(nèi)毒素獲得最終目標蛋白。研究通過培養(yǎng)外周血單個核細胞，培養(yǎng)完成后接種于6孔培養(yǎng)板，分為陰性對照組和實驗組，結(jié)果顯示肺炎鏈球菌HSP40刺激后的細胞表面分子CD11c、HLADR、CD80及CD86高表達，表明肺炎鏈球菌HSP40可誘導DCs成熟。

綜上所述，肺炎鏈球球菌HSP40可通過上調(diào)外周血單個核細胞表面分子CD11c、HLADR、CD80及CD86表達，誘導DCs成熟。研究通過探討肺炎鏈球菌HSP40(HSP40 )在DCs成熟過程中的作用，加強肺炎鏈球菌的致病機制的進一步的認識，從而為更好地闡明肺炎鏈球菌致病機制及研發(fā)新型疫苗作鋪墊。