慢性乙型肝炎患者肝組織PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路與HBV病毒載量及肝纖維化程度關(guān)系

藺 萍 金 梅

湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院，襄陽(yáng)市中心醫(yī)院N醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部 (湖北 襄陽(yáng)， 441000)

乙型肝炎病毒(HBV)屬嗜肝DNA病毒家族，是一種小的、有包膜的部分雙鏈DNA病毒， HBV持續(xù)感染是慢性乙型肝炎(CHB)、肝纖維化、肝硬化、原發(fā)性肝癌等慢性肝病的重要致病因素[1,2]。肝纖維化是肝細(xì)胞壞死或炎癥刺激時(shí)肝內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生的病理過(guò)程，大多數(shù)慢性肝病都伴有肝纖維化，其中約25%發(fā)展為肝硬化甚至肝癌[3-6]。磷脂肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信號(hào)通路活化可以抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞生存和增殖，同時(shí)參與血管形成，被證實(shí)與肝纖維化的發(fā)展密切相關(guān)[7-9]。本研究旨在觀察PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路與CHB患者肝纖維化和病毒載量的相關(guān)性，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2019年4月至2021年4月在本院行肝穿刺的CHB患者74例，男49例，女25例；年齡39～75歲，平均63.78±7.15歲。另選取同期接受肝穿刺檢查的非酒精性脂肪性肝病患者20例作為對(duì)照組，男13例，女7例；年齡36～72歲，平均61.93±7.45歲。兩組患者性別和年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)CHB患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《CHB防治指南(2019年版)》[10]的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)非酒精性脂肪性肝病患者納入標(biāo)準(zhǔn)：① 符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版)》[11]診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)接受肝穿刺活檢；(4)簽署知情同意書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)CHB患者排除標(biāo)準(zhǔn)：① 有飲酒習(xí)慣(女性>20 g/d，男性>40 g/d)或酒精性肝炎；②其他病毒性肝炎；③合并惡性腫瘤；④近2個(gè)月內(nèi)使用過(guò)抗病毒治療或其他影響免疫功能的藥物者。(2)非酒精性脂肪性肝病患者排除標(biāo)準(zhǔn)：①病毒性或酒精性肝炎；②合并惡性腫瘤。

1.3 肝組織病理學(xué)檢查 在MX-01000305型彩色超聲診斷儀(南京貝登療股份有限公司)的引導(dǎo)下，行經(jīng)皮肝臟穿刺術(shù)，獲取肝組織(長(zhǎng)度>1.0 cm)，行病理學(xué)檢查。交由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科主治醫(yī)師閱片，參照文獻(xiàn)[11]，將74例CHB患者按纖維化程度分為S0～S4級(jí)，其中S0為無(wú)肝纖維化病變，S4為肝硬化。

1.4 免疫組化檢測(cè) 肝組織切片行常規(guī)HE復(fù)染確認(rèn)，切片經(jīng)烤片、脫蠟、水化后，TBST沖洗3 min×3次。抗原熱修復(fù)：將切片浸泡于檸檬酸鹽熱修復(fù)液中，經(jīng)高壓煮沸2 min，然后室溫放置自然冷卻。TBST沖洗1次。阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：甩去TBST液，每張切片滴加3% H2O2溶液，室溫下孵育10 min。甩去3% H2O2溶液，TBST沖洗3 min×3次。封閉非特異性結(jié)合：甩去TBST液，每張切片滴加5% BSA溶液，室溫孵育1 h。甩去5% BSA液，每張切片滴加100 μl相應(yīng)的一抗：兔抗人p-PI3K、兔抗人p-Akt和兔抗人p-mTOR(美國(guó)Cell signaling Techmology公司生產(chǎn))，將切片置于室溫下孵育1 h。甩去一抗，TBST沖洗3 min×3次。每張切片上滴加100 μl新鮮配制的DAB顯色溶液，顯微鏡下觀察顯色情況，顯色時(shí)間為2～3 min。自來(lái)水沖洗終止顯色，蘇木精復(fù)染3 min，1% 鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗返藍(lán)5 min。梯度酒精脫水干燥、二甲苯透明后，中性樹(shù)膠封固。顯微鏡下觀察結(jié)果。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，已知的STAT3陽(yáng)性標(biāo)本為陽(yáng)性對(duì)照。

判定標(biāo)準(zhǔn)：觀察高倍(×400)視野下陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及染色強(qiáng)度，陽(yáng)性細(xì)胞占比≤5%為0分、6%～25%計(jì)1分、26%～50%計(jì)2分、51%～75%計(jì)3分、≥76%計(jì)4分；細(xì)胞未染色計(jì)0分、淡黃色為1分、棕黃為2分、棕褐為3分?？偡?細(xì)胞染色評(píng)分×細(xì)胞占比評(píng)分，總分≥3分即為陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果評(píng)判由2人進(jìn)行雙盲讀片確定。

1.5 血清HBV DNA載量檢測(cè) 利用PE-5700熒光定量PCR儀對(duì)CHB患者血清HBV DNA載量進(jìn)行檢測(cè)(試劑盒購(gòu)自中山達(dá)安基因中心)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，依據(jù)HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)品建立計(jì)算曲線，由專用軟件自動(dòng)分析，讀取樣本HBV拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者肝組織PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白陽(yáng)性率比較 見(jiàn)表1。

表1 兩組患者肝組織PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白陽(yáng)性率 [例(%)]

2.2 不同肝纖維化程度CHB患者PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白陽(yáng)性率比較 見(jiàn)表2。

表2 不同肝纖維化程度CHB患者PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白陽(yáng)性率 [例(%)]

2.3 不同HBV DNA載量CHB患者PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白陽(yáng)性率比較 根據(jù)HBV DNA載量將CHB患者分為4組，<104IU/ml組26例，104～105IU/ml組21例，105～106IU/ml組20例，>106IU/ml組7例；4組患者肝組織PI3K、Akt、mTOR蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨HBV DNA載量增加，PI3K、Akt、mTOR蛋白陽(yáng)性表達(dá)率呈升高趨勢(shì)。見(jiàn)表3。

表3 CHB患者不同HBV DNA載量PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白陽(yáng)性率 [例(%)]

3 討論

PI3K是由調(diào)控亞基p85和催化亞基p110組成的異二聚體，當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子的刺激，PI3K被激活和聚集在細(xì)胞膜，使3,4-二磷脂酰肌醇向3,4,5-三磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)化，而3,4,5-三磷脂酰肌醇充當(dāng)?shù)诙攀辜せ钇湎掠蜛kt[12,13]。Akt是一種進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要位于靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞質(zhì)中，又稱蛋白激酶B，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有三種Akt異構(gòu)體，大部分具有相同的功能；PI3K生成3,4,5-三磷脂酰肌醇后，可與Akt的PH結(jié)構(gòu)域作用，使Akt聚集到細(xì)胞膜，通過(guò)3-磷脂酞肌醇依賴性蛋白激酶l將其Thr305位點(diǎn)磷酸化，以及梭基端的Ser473磷酸化，激活后的磷酸化Akt(p-Akt)蛋白再轉(zhuǎn)位到胞漿中或胞核內(nèi)，隨后磷酸化其一系列底物，從而達(dá)到調(diào)控細(xì)胞存活和凋亡的目的[14]。mTOR是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)Akt信號(hào)分子下游雷帕霉素作用的靶點(diǎn)，激活后的Akt可以通過(guò)直接直接磷酸化mTOR的ser2448位點(diǎn)而激活mTOR，還能通過(guò)抑制結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物和TSCI形成復(fù)合物，激活mTOR信號(hào)[15,16]。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過(guò)影響下游效應(yīng)分子的活化，參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、代謝等一系列重要生理活動(dòng)。近年在許多惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的異常激活，提示PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路可能與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡密切相關(guān)，目前該通路在CHB患者肝纖維化中的研究較少[17]。本研究中，CHB組患者PI3K、Akt、mTOR陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，提示與非酒精性脂肪性肝病患者相較，CHB患者PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路激活。隨后，根據(jù)肝組織活檢結(jié)果和肝纖維化分級(jí)，將CHB患者對(duì)應(yīng)分組，發(fā)現(xiàn)隨肝纖維化分級(jí)升高、HBV DNA載量增加，CHB患者PI3K、Akt、mTOR陽(yáng)性表達(dá)率呈升高趨勢(shì)，提示CHB患者體內(nèi)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路激活可能與病毒載量和肝纖維化程度相關(guān)，考慮原因是激活的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的增殖和遷移、增加Ⅰ型膠原的表達(dá)、影響基質(zhì)金屬蛋白酶和組織金屬蛋白酶抑制劑的平衡，促進(jìn)肝纖維化形成和發(fā)展[18]。

綜上所述，本研究提示CHB患者肝組織中存在PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路激活，其活化程度與血清HBV DNA病毒載量和肝纖維化程度相關(guān)。本研究對(duì)臨床工作有一定參考價(jià)值，但本研究有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)行多中心、前瞻性研究，進(jìn)一步探究PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在CHB發(fā)展中的作用。