膽汁淤積性肝病嬰兒腸道微生態(tài)與膽汁酸代謝的關(guān)系

高 玲 封東進(jìn) 王光猛 董中茂 周 琦 孫蓓蓓

徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州兒童醫(yī)院消化內(nèi)科 (江蘇 徐州， 221000)

嬰兒膽汁淤積性肝病是一種因各類原因?qū)е履懼尫偶芭判拐系K而引起膽汁酸代謝異常，并造成器質(zhì)性損傷的肝膽系統(tǒng)疾病，患兒主要表現(xiàn)為皮膚瘙癢、乏力、黃疸等，部分可見肝腫大、營(yíng)養(yǎng)不良等[1]。代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，目前臨床針對(duì)嬰兒膽汁淤積性肝病的發(fā)生與發(fā)展，國(guó)外諸多研究顯示，可能與腸道微生態(tài)紊亂有關(guān)[2]。其中腸道菌群-膽汁酸代謝通路對(duì)疾病的作用至關(guān)重要，血清總膽汁酸(TBA)作為一種信號(hào)分子，可在腸道菌群的影響下加速病情發(fā)展[3]。國(guó)內(nèi)有關(guān)腸道微生態(tài)成分的變化與膽汁酸代謝及嬰兒膽汁淤積性肝病的相關(guān)性研究較為鮮少，本研究旨在通過(guò)探究腸道微生態(tài)與膽汁酸代謝、嬰兒膽汁淤積性肝病的關(guān)系，為臨床診治及預(yù)防提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年5月至2019年5月于我院就診的51例嬰兒膽汁淤積性肝病患兒為觀察組，并隨機(jī)選取同期57例健康嬰兒作為健康對(duì)照組。本次研究得到醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合美國(guó)與歐洲兒科學(xué)會(huì)聯(lián)合制訂的膽汁淤積性肝病診斷標(biāo)準(zhǔn)者[4]；②月齡1～3月者；③直接膽紅素(DBil)>17 μmol/L者；④主要監(jiān)護(hù)人知情同意，主動(dòng)提出簽署知情同意書者。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①影像學(xué)未排除膽管結(jié)石、膽總管囊腫、膽管癌等肝外膽道梗阻性疾病者；②合并呼吸、消化、泌尿等系統(tǒng)性疾病者；③入組前1個(gè)月曾服用抗生素、益生菌等影響腸道菌群生物穩(wěn)態(tài)的藥物治療者；④合并先天性疾病者；⑤近期存在急性或慢性感染史者。

1.4 研究方法

1.4.1 臨床資料收集 收集兩組研究對(duì)象資料，參考《膽汁淤積性肝病診斷和治療共識(shí)(2015)》[5]中的規(guī)范化治療方案給予所有患兒基礎(chǔ)治療及個(gè)體化治療，包括熊去氧膽酸、激素、免疫抑制劑等。一般資料包括姓名、性別、病程、病因等，檢測(cè)其生化指標(biāo)，包括總膽紅素(TBil)、DBil、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、血氨、總膽固醇(TC)。

1.4.2 腸道微生態(tài)檢測(cè)方法 收集其新鮮糞便標(biāo)本200 mg，采用無(wú)菌離心管收集，并置于-80℃的冰箱內(nèi)保存。儀器采用DP328糞便基因組提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，通過(guò)特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱和獨(dú)特的抑制劑吸附片InhibitEX配合專項(xiàng)開發(fā)的緩沖液系統(tǒng)提取糞便樣本的基因組DNA。將凍干粉型的雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌菌株接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，同樣抽取1 ml培養(yǎng)液后提取標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA。采用光密度測(cè)定法檢測(cè)260、280 nm處樣本的吸光度，分析樣本純度及濃度，當(dāng)A260/A280為1.8～2.2時(shí)符合標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)SYBR Green ReGPTime PCR Master Mix(上海芃碩生物科技有限公司，1 ml×5)檢測(cè)患兒腸道菌群構(gòu)成，引物設(shè)計(jì)參考細(xì)菌16S人DNA基因序列，其引物基因序列見表1。引物0.5 μl，模板DNA 1.0 μl，反應(yīng)體積20 μl，95℃ 10 min,95℃ 20 s、59℃ 30 s、68℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線并換算標(biāo)準(zhǔn)品1 L的拷貝數(shù)。

表1 基因引物序列

1.4.3 膽汁酸代謝指標(biāo)檢測(cè)方法 于清晨空腹下行常規(guī)靜脈采血5 ml置于抗凝管，4 h內(nèi)測(cè)完血清TBA水平，采用酶比色法測(cè)定，試劑盒來(lái)自煙臺(tái)澳斯邦生物工程有限公司，操作均嚴(yán)格按照試劑盒自帶說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 觀察指標(biāo) 比較兩組研究對(duì)象腸道微生態(tài)指標(biāo)及血清總膽汁酸(TBA)水平，通過(guò)Pearson積矩相關(guān)分析評(píng)估嬰兒膽汁淤積性肝病患兒的B/E值與TBA指標(biāo)間相關(guān)性。觀察組患兒根據(jù)是否發(fā)生肝硬化分為肝硬化組和無(wú)肝硬化組，比較組間腸道微生態(tài)指標(biāo)，采用Spearman相關(guān)分析嬰兒膽汁淤積性肝病患兒病情嚴(yán)重程度與腸道微生態(tài)指標(biāo)相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 一般資料情況 兩組研究對(duì)象性別、年齡比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，觀察組患兒TBil、DBil、ALT、AST、ALP、GGT、血氨、TC明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組對(duì)象一般資料比較

2.2 腸道微生態(tài)指標(biāo)情況 觀察組患兒DNA-A260、雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量及B/E值明顯低于健康對(duì)照組(P<0.05)，而大腸桿菌數(shù)量明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組對(duì)象腸道微生態(tài)指標(biāo)情況比較

2.3 膽汁酸代謝指標(biāo)情況比較 觀察組患兒TBA水平為(56.23±7.12)μmol/L明顯高于健康對(duì)照組(4.13±1.07)μmol/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.4 Pearson相關(guān)性分析 嬰兒膽汁淤積性肝病患兒B/E值與TBA水平具有負(fù)相關(guān)(r=-0.838，P<0.05)。見圖1。

圖1 膽汁淤積性肝病嬰兒患兒B/E值與TBA水平的散點(diǎn)圖

2.5 不同病情組間腸道微生態(tài)指標(biāo)情況比較 觀察組患兒根據(jù)是否發(fā)生肝硬化分為肝硬化組和無(wú)肝硬化組，肝硬化組雙歧桿菌數(shù)量及B/E明顯低于無(wú)肝硬化組(P<0.05)。見表4。

表4 不同病情嚴(yán)重程度組間腸道微生態(tài)指標(biāo)情況比較

2.6 Spearman相關(guān)性分析 嬰兒膽汁淤積性肝病患兒病情嚴(yán)重程度與DNA-A260、乳酸桿菌、大腸桿菌數(shù)量均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，與雙歧桿菌數(shù)量及B/E值具有負(fù)相關(guān)性(P<0.05)。見表5。

表5 膽汁淤積性肝病患兒病情嚴(yán)重程度與腸道微生態(tài)指標(biāo)的相關(guān)性分析 (r/P)

3 討論

嬰兒膽汁淤積性肝病主要病理變化為膽汁生成及排泄失衡，可導(dǎo)致膽管內(nèi)壓急劇升高，達(dá)到臨界值后導(dǎo)致連接毛細(xì)膽管及膽管的Hering壺腹破裂，膽汁逆流進(jìn)入血液[6]。該病的主要病因包括遺傳、免疫、感染、結(jié)石等，可分為肝細(xì)胞性、膽管性及混合性膽汁淤積[7]。從疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程角度分析，嬰兒膽汁淤積性肝病可通過(guò)損害從膽管上皮細(xì)胞至肝細(xì)胞，或“自上而下”，從肝細(xì)胞損傷至膽管細(xì)胞兩種病理模式發(fā)病，但具體發(fā)病機(jī)制尚有待深入闡明[8]。近十余年，國(guó)內(nèi)外針對(duì)成人膽汁淤積性肝病的發(fā)病從多個(gè)方面有了更多的認(rèn)識(shí)，包括肝纖維化機(jī)制、治療靶點(diǎn)、腸道微生態(tài)等，其中腸肝循環(huán)和腸道微生態(tài)是現(xiàn)臨床廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)話題[9]。

腸道微生態(tài)是指棲息于人體腸道內(nèi)的菌群平衡，正常生理狀態(tài)下具有統(tǒng)一、穩(wěn)定的特性，與宿主細(xì)胞共同維持生理功能[10]。人體腸道內(nèi)的菌群主要包括共生性細(xì)菌、致病性細(xì)菌及條件致病菌，其中共生性細(xì)菌又包括雙歧桿菌、乳酸桿菌，而致病性細(xì)菌包括大腸桿菌、沙門菌等，條件致病菌包括腸桿菌等[11]。一般情況下，少量的細(xì)菌或代謝產(chǎn)生進(jìn)入肝臟可被自身免疫系統(tǒng)消除，但考慮病理狀態(tài)下庫(kù)普弗細(xì)胞及自身免疫系統(tǒng)功能減弱，導(dǎo)致腸道微生態(tài)失衡[12]。致病菌大量釋放并產(chǎn)生一系列有毒代謝物質(zhì)，通過(guò)“肝-腸”軸損害肝臟，并導(dǎo)致免疫系統(tǒng)過(guò)度激活，引發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重組織損傷[13]。嬰兒膽汁淤積性肝病患兒膽汁淤積后進(jìn)入腸道的膽汁酸相對(duì)減少，無(wú)法有效調(diào)節(jié)腸道菌群數(shù)量，導(dǎo)致其微生態(tài)改變[14]。有關(guān)腸道微生態(tài)與肝膽疾病的研究，更多的報(bào)道關(guān)注腫瘤或炎性腸炎等疾病，郭磊等[15]發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，TBA及次膽汁酸水平均顯著升高，且組織學(xué)顯示癌組織處的腸道菌群微生態(tài)較癌旁組織處明顯改變。

本研究結(jié)果顯示，觀察組患兒TBil、DBil、ALT、AST、ALP、GGT、血氨、TC、TBA水平明顯高于健康對(duì)照組，表明嬰兒膽汁淤積性肝病發(fā)病可引起肝功能、血脂代謝、膽汁酸代謝等異常。而分析其腸道微生態(tài)，結(jié)果顯示，觀察組患兒DNA-A260、雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量及B/E值明顯更低，而大腸桿菌數(shù)量明顯更高，與徐志超等[16]探究嬰兒膽汁淤積性肝病與腸道微生態(tài)的關(guān)系研究結(jié)果一致。經(jīng)Pearson相關(guān)分析，嬰兒膽汁淤積性肝病患兒B/E值與TBA水平具有顯著負(fù)相關(guān)性，提示雙歧桿菌為腸道保護(hù)菌群，而大腸桿菌可通過(guò)影響TBA水平參與嬰兒膽汁淤積性肝病的發(fā)生。將所有嬰兒膽汁淤積性肝病患兒根據(jù)有無(wú)肝硬化分為不同亞組，結(jié)果顯示，隨病情加重，其微生態(tài)紊亂亦隨之加劇，且經(jīng)Spearman相關(guān)分析，與雙歧桿菌數(shù)量及B/E值具有負(fù)相關(guān)性。分析原因，嬰兒膽汁淤積性肝病患兒膽汁淤積后可造成肝功能受損，其一機(jī)械屏障損傷，表現(xiàn)為腸道黏膜受損，難以阻擋細(xì)菌入侵；其二化學(xué)屏障損傷，指的是膽汁作為腸道菌群的主要調(diào)節(jié)物質(zhì)，不僅可有效抑制致病菌生長(zhǎng)，且還可直接與細(xì)菌產(chǎn)物及內(nèi)毒素等結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)其穩(wěn)態(tài)平衡，嬰兒膽汁淤積性肝病患兒腸道內(nèi)致病菌明顯增多，優(yōu)勢(shì)菌數(shù)量顯著下降，而肝內(nèi)大量的TBA則破壞固有免疫系統(tǒng)，加重肝功能損傷；其三為免疫屏障損傷，表現(xiàn)為肝內(nèi)免疫系統(tǒng)紊亂，炎性因子大量釋放，并造成黏膜屏障損壞，細(xì)菌與內(nèi)毒素釋放入血；其四為生物屏障損傷，是指膽汁淤積后可造成腸粘膜功能受損，而引起細(xì)菌穩(wěn)態(tài)失衡，而腸道菌群紊亂又可進(jìn)一步通過(guò)炎癥反應(yīng)、內(nèi)毒素移位、破壞腸道屏障等加重膽汁淤積。

嬰兒膽汁淤積性肝病患兒腸道菌群分布及TBA水平與健康人相比存在顯著差異，提示疾病的發(fā)生可能與菌群結(jié)構(gòu)改變及TBA水平異常有關(guān)，但考慮樣本納入時(shí)間跨度較大，且由于地區(qū)限制，僅對(duì)本院的部分患兒進(jìn)行研究，具有一定局限，有待后續(xù)改善后深入探討。