肝硬化患者中醫(yī)證型演變過(guò)程中腸道菌群結(jié)構(gòu)變化及其臨床意義*

郭曉霞 葉永安 李小科 郭琲婷 呂 蕾 秦雪梅

1.山西省中醫(yī)藥研究院 (山西 太原， 030012) 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院 3.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心

肝硬化(LC)是一種由多種肝損傷導(dǎo)致高死亡率和高發(fā)病率的晚期肝病，其特征是肝纖維化和門靜脈高壓癥。在世界范圍內(nèi)，該病每年可導(dǎo)致103萬(wàn)人死亡[1]，在歐洲每年導(dǎo)致17萬(wàn)人死亡[2]，被確定為世界上第14大死亡原因，LC的發(fā)病率和死亡率在發(fā)達(dá)國(guó)家中繼續(xù)增加[3]。因此，有效干預(yù)LC的進(jìn)展至關(guān)重要。越來(lái)越多的研究表明，腸道微生態(tài)改變可能會(huì)促進(jìn)LC患者病情進(jìn)展[4]，與肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)LC以肝郁脾虛證和濕熱內(nèi)蘊(yùn)證為主要證型[6]。目前分析LC患者中醫(yī)證型演變規(guī)律，并探討其與腸道菌群水平動(dòng)態(tài)變化的相關(guān)報(bào)道甚少。本研究觀察44例不同中醫(yī)證型LC患者的臨床生化指標(biāo)及腸道菌群動(dòng)態(tài)變化，報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2017年8月至2019年8月于山西省中醫(yī)院肝病科就診的LC患者44例為研究對(duì)象，另選取健康志愿者10例為健康對(duì)照組。本研究經(jīng)山西省中醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)(No.省中醫(yī)倫字 2016-05006)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者經(jīng)臨床診斷、形態(tài)學(xué)診斷及影像學(xué)檢查確診均符合LC診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡18～70周歲，根據(jù)肝功能ALBI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為1、2、3級(jí)；②健康對(duì)照組人員年齡18～70歲，體格檢查、血尿常規(guī)、肝功能、腎功能均在正常范圍內(nèi)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①高血壓、糖尿病、肥胖、代謝綜合征及各種胃腸道疾病者；②受試者入組前2周內(nèi)系統(tǒng)使用過(guò)抗生素、微生態(tài)制劑及質(zhì)子泵抑制劑；③孕期及哺乳期婦女。

44例LC患者中肝郁脾虛證30例，濕熱內(nèi)蘊(yùn)證14例；3組人群的一般資料見(jiàn)表1。

表1 3組人群的一般資料比較

1.3 研究方法

1.3.1 糞便菌群檢測(cè) 留取受試者糞便標(biāo)本3～5 g，于排便后2 h內(nèi)收集在密閉的糞便儲(chǔ)存盒內(nèi)并置于-80℃冰箱冷凍，統(tǒng)一送至上海派森諾生物科技有限公司，提取糞便樣本總DNA，根據(jù)細(xì)菌16S rDNA V3-V5區(qū)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增(引物名稱338F/806R，前引物序列ACTCCTACGGGAGGCAGCA，后引物序列GGACTACHVGGGTWTCTAAT)，利用Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)Reads拼接，以97%的相似性將序列聚類成為操作分類單元(OTUs)并進(jìn)行物種注釋。

1.3.2 生物信息學(xué)分析 應(yīng)用MicrobiomeAnalyst平臺(tái)實(shí)現(xiàn)Alpha、Beta多樣性(采用PCoA方法結(jié)合bray-curtis距離)、物種組成、LEfse分析以及隨機(jī)森林模型預(yù)測(cè)。利用R語(yǔ)言3.6.1進(jìn)行UpSet韋恩圖分析、Spearman相關(guān)性分析。冗余分析(RDA)采用CANOCO5.0軟件。

1.3.3 菌群失衡度指標(biāo)(CDR、HBCDI)的計(jì)算 CDR=(毛螺菌科+瘤胃菌科+韋榮氏菌科+梭菌科XIV)相對(duì)豐度/(擬桿菌科+腸桿菌科)相對(duì)豐度[7]；HBCDI=(腸球菌屬+鏈球菌屬+乳桿菌屬)相對(duì)豐度/(瘤胃球菌屬+普氏菌屬+擬桿菌屬)相對(duì)豐度[8]。

1.3.4 臨床指標(biāo)檢測(cè) 受試者血液標(biāo)本在山西省中醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)，包括血肌酐(SCr)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白(Alb)、總膽紅素(TBil)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、凝血酶原時(shí)間(PT)。

1.3.5 腸屏障功能受損評(píng)估指標(biāo)的檢測(cè) 受試者血液標(biāo)本采用JY-DLT腸道屏障功能生物化學(xué)指標(biāo)分析系統(tǒng)檢測(cè)血清二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸(D-LA)及內(nèi)毒素 ETX)水平，按酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3.6 LC預(yù)后指標(biāo)計(jì)算 MELD=9.6×ln[Crc mg/dl)]+3.8×In[TBil(mg/dl)]+11.2×ln(INR)+6.4×病因(膽汁淤積性和酒精性LC為0，病毒等其他原因LC為1，結(jié)果取整數(shù))[9]。CTP將肝儲(chǔ)備功能分為A(5～6分)、B(7～10分)、C(11～15分)3級(jí)[10]。ALBI=0.66×log10[TBil(μmol/L)]-0.085×[Alb(g/L)][11]。

1.3.7 LSM檢測(cè) 應(yīng)用FibroScan 502(購(gòu)自法國(guó)愛(ài)科森公司)，探頭型號(hào)為Medium型測(cè)量LSM，以kPa表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的計(jì)量資料組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同中醫(yī)證型LC患者腸道菌群多樣性改變 本研究對(duì)所有鑒定的細(xì)菌OTUs進(jìn)行序列對(duì)比分析，結(jié)果顯示健康對(duì)照組、肝郁脾虛證組和濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組肝硬化患者腸道菌群的OTU數(shù)量存在明顯差別，3組人群中腸道菌群共有的OTU有1 999個(gè)；健康對(duì)照組和肝郁脾虛證組人群共有169個(gè)OTUs，健康對(duì)照組和濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組人群共有29個(gè)OTU，肝郁脾虛證組和濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組患者共有404個(gè)OTU；各組人群特有的OTUs個(gè)數(shù)分別為健康對(duì)照組27個(gè)，肝郁脾虛證組116個(gè)，濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組38個(gè)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組間UpSet韋恩圖及 PCoA圖 (左邊水平柱狀圖表示各分組的OTU統(tǒng)計(jì)數(shù)值，中間矩陣中的單個(gè)點(diǎn)表示某個(gè)分組特有的元素，點(diǎn)和點(diǎn)之間的連線表示不同分組特有的交集，豎直柱狀圖中則分別表示對(duì)應(yīng)的交集元素?cái)?shù)值)

結(jié)合OTUs所代表的物種，本研究共觀察到來(lái)自13個(gè)已知菌門的458個(gè)菌屬，3組人群中腸道菌群的菌屬數(shù)量存在明顯的差別，其中156個(gè)菌屬在3組人群中均出現(xiàn)，健康對(duì)照組特有菌屬48個(gè)，肝郁脾虛證組患者特有菌屬79個(gè)，濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組患者特有菌屬29個(gè)。

本研究應(yīng)用Alpha多樣性反應(yīng)腸道物種的豐富度和均勻度，包括 Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)。結(jié)果表明，各組間比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)見(jiàn)表2。β多樣性是度量不同組間的菌群組成與分布差異。使用Bray-Curtis指數(shù)評(píng)估健康對(duì)照組、肝郁脾虛證組和濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組人群之間的多樣性差異，置換多元方差分析(PERMANOVA)表明，3組人群的聚類差異顯著(P<0.05)。Bray-Curtis dissimilarity差異檢驗(yàn)R2=0.056，提示不同分組因素對(duì)腸道菌群差異的解釋度是5.6%。見(jiàn)圖2。

表2 不同中醫(yī)證型的肝硬化患者腸道菌群的Alpha多樣性指數(shù)

圖2 肝硬化不同中醫(yī)證型與健康人群腸道菌群的構(gòu)成變化 (A-C：門、屬、種水平上物種豐度組成柱狀圖)

2.2 不同中醫(yī)證型LC患者與健康人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)變化 為了獲悉組間不同樣本糞便腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)，研究以總序列百分比統(tǒng)計(jì)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同中醫(yī)證型LC患者腸道菌群分類學(xué)組成 (%)

2.3 不同中醫(yī)證型LC患者的腸道菌群失衡度 見(jiàn)表4。

表4 不同中醫(yī)證型LC患者間腸道菌群失衡度的差異(中位數(shù))

2.4 隨機(jī)森林預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建 隨機(jī)森林模型預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，門、綱、目、科、屬、種和OTUs水平構(gòu)建的隨機(jī)森林模型，袋外錯(cuò)誤率分別是57.4%、42.6%、40.7%、46.3%、44.4%、37.0%和38.9%，可以看出在種水平上構(gòu)建的模型顯示出63.0%的最佳預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度。見(jiàn)圖3。

圖3 所有腸道菌群物種在不同水平構(gòu)建的隨機(jī)森林預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確度

2.5 不同中醫(yī)證型LC患者的關(guān)鍵菌屬鑒定 根據(jù)β多樣性結(jié)果，3組受試人群的腸道微生物多樣性具有一定程度的差異，為了尋找造成腸道微生物多樣性差異的關(guān)鍵菌屬，本研究進(jìn)行LEfSe分析。利用線性判別分析(LDA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，并評(píng)估差異顯著的物種的影響力(即LDA score)，Score>2時(shí)，差異有顯著意義。見(jiàn)圖4。通過(guò)分析3組受試人群的生物標(biāo)志物的差異，發(fā)現(xiàn)屬水平上健康對(duì)照組受試者乳桿菌屬(Lactobacillus)、阿克曼菌屬相對(duì)豐度顯著增加；肝郁脾虛證患者組鏈球菌屬(Streptococcus)相對(duì)豐度顯著增加；濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組韋榮氏球菌屬(Veillonella)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)相對(duì)豐度顯著增加。進(jìn)一步對(duì)種水平的生物標(biāo)志物進(jìn)行分析，結(jié)果顯示健康對(duì)照組受試者腸道中青春雙歧桿菌、嗜黏蛋白阿克曼菌、普拉梭菌的相對(duì)豐度顯著增加；肝郁脾虛證組患者腸道中膠黏羅斯菌、黏膜乳桿菌、咽峽炎鏈球菌的相對(duì)豐度顯著增加；濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組患者腸道中脆弱擬桿菌、殊異韋榮球菌、副流感嗜血菌的相對(duì)豐度顯著增加。

圖4 各組間具有顯著差異的分類單元展示圖 (control為健康對(duì)照組，treat1為肝郁脾虛證組，treat2為濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組；圖A縱坐標(biāo)為各組間具有顯著差異的物種，橫坐標(biāo)則以條形圖展示對(duì)應(yīng)物種的LDA差異分析對(duì)數(shù)得分值，柱狀圖的長(zhǎng)度代表差異物種的影響大小(即為L(zhǎng)DA Score)；圖B分類等級(jí)樹(shù)展示了樣本群落中從門到屬(從內(nèi)圈到外圈依次排列)所有分類單元的等級(jí)關(guān)系，節(jié)點(diǎn)大小對(duì)應(yīng)于該分類單元的平均相對(duì)豐度。紅色、綠色、藍(lán)色節(jié)點(diǎn)分別表示在健康對(duì)照組、肝郁脾虛證組、濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組中起到重要作用的微生物類群)

2.6 不同中醫(yī)證型LC患者的相關(guān)菌屬與臨床指標(biāo)的相關(guān)性 見(jiàn)表5。

2.7 不同中醫(yī)證型LC患者間腸道群落變異的驅(qū)動(dòng)因子 RDA分析結(jié)果顯示TBil、PT、ETX是影響腸道細(xì)菌群落變異的主要臨床指標(biāo)。根據(jù)箭頭長(zhǎng)度可以看出TBil、PT與腸道菌群分布相關(guān)性較大，可以認(rèn)為TBil、PT是驅(qū)動(dòng)腸道群落變異的主要因子，其中TBil對(duì)群落變異的影響最具有顯著性(P=0.014)。見(jiàn)圖5。

圖5 腸道細(xì)菌群落及其變異驅(qū)動(dòng)的主要環(huán)境因子RDA雙向排序圖(環(huán)境因子一般用箭頭表示，箭頭連線的長(zhǎng)度代表某個(gè)環(huán)境因子與群落分布和種類分布間相關(guān)程度的大小，連線越長(zhǎng)，說(shuō)明相關(guān)性越大，反之越小)

3 討論

腸道菌群作為人體免疫和代謝的重要組成部分，對(duì)于中醫(yī)證型的形成有不容忽視的影響。目前已有不少學(xué)者探索了菌群與中醫(yī)證候之間的關(guān)系。本研究以44例LC患者及10例健康者為研究對(duì)象，首先對(duì)受試人群的生化指標(biāo)進(jìn)行分析。目前LC進(jìn)展及預(yù)后的主要評(píng)估指標(biāo)有LSM、ALBI、CTP及MELD等。MELD評(píng)分可對(duì)終末期肝病短期、中期死亡率進(jìn)行有效的預(yù)測(cè)，還可用于評(píng)估移植前患者等侯供肝期間的死亡率及肝移植術(shù)后的死亡率[9]。CTP是LC死亡最“穩(wěn)健”和敏感的預(yù)測(cè)因子，已被廣泛應(yīng)用于評(píng)估預(yù)后、指導(dǎo)治療、判斷藥物療效和疾病預(yù)后[10]。LSM在慢性肝病患者中具有診斷和評(píng)估肝臟壞死性炎癥最嚴(yán)重程度的潛力[12]，ALBI指數(shù)可用于肝癌及慢性肝病患者的進(jìn)展及預(yù)后評(píng)估[13,14]。研究結(jié)果顯示隨著中醫(yī)證型從肝郁脾虛證到濕熱內(nèi)蘊(yùn)證的轉(zhuǎn)化，LC患者TBil逐漸升高，PT延長(zhǎng)，Alb逐漸降低，LSM、CTP、MELD數(shù)值增加，ALBI指數(shù)降低，提示隨著病情的進(jìn)展，患者經(jīng)歷了從肝郁脾虛證到濕熱內(nèi)蘊(yùn)證的演變，且4種預(yù)后指標(biāo)在LC預(yù)后方面具有高度一致性。

腸道菌群具有促進(jìn)腸黏膜免疫系統(tǒng)生長(zhǎng)與發(fā)育和調(diào)控腸黏膜屏障與免疫功能的雙重作用。本研究選取DAO、D-LA及ETX作為腸屏障功能受損的評(píng)估指標(biāo)。DAO是腸黏膜上皮受損指標(biāo)，存在于小腸黏膜上皮細(xì)胞上且具有高度活性的酶，是反映腸道黏膜通透性和腸黏膜屏障功能狀態(tài)的敏感性指標(biāo)[15]。D-LA是腸黏膜通透性變化指標(biāo)，它是胃腸道多種細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，當(dāng)腸黏膜通透性增加時(shí)，腸道細(xì)菌產(chǎn)生的大量D-LA通過(guò)黏膜屏障進(jìn)入血液，D-LA水平隨之升高[16]，因此可作為細(xì)菌感染和腸通透性增加的可靠指標(biāo)。ETX由腸道革蘭氏陰性菌產(chǎn)生，是腸道菌群移位指標(biāo)，LC患者腸黏膜通透性增高，ETX通過(guò)受損的腸黏膜進(jìn)入血液，到達(dá)肝臟并激活庫(kù)普弗細(xì)胞，庫(kù)普弗細(xì)胞激活后產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)進(jìn)一步加重肝臟損傷[17]。ETX檢測(cè)可判斷腸屏障功能受損導(dǎo)致的內(nèi)毒素移位，ETX水平升高的程度 可反映出腸黏膜屏障損傷的程度[18]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康人群相比，LC患者DAO、D-LA及ETX水平升高，提示患者腸屏障功能受損。隨著LC肝郁脾虛證向濕熱內(nèi)蘊(yùn)證轉(zhuǎn)化，DAO、D-LA及ETX持續(xù)上升，提示LC疾病發(fā)展過(guò)程中腸屏障功能受損逐漸加重。與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致[19,20]。

在此基礎(chǔ)上，本研究對(duì)所有患者糞便中的微生物進(jìn)行16S rDNA的高通量測(cè)序技術(shù)，較系統(tǒng)、全面地分析了肝郁脾虛及濕熱內(nèi)蘊(yùn)LC患者和健康受試者的腸道菌群結(jié)構(gòu)變化情況。本研究中Alpha多樣性結(jié)果顯示，與健康人群相比，肝郁脾虛證和濕熱內(nèi)蘊(yùn)證患者多樣性有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。β多樣性結(jié)果提示，3組受試人群間具有顯著的微生物群落差異，其中有5.6%的原因是由不同分組因素導(dǎo)致的。

應(yīng)用OTU在門、屬和種分類水平上對(duì)3組受試者腸道菌群進(jìn)行分析，結(jié)果顯示3組受試者腸道菌群共有的OTU有1 999個(gè)，分屬于放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、梭桿菌門、變形菌門、藍(lán)藻門、互養(yǎng)菌門、軟皮菌門、疣微菌門、棲熱菌門、浮霉菌門、酸桿菌門和TM7等13個(gè)菌門，其中以厚壁菌門和放線菌門為腸道絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門。厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門含量從健康對(duì)照組、肝郁脾虛證組到濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組呈逐漸升高的趨勢(shì)，而放線菌門和疣微菌門呈逐漸下降的趨勢(shì)。本研究在屬分類上共鑒定出458個(gè)菌屬，各受試者組菌屬表現(xiàn)較大的差異性，健康對(duì)照組受試者特有菌屬48個(gè)，受試者肝郁脾虛證組患者特有菌屬79個(gè)，濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組患者特有菌屬29個(gè)。雙歧桿菌為3組受試人群腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌屬。這與之前文獻(xiàn)報(bào)道的擬桿菌屬是健康人和肝硬化患者中最豐富的細(xì)菌有所不同[10]。其中雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、艾克曼菌屬、糞桿菌屬豐度從健康對(duì)照組、肝郁脾虛證組到濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，鏈球菌屬呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。種水平上，嗜黏蛋白阿克曼菌、青春雙岐桿菌、狄氏副擬桿菌、普拉梭菌豐度從健康對(duì)照組、肝郁脾虛證組到濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，殊異韋榮球菌呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。這些結(jié)果提示LC病情的進(jìn)展是因?yàn)橹虏【倪^(guò)度增長(zhǎng)協(xié)同有益菌的缺乏，與我們前期研究結(jié)果一致[21]。因此定量評(píng)價(jià)各中醫(yī)證型LC患者間腸道菌群失調(diào)的程度是我們重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。既往研究中定量評(píng)價(jià)腸道菌群失衡程度的指標(biāo)如CDR和HBCDI在本研究中的健康對(duì)照組、LC肝郁脾虛證組及濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組間雖然逐漸加重，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CDR和HBCDI在LC中醫(yī)證型中評(píng)價(jià)腸道菌群失衡的效能不佳。考慮CDR和HBCDI系科和屬層面的失衡度指標(biāo)，具有一定的片面性和局限性，因此本研究在門、鋼、目、科、屬、種和OTU水平構(gòu)建隨機(jī)森林模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示在種水平上構(gòu)建的模型顯示出63.0%的最佳預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度。因此建立種水平上的菌群失衡指標(biāo)是下一步研究的重點(diǎn)。

本研究通過(guò)LEfSe判別分析分別篩選了肝郁脾虛證組和濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組患者區(qū)別于健康對(duì)照組人群的重要特征性菌群。屬水平上健康對(duì)照組受試者的特征性菌群為乳桿菌屬、艾克曼菌屬；肝郁脾虛證組患者的特征性菌群為鏈球菌屬，濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組患者的特征性菌群為韋榮氏球菌屬、嗜血桿菌屬。種水平上健康對(duì)照組受試者的特征性菌群為青春雙歧桿菌、嗜黏蛋白阿克曼菌、普拉梭菌；肝郁脾虛證組患者的特征性菌群為膠黏羅斯菌、黏膜乳桿菌、咽峽炎鏈球菌；濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組患者的特征性菌群為脆弱擬桿菌、殊異韋榮球菌、副流感嗜血菌。從以上結(jié)果可以看出LC患者腸道菌群的種類發(fā)生了特異性變化，且LC不同中醫(yī)證型的核心微生物具有明顯差別和聯(lián)系。進(jìn)一步的相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)殊異韋榮球菌與ALT、AST、TBil、PT及LC預(yù)后指標(biāo)MELD、CTP呈顯著正相關(guān)，與青春雙岐桿菌呈顯著負(fù)相關(guān)。殊異韋榮氏球菌寄生在人和動(dòng)物的口腔、腸道和呼吸道中，有研究發(fā)現(xiàn)在炎癥比較重的患者其表達(dá)明顯上調(diào)[22]。青春雙岐桿菌具有顯著的抗炎特性，可改變腸道微生物群落[23]。因此殊異韋榮球菌可能在LC中醫(yī)證型演變及病情發(fā)展中扮演了重要的角色，而調(diào)節(jié)青春雙歧桿菌的含量可有效控制疾病的進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)嗜粘蛋白阿克曼菌與LC預(yù)后指標(biāo)LSM、MELD呈負(fù)相關(guān)。普拉梭菌與狄氏副擬桿菌呈顯著正相關(guān)，與ETX呈負(fù)相關(guān)。腸道中嗜粘蛋白阿克曼菌的定植情況是機(jī)體健康水平的標(biāo)志之一，其依附腸道黏膜而生，可調(diào)節(jié)腸道內(nèi)黏液厚度和維持腸道屏障完整性[24]。因此腸道屏障的完整性在LC的發(fā)生發(fā)展中極其關(guān)鍵。普拉梭菌是存在于健康人群腸道中最豐富的的腸道微生物之一，具有抗炎及抑制致病菌的作用[25]。狄氏副擬桿菌具有廣泛的膽酸轉(zhuǎn)化功能，在糖脂代謝方面發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用[26]。因此狄氏副擬桿菌協(xié)助普拉梭菌對(duì)于抑制LC患者的腸道菌群移位具有重要的調(diào)節(jié)作用。

為了明確導(dǎo)致肝郁脾虛證和濕熱內(nèi)蘊(yùn)證患者間腸道群落變異的主要影響因子，本研究對(duì)兩種中醫(yī)證型間的環(huán)境因子做了RDA分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TBil對(duì)兩種證型間群落變異的影響最具有顯著性。血清膽紅素?cái)?shù)值與LC的預(yù)后獨(dú)立相關(guān)[27]，與LSM指數(shù)及患者肝損傷程度具有較大的相關(guān)性[28,29]。有研究發(fā)現(xiàn)TBil可改變腸道內(nèi)環(huán)境，使機(jī)體原籍優(yōu)勢(shì)菌的種類減少，誘發(fā)菌群失調(diào)[30]。《金匱要略》曰：“然黃家所得，從濕得之”，表明濕邪內(nèi)蘊(yùn)為黃疸發(fā)病的關(guān)鍵。現(xiàn)代醫(yī)家多認(rèn)為黃疸以濕熱多見(jiàn)，其發(fā)病規(guī)律為肝木濕陷，遏生發(fā)而克脾土，脾虛基礎(chǔ)上的濕熱壅盛合而致疸[31,32]。肝是黃疸之關(guān)鍵病位，熱為黃疸主要病性證素[33]。因此從肝郁脾虛證到濕熱內(nèi)蘊(yùn)證的轉(zhuǎn)化過(guò)程中，TBil是肝硬化疾病進(jìn)展的主要因素，也是腸道群落變異的主要驅(qū)動(dòng)因子。

綜上所述，LC患者從肝郁脾虛證到濕熱內(nèi)蘊(yùn)證的演變過(guò)程中，病情持續(xù)發(fā)展，腸屏障功能受損趨于嚴(yán)重，殊異韋榮球菌可能在中醫(yī)證型演變及病情發(fā)展中扮演了重要的角色，而調(diào)節(jié)青春雙歧桿菌的含量可有效控制疾病的進(jìn)展，狄氏副擬桿菌協(xié)助普拉梭菌對(duì)于抑制腸道菌群移位具有重要的調(diào)節(jié)作用。TBil是兩種中醫(yī)證型患者間腸道群落變異的主要驅(qū)動(dòng)因子。但由于本研究存在樣本量較小、分組不均衡等問(wèn)題，后續(xù)研究需要進(jìn)一步完善。