脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞聚合物-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合物補(bǔ)片修復(fù)兔外耳道全層皮膚損傷的實驗研究

馬洪峰，任慶，鄭末，程萬民，廉梅

天津市第五中心醫(yī)院（北京大學(xué)濱海醫(yī)院）1.耳鼻咽喉科，2.病理科，天津 300450

耳道皮膚缺損常發(fā)生于顳骨及其軟骨組織的外科手術(shù)后，創(chuàng)面上皮自我修復(fù)緩慢，致使患耳溢液難以清除，需定期清理痂皮[1]。由于耳道結(jié)構(gòu)以及耳腔的空間有限，加上飲食等因素影響，耳道皮膚缺損可能給患者帶來不容忽視的聽力障礙，影響患者的術(shù)后生活質(zhì)量[2]。因此，國內(nèi)外學(xué)者致力于尋找適合外耳道皮膚重建、乳突腔修復(fù)的生物學(xué)材料，不斷加深對術(shù)腔上皮化機(jī)制的認(rèn)知[3]。組織工程技術(shù)的日新月異推動支持顳骨上皮皮膚結(jié)構(gòu)與功能恢復(fù)的生物材料的發(fā)展。來源廣泛、具有較強(qiáng)分化和增殖潛能的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）成為組織工程學(xué)、再生醫(yī)學(xué)學(xué)科中最具前景的種子細(xì)胞之一。研究表明ADSCs 分泌的蛋白因子直接促進(jìn)創(chuàng)面組織的再生和愈合；ADSCs 在異體組織移植中可降低異體宿主的免疫排斥反應(yīng)，縮短治療時間[4～6]。細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）支架因其具有穩(wěn)定的機(jī)械張力，便于手術(shù)操作，降解過程的可控性，以及無毒性和免疫原性等優(yōu)點[7]，成為組織工程支架中廣泛應(yīng)用的材料。研究顯示ECM 支架能夠促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖，促進(jìn)血管新生及創(chuàng)面愈合[8]。已經(jīng)證實ECM 支架能模擬體內(nèi)微環(huán)境，抑制細(xì)菌滋生，調(diào)節(jié)、引導(dǎo)宿主細(xì)胞長入，推動創(chuàng)面組織重構(gòu)，縮短組織再生及皮膚缺損修復(fù)的時間[9]。本文探討脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞聚合物（adipose-derived stem cell aggregates，ADSC aggregates）-細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）復(fù)合物補(bǔ)片（ADSC aggregates-ECM）在外耳道全層皮膚損傷修復(fù)中的應(yīng)用，期為臨床治療提供新的角度。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4～5 月齡SPF 級健康雄性新西蘭大白兔30 只，體重2.25～2.35 kg，來源于天津裕達(dá)實驗動物繁育有限公司[SCXK（津）2016-0001]，飼養(yǎng)于天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院[SYXK（津）2017-0003]，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料、自由飲水適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后用于實驗。實驗經(jīng)本院實驗動物管理倫理委員會批準(zhǔn)（IACUC-2020-028），操作均參照本院動物管理委員會有關(guān)規(guī)定進(jìn)行，在3R 原則的指導(dǎo)下給與動物人道的關(guān)懷。

1.1.2 主要試劑與儀器 ADSC aggregates-ECM（批號TJ-ARN004）、ECM 支架（批號TJ-TBF057）由天津再生醫(yī)學(xué)與疾病生物治療研究中心設(shè)計完成；免疫組化試劑盒（批號GTY-2018-UY763，美國Gibco 公司）；兔抗大鼠GAPDH（批號VCS-2019-FA095，美國abcam 公司）；HE 試劑盒（批號RX-2019-EV7D08，美國Sigma公司）；Western blot 試劑盒（批號JS-2020-MR97，南京建成生物有限公司）。凝膠成像儀（UV-D6.0，島津公司，日本）；組織切片機(jī)（PVT-6.8，SHELLAB 公司，美國）；熒光顯微鏡（LIOOS600T，尼康公司，日本）；高速低溫離心機(jī)（FUB-98A，北京六一儀器廠，中國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 外耳道內(nèi)壁全層皮膚缺損模型構(gòu)建[10]新西蘭大白兔耳腹側(cè)耳根處備皮，碘伏消毒，切開外耳道皮膚、肌肉以及彈性軟骨，暴露外耳道內(nèi)壁皮膚，Miltex活檢打孔器鉆開直徑為2 cm 的創(chuàng)面缺損，每只動物構(gòu)建1 個創(chuàng)面。

1.2.2 分組處理 將兔隨機(jī)分為3 組，空白組、對照組、實驗組，每組10 只，進(jìn)行處理前，先在實驗動物的創(chuàng)面正下方的外耳道墊以無菌明膠海綿，保持明膠海綿的邊緣與創(chuàng)面邊緣相平，對照組動物通過內(nèi)植法將ECM 支架鋪于明膠海綿與創(chuàng)面邊緣之間，實驗組則將ADSC aggregates-ECM 支架鋪于明膠海綿與創(chuàng)面邊緣之間，確保支架完全覆蓋創(chuàng)面?？瞻捉M不做處理。以自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料單籠飼養(yǎng)各組實驗動物。

1.2.3 創(chuàng)面愈合觀察 術(shù)后14 d 使用數(shù)碼相機(jī)拍照，裸眼觀察各組創(chuàng)面組織的愈合情況：創(chuàng)面顏色、有無滲出、新生上皮覆蓋等。圖像分析軟件HVviewing8.0統(tǒng)計各組的創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率[11]＝［（造模創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/造模創(chuàng)面面積］×100%。

1.2.4 創(chuàng)面組織形態(tài)學(xué)改變 14 d 后從各組實驗動物的創(chuàng)面組織中心取創(chuàng)面范圍內(nèi)的表層皮膚，常規(guī)方法采集創(chuàng)面組織，迅速轉(zhuǎn)至-80℃深冷冰箱中獨立保存待測。將創(chuàng)面組織用5%甲醛固定，常規(guī)制片，HE、Masson 染色，二甲苯處理，切片透明后，使用顯微鏡觀察創(chuàng)面組織的形態(tài)學(xué)變化：膠原蛋白及上皮組織再生、炎癥細(xì)胞浸潤等情況。

1.2.5 創(chuàng)面組織細(xì)菌菌落陽性比例比較 取創(chuàng)面組織，解剖剪剪成微小顆粒，攪拌勻漿后，稀釋至1 000倍，取1 mg 稀釋液接種于Mueller-Hinton agar 培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，室溫靜置24 h，顯微鏡下觀察，統(tǒng)計培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，并換算成每克樣品中細(xì)菌菌落數(shù)（colony forming units/gram，cfu/g），cfu/g≥105為陽性結(jié)果，cfu/g＜105為陰性結(jié)果[12]。

1.2.6 免疫組化檢測創(chuàng)面組織中細(xì)胞核增殖抗原（proliferating cell nuclear antigen，Ki67）表達(dá) 創(chuàng)面組織用10%聚甲醛固定2 h，脫水，透明，浸蠟后切片，以枸櫞酸鈉緩沖液進(jìn)行高溫抗原修復(fù)后，雙氧水封閉，PBS 沖洗后，加入一抗（1：500），4℃孵育過夜，次日加入二抗（1：2 000），二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色，蘇木素染核，清洗、脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察，目的蛋白在胞質(zhì)中呈棕褐色[13]。

1.2.7 免疫印跡實驗（Western blot）檢測創(chuàng)面組織中炎性因子白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達(dá) 取創(chuàng)面組織，常規(guī)裂解、勻漿、離心后，測定蛋白濃度，電泳分離，轉(zhuǎn)模、封閉，滴加一抗（均為1：500），4℃孵育過夜，次日清洗后加入二抗（均為1：1 000），顯色，凝膠成像儀下讀取各條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0，作圖工具采用Graphpad 5.01，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示符合正態(tài)分布的計量資料，多組間比較采用單因素分析，兩兩比較采用t檢驗；計數(shù)資料以百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05 表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面愈合大體觀察以及創(chuàng)面愈合率

如圖1 所示，術(shù)后14 d 實驗動物創(chuàng)面均有不同程度的愈合，但實驗組創(chuàng)面愈合的程度明顯好于對照組、空白組。與空白組相比，實驗組、對照組動物的創(chuàng)面愈合率明顯升高（P＜0.05），與對照組相比，實驗組動物的創(chuàng)面愈合率明顯升高（P＜0.05）。

圖1 兔外耳道內(nèi)壁皮膚創(chuàng)面大體觀察以及創(chuàng)面愈合率比較A：空白組B：對照組C：實驗組* P＜0.05，與空白組相比 #P＜0.05，與對照組相比Fig.1 General observation of wounds in each group and the comparison of wound healing rate of external auditory canal in rabittsA: Blank group; B: Control group; C: Experimental groupCompared with the blank group,*P＜0.05;Compared with the control group,#P＜0.05

2.2 創(chuàng)面組織形態(tài)學(xué)改變

HE 染色結(jié)果顯示，空白組創(chuàng)面的皮膚組織層次較為單一，雖有大量的血管新生，炎性細(xì)胞填充較多，但未見明顯的復(fù)層結(jié)構(gòu)；對照組創(chuàng)面新生血管的數(shù)量明顯增多，皮膚的復(fù)層結(jié)構(gòu)已開始出現(xiàn)，創(chuàng)面與正常組織間的交界分明，皮膚細(xì)胞的層數(shù)較少；實驗組的創(chuàng)面組織與正常組織的交界模糊，兩者相互延續(xù)，基底細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)比較正常，炎性細(xì)胞浸潤程度明顯好轉(zhuǎn)，并可見較為明顯的類似真皮層的結(jié)構(gòu)，見圖2。

圖2 創(chuàng)面皮膚HE 染色結(jié)果A：空白組 創(chuàng)面皮膚層次單一，炎性浸潤豐富B：對照組 創(chuàng)面新生血管數(shù)量增多，皮膚出現(xiàn)復(fù)層結(jié)構(gòu)C：實驗組 創(chuàng)面炎性浸潤明顯減少，皮膚分層趨于正常Fig.2 Result of wounds HE stainingA: Blank group,the wounds had a single skin layer and abundant inflammatory infiltration; B: Control group,the number of new blood vessels on the wounds increased,and the skin appeared multi-layered structure; C: Experimental group the inflammatory infiltrations of the wounds were significantly reduced,and the skin layering tended to be normal

Masson 染色結(jié)果顯示，空白組創(chuàng)面組織膠原沉積較少，膠原纖維排列松散；對照組創(chuàng)面組織膠原沉積明顯增多，但膠原纖維存在較為明顯的斷裂，排列較為稀疏；實驗組創(chuàng)面組織膠原沉積的量明顯較前兩組增多，且膠原纖維排列較為整齊，成簇狀的膠原纖維質(zhì)地較為緊密，部分創(chuàng)面已與正常組織交聯(lián)融匯一起，見圖3。

圖3 創(chuàng)面皮膚Masson 染色結(jié)果A：空白組創(chuàng)面組織膠原纖維排列松散B：對照組創(chuàng)面組織膠原纖維斷裂明顯，排列較稀疏C：實驗組創(chuàng)面組織膠原沉積的量明顯較前兩組增多，膠原纖維排列較整齊Fig.3 Result of wounds Masson stainingA: Blank group,the collagen fibers in the wound tissue were arranged loosely; B: Control group,the collagen fibers in the wound tissue were broken and arranged relatively sparsely; C: Experimental group,the amount of collagen deposition in the wound tissue was significantly higher than that of the first two groups,and the collagen fibers were arranged more neatly

2.3 各組創(chuàng)面組織細(xì)菌菌落陽性比例比較

與空白組相比，對照組、實驗組創(chuàng)面的細(xì)菌菌落計數(shù)≥105cfu/g，檢出率明顯降低（P＜0.05），與對照組相比，實驗組創(chuàng)面的細(xì)菌菌落計數(shù)≥105cfu/g，檢出率明顯降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組創(chuàng)面組織細(xì)菌菌落陽性比例比較A：空白組 B：對照組 C：實驗組 *P＜0.05，與空白組相比 #P＜0.05，與對照組相比Fig.4 Comparison of the positive ratio of bacterial colonies in wound tissuesA: Blank group; B: Control group; C: Experimental groupCompared with the blank group,*P＜0.05;Compared with the control group,#P＜0.05

2.4 創(chuàng)面組織中Ki67 表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，與空白組相比，對照組、實驗組創(chuàng)面的Ki67 陽性細(xì)胞比例明顯升高（P＜0.05），與對照組相比，實驗組Ki67 陽性細(xì)胞比例明顯升高（P＜0.05），見圖5。

圖5 創(chuàng)面皮膚免疫組化染色結(jié)果及統(tǒng)計圖A：空白組B：對照組Ki67 陽性細(xì)胞比例明顯高于空白組C：實驗組Ki67 陽性細(xì)胞比例明顯高于對照組*P＜0.05，與空白組相比 #P＜0.05，與對照組相比Fig.5 Result of wounds immunohistochemical staining and statistical diagram A: Blank group; B: Control group,the proportion of Ki67-positive cells in the wounds was significantly higher than that of the blank group; C: Experimental group,the proportion of Ki67-positive cells in the was significantly higher than that of the control group Compared with the blank group *P＜0.05.Compared with the control group,#P＜0.05.

2.5 各組創(chuàng)面組織中IL-1β、TNF-α 表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示，與空白組相比，對照組、實驗組創(chuàng)面組織中IL-1β、TNF-α 的表達(dá)明顯下降（P＜0.05）；與對照組相比，實驗組創(chuàng)面組織中IL-1β、TNFα 的表達(dá)明顯下降（P＜0.05），見圖6。

圖6 各組創(chuàng)面組織中IL-1β、TNF-α 表達(dá)條帶以及含量分析A：空白組B：對照組C：實驗組*P＜0.05，與空白組相比 #P＜0.05，與對照組相比Fig.6 Expression band and content analysis of IL-1β and TNF-α in wound tissues of each group A: Blank group; B: Control group; C: Experimental groupCompared with the blank group,*P＜0.05;Compared with the control group,#P＜0.05

3 討論

通常耳部手術(shù)觸及顳骨或其軟骨組織，容易導(dǎo)致外耳道、乳突等骨面暴露，形成顳骨上皮缺損，患者該部位創(chuàng)面的自行愈合程度取決于顳骨裸露創(chuàng)面的上皮化水平，研究顯示耳道上皮的增殖及分化進(jìn)程較慢，加之術(shù)腔氣流量以及空氣中細(xì)菌感染的影響，此類患者往往需要進(jìn)行術(shù)腔重建，以加快創(chuàng)面愈合[14]。自體游離皮膚、生物陶瓷顆粒、自體骨質(zhì)碎屑以及局部帶蒂皮瓣等材料均被耳科學(xué)家用于臨床術(shù)腔上皮修復(fù)和乳突腔重建；盡管使部分患者獲得較好的恢復(fù)，但由于感染、排斥反應(yīng)以及殘渣堆積，或者創(chuàng)面未能獲取足夠的血供等，不適宜在臨床推廣應(yīng)用[15]。組織工程是將工程學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生命科學(xué)、材料學(xué)的原理與技術(shù)相結(jié)合，建立具有生物活性的細(xì)胞-生物-材料的三維復(fù)合體，在盡量降低免疫原性的條件下將此復(fù)合體用于修復(fù)或促進(jìn)人體器官或組織損傷后功能和結(jié)構(gòu)生物替代物的綜合學(xué)科[16]。近年來組織工程技術(shù)被視為皮膚修復(fù)或再生的最有希望的途徑。李劍等[17]研究證實較為成熟的組織工程皮膚表皮膜片用于治療穩(wěn)定期的白癜風(fēng)，療效顯著，安全性較好，值得臨床推廣。關(guān)于外耳道皮膚修復(fù)的組織工程尚在實驗室研究階段[18]。鑒于耳道以及人體顳骨上皮的結(jié)構(gòu)和功能的特殊性，組織工程學(xué)家曾將角質(zhì)細(xì)胞膜片、口腔粘膜非角化細(xì)胞膜片以及脫細(xì)胞真皮基質(zhì)等上皮細(xì)胞引入術(shù)腔上皮重建中，均顯示了明顯縮短上皮化時間，抗感染、干耳快、術(shù)后復(fù)發(fā)率低等優(yōu)點，取得良好的臨床療效[19]。但由于上皮細(xì)胞來源有限、培養(yǎng)難度較高，且上皮膜片質(zhì)地脆性偏高，致使轉(zhuǎn)移操作困難，創(chuàng)面成功率難以控制，迫使該技術(shù)尋找理化性能穩(wěn)定、促進(jìn)顳骨上皮皮膚結(jié)構(gòu)與功能恢復(fù)、便于細(xì)胞定植的上皮修復(fù)生物復(fù)合材料[20]。

選擇合適的種子細(xì)胞以及生物支架是耳部皮膚組織工程亟待解決的問題[21]。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）可被誘導(dǎo)產(chǎn)生多向分化潛能，其來源豐富、體外擴(kuò)增技術(shù)成熟、免疫原性低，還具有促進(jìn)膠原蛋白分泌，促進(jìn)表皮細(xì)胞再生，促進(jìn)愈合等功能，使ADSCs 成為皮膚組織工程中最為優(yōu)秀的種子細(xì)胞[22]。Li 等[23]研究表明ADSCs 在促進(jìn)口腔皮膚創(chuàng)面愈合以及再生方面具有良好的療效和安全性。作為細(xì)胞支架，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）能夠以細(xì)胞自身為內(nèi)源性支架，在保留細(xì)胞與細(xì)胞間連接的同時，將細(xì)胞均勻分散于細(xì)胞三維空間，細(xì)胞穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)免受機(jī)械損傷，更能保留細(xì)胞的生物學(xué)功能。同時作為天然、可降解的生物學(xué)材料，ECM 較強(qiáng)的可塑性，能夠保障將創(chuàng)面完全覆蓋，抑制炎性因子表達(dá)等多種優(yōu)勢。ECM 支架已在燒傷、器官重建以及整形美容中廣泛應(yīng)用[24]。但未見有將ADSCs 和ECM 用于耳部皮膚修復(fù)的研究報道。

本研究構(gòu)建兔外耳道內(nèi)壁全層皮膚缺損模型，實驗組以ADSC aggregates-ECM 平鋪創(chuàng)面進(jìn)行修復(fù)，14 d 后，與空白組相比，實驗組的創(chuàng)面愈合率明顯較高，創(chuàng)面抗菌效果良好，創(chuàng)面組織病理良好，膠原蛋白成簇狀分布；免疫組化結(jié)果顯示實驗組創(chuàng)面組織中Ki67 的表達(dá)明顯增強(qiáng)，上皮細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)。Western blot 結(jié)果顯示實驗組創(chuàng)面組織中炎性因子的表達(dá)明顯下調(diào)。

綜上所述，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞聚合物-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合物補(bǔ)片能明顯促進(jìn)兔外耳道內(nèi)壁全層皮膚缺損的修復(fù)，但如何將這種組織工程技術(shù)應(yīng)用于臨床，尚需深入研究其治療的穩(wěn)定性、療效的重復(fù)性。