低溫冷鏈貯藏對(duì)魚糜凝膠化學(xué)作用力和肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)及功能特性的影響

陳 旭，余璐涵，蔡茜茜，吳金鴻，劉永樂，黃建聯(lián)，汪少蕓,*

（1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108；2.福建省冷凍調(diào)理水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361022；3.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200204；4.長(zhǎng)沙理工大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410114；5.安井食品集團(tuán)股份有限公司，福建 廈門 361022）

魚糜的凝膠特性是魚糜最重要的功能特性，與魚糜中肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。肌原纖維蛋白是一種鹽溶性蛋白，由肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白等多種蛋白組成，是魚糜的主要成分[1]。在魚糜凝膠化過程中，肌原纖維蛋白相互聚集、交聯(lián)，形成連續(xù)基質(zhì)并逐漸形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[2]。

低溫冷鏈貯藏是一種被廣泛接受的水產(chǎn)保鮮方法，工業(yè)生產(chǎn)中通常以冷藏（4 ℃）、凍藏（-18 ℃）和超低溫（-35 ℃）速凍進(jìn)行水產(chǎn)品保鮮。冷凍貯藏通過抑制水產(chǎn)品內(nèi)源酶活性、微生物的生長(zhǎng)和脂質(zhì)氧化達(dá)到延長(zhǎng)貨架期的作用[3]。為了保持魚糜的質(zhì)量和擴(kuò)大銷售范圍，魚糜通常是在低溫冷鏈凍藏條件下貯藏、運(yùn)輸和銷售[4]，但在實(shí)際生產(chǎn)運(yùn)輸過程中，環(huán)境溫度波動(dòng)引起的反復(fù)凍融嚴(yán)重影響魚糜的質(zhì)地和凝膠性能[5]，冷凍導(dǎo)致的肌原纖維蛋白冷凍變性以及冷凍誘導(dǎo)冰晶重結(jié)晶導(dǎo)致蛋白變性的協(xié)同作用，對(duì)魚糜肌原纖維蛋白質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響，進(jìn)而引起魚糜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、感官特性和安全性降低[6]。此外，凍藏過程中蛋白質(zhì)的氧化也是影響魚糜質(zhì)地品質(zhì)的重要因素[7]，Li Deyang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量減少、β-轉(zhuǎn)角含量增加，過度氧化會(huì)降低魚糜凝膠的力學(xué)性能，使魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)疏松多孔。魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)主要通過離子鍵、氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵等相互作用來維持[9]，有研究表明魚糜中變性的肌原纖維蛋白不能形成凝膠[10]。為進(jìn)一步探究魚糜肌原纖維蛋白在低溫冷鏈貯藏溫度下的變化以及肌原纖維蛋白與形成魚糜凝膠化學(xué)作用力之間的關(guān)系，本研究通過凍融循環(huán)的方式模擬了低溫冷鏈貯藏流通過程中的溫度變化，旨在探究低溫冷鏈對(duì)魚糜肌原纖維蛋白和凝膠化學(xué)作用力的影響，為魚糜在低溫冷鏈貯藏過程中的品質(zhì)保持提供基礎(chǔ)理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活草魚（Ctenopharyngodon idella）（魚體質(zhì)量1.25～1.50 kg、長(zhǎng)度40～50 cm）購(gòu)自福州永輝超市永嘉天地店。超微量ATP酶（Ca2+-ATPase）、羰基檢測(cè)試劑盒南京建成生物工程研究所有限公司；其他藥品與試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T18型數(shù)碼均質(zhì)機(jī) 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；SpectraMax i3x型多功能酶標(biāo)儀 美谷分子儀器上海有限公司；Fluoromax-4型熒光光譜儀 法國(guó)Horiba Instrument公司；Invia Reflex型激光纖維拉曼光譜儀英國(guó)Renishaw公司。

1.3 方法

1.3.1 魚糜制備

參照文獻(xiàn)[11]的方法并稍作修改。新鮮草魚經(jīng)前處理后于絞肉機(jī)中絞碎；加入5 倍（m/V）超純水，控制水溫2～4 ℃，慢速攪拌10 min，10 000 r/min、4 ℃下離心10 min，取沉淀重復(fù)上述操作，然后將沉淀加入5 倍體積0.15 g/100 mL NaCl溶液慢速攪拌10 min，10 000 r/min、4 ℃下離心15 min，所得沉淀即為魚糜樣品，將制得的魚糜樣品分裝后置于4 ℃（冷藏）、-18 ℃（冷凍）、-35 ℃（速凍）冰箱中貯藏備用。

1.3.2 魚糜凝膠制備

將1.3.1節(jié)魚糜樣品放入研缽中空斬2 min，然后按照添加魚糜質(zhì)量3%的NaCl斬拌3 min，即為魚糜溶膠。將魚糜溶膠注入圓柱形模具中，并用保鮮膜封緊，采用二段加熱法，先在40 ℃水浴鍋中凝膠化30 min，然后迅速轉(zhuǎn)移入90 ℃水浴鍋中凝膠化30 min，最后立即置于冰水中冷卻20 min備用，即為魚糜凝膠。

1.3.3 魚糜凝膠低溫貯藏

參照文獻(xiàn)[11]的方法并稍作修改。第0天魚糜凝膠樣品不做冷凍處理直接進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)測(cè)定。其余魚糜凝膠樣品分別在4、-18、-35 ℃下貯藏3、6、9、12、15、18 d取樣解凍（25 ℃保溫2 h）。以溫度-貯藏時(shí)間形式命名樣品（例：4-3為4 ℃下貯藏3 d）。

1.3.4 魚糜肌原纖維蛋白的提取

參考文獻(xiàn)[12]的方法并稍作修改。取2 g魚糜樣品，按照料液比1∶10（m/V）加入4 ℃、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含50 mmol/L KC1、pH 7），充分勻漿，然后在10 000 r/min、4 ℃下離心10 min，洗去殘留在魚糜樣品中的水溶性蛋白。棄去上清液后，按照料液比1∶10（m/V）在沉淀中加入20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含0.6 mol/L KC1、pH 7），充分勻漿，并在4 ℃提取1 h，然后在10 000 r/min、4 ℃下離心10 min，所得上清液為肌原纖維蛋白溶液。

1.3.5 鹽溶性蛋白含量測(cè)定

參考文獻(xiàn)[12]的方法并稍作修改。將1.3.4節(jié)肌原纖維蛋白溶液用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含50 mmol/L KCl、pH 7）稀釋10 倍。吸取0.5 mL后采用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量即鹽溶性蛋白含量，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)樣品測(cè)定3 次，結(jié)果取平均值。

1.3.6 Ca2+-ATPase活力測(cè)定

參照超微量ATP酶（Ca2+-ATPase）試劑盒說明書測(cè)定不同低溫冷鏈貯藏條件下肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase活力。

1.3.7 總巰基含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[13]的方法并稍作修改。取0.5 mL 1.3.4節(jié)肌原纖維蛋白溶液加入到4.5 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 6.8，含8 mol/L尿素、2%十二烷基硫酸鈉和10 mmol/L乙二胺四乙酸）中。向上述混合液加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)溶液，渦旋振蕩混勻，40 ℃下精確保溫25 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定412 nm波長(zhǎng)處吸光度?？瞻捉M不加樣品溶液，加入等體積20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含0.6 mol/L KCl、pH 7）?？値€基含量以蛋白質(zhì)量計(jì)，單位為mol/g。

1.3.8 羰基含量測(cè)定

參照羰基檢測(cè)試劑盒說明書測(cè)定不同低溫冷鏈貯藏條件下肌原纖維蛋白的羰基含量，結(jié)果以蛋白質(zhì)量計(jì)，單位為nmol/mg。

1.3.9 魚糜肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的拉曼光譜分析

參考文獻(xiàn)[14]的方法并稍作修改，采用激光顯微拉曼光譜儀測(cè)定，設(shè)置參數(shù)為：激發(fā)波長(zhǎng)785 nm，掃描范圍400～3 200 cm-1。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.10 魚糜肌原纖維蛋白的熒光光譜分析

參考文獻(xiàn)[15]的方法并稍作修改。取1.3.4節(jié)肌原纖維蛋白溶液用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含0.6 mol/L KCl、pH 7）稀釋至質(zhì)量濃度為1 mg/mL，以20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含0.6 mol/L KCl、pH 7）作為空白，采用Fluoromax-4熒光光譜儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。設(shè)定參數(shù)為：激發(fā)波長(zhǎng)295 nm，狹縫寬度5 nm，掃描波長(zhǎng)310～380 nm，掃描速率10 nm/s，響應(yīng)時(shí)間0.5 s。每個(gè)樣品重復(fù)掃描3 次。

1.3.11 魚糜凝膠化學(xué)作用力分析

參考文獻(xiàn)[16]的方法并稍作修改。取2 g魚糜凝膠分別與20 mL 0.05 mol/L NaCl溶液（SA反應(yīng)液）、0.6 mol/L NaCl溶液（SB反應(yīng)液）、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素溶液（SC反應(yīng)液）和0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素溶液（SD反應(yīng)液）混合，均質(zhì)90 s后，4 ℃放置1 h，然后10 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集上清液。采用雙縮脲法測(cè)定上述上清液和1.3.4節(jié)肌原纖維蛋白溶液的蛋白質(zhì)含量（以540 nm處的吸光度表示），凝膠中蛋白質(zhì)分子間的非特異性相互作用（除氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用和二硫鍵等的其他作用力）相對(duì)含量以SA溶液與肌原纖維蛋白溶液中蛋白質(zhì)含量的比值表示；魚糜凝膠中離子鍵、氫鍵和疏水相互作用相對(duì)含量分別以SB溶液與SA溶液中蛋白質(zhì)含量的差值、SC溶液與SB溶液蛋白質(zhì)含量差值、SD溶液與SC溶液蛋白質(zhì)含量的差值與肌原纖維蛋白溶液中蛋白質(zhì)含量的比值表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 9.0軟件作圖，采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。利用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行主成分分析，利用Peakfit 4.12軟件進(jìn)行拉曼光譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚糜鹽溶性蛋白含量的變化

肌原纖維蛋白是魚糜在低溫冷鏈貯藏過程中變性的主要成分。凍藏過程中，冰晶的生長(zhǎng)促使肌原纖維蛋白分子之間形成非共價(jià)鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)鏈大量聚集，形成不溶性大分子凝集體，使其鹽溶性下降[17]。而蛋白質(zhì)的功能性如凝膠特性、流變學(xué)特性等加工特性只有在高溶解度狀態(tài)下才能表現(xiàn)出[18]。如圖1所示，不同低溫冷鏈貯藏溫度下的鹽溶性蛋白含量均隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，且在4、-18、-35 ℃貯藏前3 d鹽溶性蛋白含量下降較為迅速，第3天時(shí)由初始的194.90 mg/g分別下降至144.15、63.82、43.36 mg/g，隨后則基本趨于平緩，這是由于貯藏過程中冰晶的形成以及重結(jié)晶導(dǎo)致蛋白質(zhì)脫水，從而降低了蛋白質(zhì)的可提取性[19]。此外，-18、-35 ℃貯藏條件下鹽溶性蛋白含量沒有明顯差別。Coombs等[20]認(rèn)為蛋白溶解度降低是由于在貯藏過程中肌原纖維蛋白間氫鍵、鹽鍵、二硫鍵、疏水相互作用發(fā)生改變，導(dǎo)致內(nèi)部分子間規(guī)則空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。鹽溶性蛋白含量的變化可以看作冷凍變性的初級(jí)指標(biāo)，不能準(zhǔn)確得知蛋白質(zhì)的變性程度。

圖1 不同低溫冷鏈溫度貯藏期間魚糜鹽溶性蛋白含量的變化Fig. 1 Changes in salt-soluble protein content in surimi during cold chain storage at different temperatures

2.2 魚糜肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力的變化

肌球蛋白球狀頭部的Ca2+-ATPase活力對(duì)冷凍貯藏過程中蛋白質(zhì)完整性的變化十分敏感，其活力越低表示肌球蛋白完整性受到破壞的程度越嚴(yán)重[21]。如圖2所示，不同低溫冷鏈貯藏溫度下的Ca2+-ATPase活力均隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，且在前3 d Ca2+-ATPase活力下降較快，而后逐漸趨于平緩，與Jiang Longfa等[22]研究結(jié)果相似。在4、-18、-35 ℃冷凍貯藏15 d后，Ca2+-ATPase活力分別由最初的0.956 U/mg下降至0.586、0.615、0.628 U/mg，且貯藏溫度越低，Ca2+-ATPase活力越高，蛋白質(zhì)保留越完整，這是因?yàn)樵诘蜏乩滏溬A藏過程中冰晶的形成、生長(zhǎng)以及重結(jié)晶引起肌球蛋白頭部構(gòu)象變化[17]，蛋白質(zhì)之間通過相互作用發(fā)生重排形成不溶性大分子聚集體，導(dǎo)致Ca2+-ATPase失活，而-35 ℃凍藏過程中形成的冰晶較小，從而保護(hù)了蛋白質(zhì)構(gòu)象。

圖2 不同溫度貯藏期間肌原纖維蛋白Ca2＋-ATPase活力的變化Fig. 2 Changes in Ca2+-ATPase activity of myofibrillar protein during cold chain storage at different temperatures

2.3 魚糜肌原纖維蛋白總巰基含量的變化

半胱氨酸中的巰基對(duì)魚糜冷凍貯藏過程中肌原纖維蛋白活性氧氧化修飾十分敏感，巰基作為重要的功能性基團(tuán)對(duì)于維持蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以及功能性質(zhì)具有重要意義[17]，而巰基的氧化通常被認(rèn)為是蛋白質(zhì)氧化的最初反應(yīng)之一，因此巰基含量變化可用于檢測(cè)蛋白質(zhì)初期結(jié)構(gòu)的變化?？値€基包括活性巰基和包埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的巰基[23]，活性巰基易在凍藏過程中被氧化形成二硫鍵。如圖3所示，在低溫冷鏈貯藏過程中，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，總巰基含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，貯藏前6 d，總巰基含量下降較為迅速而后則逐漸趨于平緩，在4、-18、-35 ℃貯藏15 d后，總巰基含量分別由最初的9.768×10-5mol/ g明顯下降至5.635×10-5、6.086×10-5、6.741×10-5mol/g，這是因?yàn)橛坞x的活性巰基發(fā)生氧化反應(yīng)生成二硫鍵，造成總巰基含量的減少[24]，而后期下降速率趨于平緩是因?yàn)榈蜏乩滏溬A藏過程中蛋白質(zhì)氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象變化而引起蛋白質(zhì)分子的聚集，巰基被包埋在分子內(nèi)部，較難被氧化[25]。

圖3 不同溫度貯藏期間肌原纖維蛋白總巰基含量的變化Fig. 3 Changes in total sulfhydryl content in myofibrillar protein during storage at different temperatures

2.4 魚糜肌原纖維蛋白羰基含量的變化

魚糜冷凍貯藏過程中，常常伴隨著蛋白質(zhì)的氧化變性，蛋白質(zhì)氧化會(huì)導(dǎo)致必需氨基酸的損失，進(jìn)而降低了魚糜的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和風(fēng)味特性。羰基含量是反映蛋白質(zhì)氧化程度的有效指標(biāo)[26]，在金屬離子和活性氧存在下，賴氨酸、脯氨酸、精氨酸等氨基酸容易被氧化成半醛，半醛約占總羰基含量的70%[27]。羰基含量與蛋白質(zhì)的氧化變性呈正相關(guān)，其含量越高蛋白質(zhì)的變性程度越嚴(yán)重。如圖4所示，在貯藏前新鮮的魚糜肌原纖維蛋白中的羰基含量?jī)H為0.001 6 nmol/mg，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，羰基含量呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，在4、-18、-35 ℃貯藏15 d后，其羰基含量分別增加至0.021 6、0.016 4、0.012 7 nmol/mg。羰基含量增加是由于氨基酸側(cè)鏈—NH—或—NH2等活性基團(tuán)被氧化，蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，蛋白質(zhì)間發(fā)生交聯(lián)聚集，部分氨基酸殘基轉(zhuǎn)化為羰基，-18、-35 ℃冷凍貯藏下羰基含量明顯低于4 ℃，說明較低的貯藏溫度可以有效抑制蛋白質(zhì)氧化，這與崔旭海等[28]研究結(jié)果一致。

圖4 不同溫度貯藏期間肌原纖維蛋白羰基含量的變化Fig. 4 Changes in carbonyl content in myofibrillar protein during storage at different temperatures

2.5 魚糜肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的基礎(chǔ)，它與蛋白質(zhì)的功能特性有密切關(guān)系[29]，根據(jù)不同的空間構(gòu)型可將其分為α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲4種結(jié)構(gòu)[30]，蛋白質(zhì)的冷凍及氧化都會(huì)引起蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。拉曼光譜是測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的重要手段，酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）主要由C＝O振動(dòng)引起，與蛋白質(zhì)肽鏈的骨架有序程度緊密相關(guān)，常用于分析蛋白質(zhì)4種二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量變化[31]。如圖5所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，α-螺旋相對(duì)含量下降，β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量增加。在4、-18、-35 ℃貯藏15 d后，α-螺旋相對(duì)含量由24.24%分別下降至14.12%、13.02%、12.83%，β-折疊相對(duì)含量由33.38%上升至39.30%、35.01%、43.72%，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量由15.45%上升至16.35%、19.70%、15.78%，其不同結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的變化與蛋白質(zhì)螺旋結(jié)構(gòu)的伸展有關(guān)。通常認(rèn)為α-螺旋與β-折疊屬于相對(duì)有序的二級(jí)結(jié)構(gòu)，而β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲屬于相對(duì)無(wú)序的二級(jí)結(jié)構(gòu)，薛勇[32]研究表明魚肉凍藏過程中，蛋白中氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵和離子鍵的改變導(dǎo)致了蛋白結(jié)構(gòu)的變化?？偟貋碚f，冷凍貯藏會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)由有序向無(wú)序轉(zhuǎn)變。

圖5 不同溫度貯藏期間魚糜肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化Fig. 5 Changes in secondary structures of myofibrillar protein during storage at different temperatures

2.6 魚糜肌原纖維蛋白內(nèi)源性熒光強(qiáng)度的變化

內(nèi)源性熒光光譜可以表征貯藏和加工過程中蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[33]，常被用于芳香族氨基酸暴露指數(shù)分析。色氨酸殘基的內(nèi)源性熒光對(duì)蛋白質(zhì)微環(huán)境的極性十分敏感，當(dāng)其位于蛋白質(zhì)內(nèi)部時(shí)，熒光強(qiáng)度較高；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)變性，蛋白質(zhì)構(gòu)象展開，位于蛋白質(zhì)內(nèi)部的色氨酸殘基暴露于溶劑中加速猝滅現(xiàn)象[34]。如圖6所示，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，不同貯藏溫度下肌原纖維蛋白熒光強(qiáng)度均呈下降趨勢(shì)，與4 ℃冷藏條件相比，-18、-35 ℃凍藏條件下熒光強(qiáng)度的下降幅度較大，這說明凍藏對(duì)蛋白質(zhì)極性環(huán)境的影響較大，在貯藏9 d后，熒光強(qiáng)度隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)下降較為緩慢，這可能是由于大量色氨酸殘基的暴露增大了其周圍環(huán)境的極性而產(chǎn)生了屏蔽效應(yīng)。貯藏15 d后，4、-18、-35 ℃下最大吸收波長(zhǎng)均出現(xiàn)了紅移，最大吸收波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度較0 d時(shí)分別下降了31.76%、71.41%、43.60%，這說明隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，肌原纖維蛋白微環(huán)境發(fā)生變化，但相對(duì)較低的凍藏溫度又可以在一定程度上減緩蛋白質(zhì)的變性和結(jié)構(gòu)變化。

圖6 不同溫度貯藏期間肌原纖維蛋白內(nèi)源性熒光強(qiáng)度的變化Fig. 6 Changes in intrinsic fluorescence spectrum of myofibrillar protein during storage at different temperatures

2.7 魚糜凝膠化學(xué)作用力的變化

魚糜通過加熱促使蛋白質(zhì)發(fā)生變性進(jìn)而形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，該網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定離不開化學(xué)作用力的維持。維持魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的化學(xué)作用力主要由離子鍵、氫鍵、疏水相互作用等[35]，其中，離子鍵和疏水相互作用是維持魚糜凝膠構(gòu)象穩(wěn)定的主要作用力[36]，氫鍵主要維持蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，它可以起到穩(wěn)定結(jié)合水的作用[37]。

如圖7所示，在低溫冷鏈貯藏初期，魚糜凝膠中離子鍵和疏水相互作用含量相對(duì)較高，這說明它們是維持魚糜凝膠結(jié)構(gòu)的主要作用力，與米紅波等[38]研究結(jié)果相似。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，非特異性相互作用相對(duì)含量增加，離子鍵和疏水相互作用相對(duì)含量減少，氫鍵相對(duì)含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。在低溫冷鏈貯藏15 d后，4 ℃貯藏樣品非特異性相互作用相對(duì)含量顯著高于-18、-35 ℃貯藏樣品，離子鍵、氫鍵和疏水相互作用含量顯著低于-18、-35 ℃貯藏樣品。這說明較低的貯藏溫度可以有效保護(hù)魚糜中有助于形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的活性基團(tuán)，從而保持魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成能力。

圖7 不同溫度貯藏期間魚糜凝膠化學(xué)作用力的變化Fig. 7 Changes in chemical interactions of surimi gels during storage at different temperatures

2.8 基于肌原纖維蛋白變化與凝膠化學(xué)作用力的主成分分析結(jié)果

肌原纖維蛋白是魚糜中的主要成分，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析在低溫冷鏈溫度貯藏過程中凝膠化學(xué)作用力與肌原纖維蛋白變化之間的關(guān)系，探究低溫冷鏈貯藏對(duì)魚糜凝膠特性的影響。對(duì)不同溫度和貯藏時(shí)間樣品的肌原纖維蛋白相關(guān)指標(biāo)及魚糜凝膠化學(xué)作用力進(jìn)行主成分分析，PC1（51.9%）和PC2（24.3%）的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為76.2%，肌原纖維蛋白總巰基含量、Ca2+-ATPase活力、α-螺旋相對(duì)含量和離子鍵相對(duì)含量的位置接近，具有較高的相關(guān)性（圖8A）；不同貯藏時(shí)間和貯藏溫度的魚糜之間存在的差異，4 ℃及各溫度下貯藏時(shí)間較長(zhǎng)的樣品主要分布在第二、三象限（圖8B），這些樣品具有較多的無(wú)規(guī)卷曲、β-折疊結(jié)構(gòu)以及較高的羰基含量和非特異性相互作用水平；不同溫度下貯藏時(shí)間較短的樣品主要分布在第一、四象限（圖8B），這些樣品具有較高的Ca2+-ATPase活力、總巰基含量、α-螺旋相對(duì)含量、離子鍵和疏水相互作用相對(duì)含量。

圖8 不同溫度貯藏期間魚糜凝膠特性和肌原纖維蛋白的主成分分析結(jié)果Fig. 8 PCA plots for gel properties and myofibrillar protein of surimi during storage at different temperatures

2.9 肌原纖維蛋白變化與凝膠特性的相關(guān)性分析結(jié)果

為了進(jìn)一步揭示低溫冷鏈貯藏導(dǎo)致的魚糜肌原纖維蛋白變性與魚糜凝膠化學(xué)作用力之間的關(guān)系，對(duì)肌原纖維蛋白相關(guān)指標(biāo)及魚糜凝膠化學(xué)作用力相對(duì)含量進(jìn)行相關(guān)性分析。如圖9所示，Ca2+-ATPase活力、總巰基含量、α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量與離子鍵、疏水相互作用相對(duì)含量之間呈正相關(guān)，羰基含量、β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量、無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量與離子鍵、疏水相互作用相對(duì)含量呈負(fù)相關(guān)，與非特異性相互作用相對(duì)含量呈正相關(guān)，這說明低溫冷鏈貯藏導(dǎo)致的肌原纖維蛋白的活性基團(tuán)變性與魚糜凝膠化學(xué)作用力的形成有密切聯(lián)系。其中，離子鍵相對(duì)含量與Ca2+-ATPase活力（r＞0.9）、總巰基含量（r＞0.8）呈較強(qiáng)的相關(guān)性，進(jìn)一步說明Ca2+-ATPase活力和總巰基含量與魚糜凝膠離子鍵的形成有關(guān)。Chen Yanting等[39]研究發(fā)現(xiàn)無(wú)規(guī)卷曲含量與凝膠強(qiáng)度和持水性呈負(fù)相關(guān)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化會(huì)破壞凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖9 不同溫度貯藏期間魚糜凝膠特性和肌原纖維蛋白的相關(guān)性分析結(jié)果Fig. 9 Correlation analysis between gel properties and myofibrillar protein of surimi during storage at different temperatures

3 結(jié) 論

本研究探討了低溫冷鏈貯藏對(duì)魚糜凝膠化學(xué)作用力與肌原纖維蛋白相關(guān)特性的影響。結(jié)果表明，低溫貯藏過程中魚糜鹽溶性蛋白含量和肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，且在前3 d下降較快，而后逐漸趨于平緩。總巰基含量在凍藏前6 d下降較為迅速，而羰基含量呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì)，較低的貯藏溫度可以有效抑制蛋白質(zhì)的氧化。貯藏過程中，肌原纖維蛋白α-螺旋相對(duì)含量下降，β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量增加，說明蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)由有序向無(wú)序轉(zhuǎn)變，蛋白微環(huán)境發(fā)生變化。魚糜凝膠中離子鍵和疏水相互作用相對(duì)含量減少，氫鍵相對(duì)含量呈現(xiàn)先增加后減少。通過建立魚糜肌原纖維蛋白與凝膠化學(xué)作用力之間的關(guān)系，闡明了肌原纖維蛋白中活性基團(tuán)與凝膠化學(xué)作用力的形成密切相關(guān)，揭示了低溫冷鏈貯藏引起的肌原纖維蛋白活性基團(tuán)變性和凝膠化學(xué)作用力改變是魚糜凝膠品質(zhì)劣變的主要原因。因此，在貯藏初期防止蛋白氧化和冷凍變性是維持魚糜凝膠特性的有效途徑，而較低的凍藏溫度可以有效緩解蛋白的氧化和冷凍變性。