基于酶活力和細胞模型分析廣佛手多糖降血糖活性及作用機制

楊玉潔，劉 煥，王淑惠，柳春紅，陳樹喜，周愛梅,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東省功能食品活性物重點實驗室，廣東 廣州 510642；2.廣東展翠食品股份有限公司，廣東 潮州 515634）

糖尿病是一種以高血糖濃度為特征的代謝性疾病，會伴隨許多并發(fā)癥，包括中風、神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病變和腎病等[1]，嚴重危害人體健康。截至2021年，我國20～79 歲糖尿病患病人數(shù)約1.4 億，位居世界第一[2]。臨床一般采用注射胰島素和口服降糖藥進行治療。為了避免藥物帶來的不良反應，一些具有降血糖作用的天然活性物質(zhì)成為了研究熱點。其中多糖的降血糖作用得到廣泛的研究，如靈芝多糖[3-4]、麥冬多糖[5]和黃芪多糖[6]等都表現(xiàn)出良好的降血糖效果。

常用于體外評價多糖降血糖活性的方法包括酶活力抑制實驗和細胞實驗。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是控制餐后血糖濃度的重要靶點，Bu Tong等[7]研究發(fā)現(xiàn)，海帶多糖可以有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性，半抑制質(zhì)量濃度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）為38 μmol/L，體內(nèi)實驗也證實海帶多糖可以降低糖尿病小鼠的血糖濃度；Hasan等[8]研究證明，石巖楓多糖具有α-淀粉酶抑制活性（IC50＝2.038 mg/mL），并且能有效降低大鼠血糖濃度。同時，有證據(jù)顯示血糖濃度與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）活力有關(guān)，Aluko等[9]研究表明ACE抑制劑可降低大鼠血糖濃度。這是由于糖尿病是一種復雜的代謝疾病，高血壓與其之間存在共同的病理途徑。所以多糖抑制ACE活性的研究也逐漸增多，ACE活性也成為研究胰島素抵抗的指標之一。例如，Gara等[10]在探究囊鏈藻硫酸多糖對糖尿病大鼠降血糖作用前，在體外進行了α-淀粉酶和ACE的活性抑制實驗，其IC50分別為39.16、58.35 μg/mL。

3T3-L1前脂肪細胞經(jīng)誘導可分化為成熟的脂肪細胞，常用于脂肪細胞功能及糖脂代謝研究。脂肪細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運體4（glucose transporter 4，GLUT4）的表達降低會產(chǎn)生胰島素抵抗[11]。而GLUT4是磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）通路的重要蛋白之一。多糖可以通過PI3K/AKT通路來緩解胰島素抵抗[12]，如Ke Bin等[13]發(fā)現(xiàn)黃芪多糖促進3T3-L1脂肪細胞的葡萄糖攝取，增加胰島素敏感性，可能涉及PI3K/AKT信號通路。

佛手（Citrus medica‘Fingered’）為蕓香科柑橘屬果實，是一種傳統(tǒng)的藥食兩用植物，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖和提高免疫力等多種生物活性。佛手多糖是佛手中主要活性組分之一，具有抗氧化[14-16]、免疫[17]、抗衰老[18]和抗腫瘤[19]等生物活性，但目前鮮見佛手多糖降血糖活性的研究，其作用機制也尚不明確。佛手按產(chǎn)地分為金佛手（產(chǎn)自浙江）、川佛手（產(chǎn)自四川）、建佛手（產(chǎn)自福建）和廣佛手（產(chǎn)自廣東）4種。課題組在前期研究[20]中已經(jīng)建立了廣佛手多糖分離純化方法并制得4種廣佛手多糖組分（FCP、FCP-1、FCP-2和FCP-2-1），其中以FCP-2-1純度最高，對其進行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果表明FCP-2-1的重均相對分子質(zhì)量為1.503×104，半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖的物質(zhì)的量比為0.685∶0.032∶0.283，推測其化學結(jié)構(gòu)為→[5)-α-L-Araf-(1]5→[4)-α-D-GalAp-(1]7→。

基于此，本研究通過測定廣佛手多糖各分離純化組分對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和ACE的抑制效果，并利用3T3-L1脂肪細胞建立胰島素抵抗細胞模型，測定細胞糖代謝、脂代謝、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α分泌量，初步評價和篩選出降血糖活性較高組分FCP-2-1，分析FCP-2-1對PI3K/AKT通路蛋白表達的影響，以期為廣佛手精深加工及其在健康食品領(lǐng)域中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

廣佛手由廣東展翠食品股份有限公司提供；3T3-L1前脂肪細胞由美國模式培養(yǎng)物保藏所（american type culture collection，ATCC）提供。

廣佛手多糖組分FCP、FCP-1、FCP-2和FCP-2-1由實驗室自制[20]。

α-葡萄糖苷酶（比活力50 U/mg） 美國Sigma公司；α-淀粉酶（豬胰腺，比活力10 U/mg）、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）、N-馬脲酰組氨酰亮氨酸（N-hippuryl-histidylleucine，HHL）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methyl-7H-xanthine，IBMX）上海源葉生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、青-鏈霉素、0.25%（質(zhì)量分數(shù)）胰蛋白酶、胎牛血清、pH 7.4 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 美國Gibco公司；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）、RIPA裂解液、TBST（Tris-HCl+Tween）緩沖液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白質(zhì)定量試劑盒、增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescent，ECL）試劑武漢賽維爾生物科技有限公司；PI3K、AKT、磷酸化-AKT（phosphorylated-AKT，p-AKT）、GLUT4和β-actin抗體英國Abcam公司；油紅O染色試劑盒 北京雷根生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（high density liptein cholesterol，HDL-C）、TNF-α測定試劑盒 南京建成生物科技有限公司；氯化鈉、可溶性淀粉、硫酸、苯酚、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZA120R4 萬分之一分析天平 上海贊維衡器有限公司；FD-1型冷凍干燥機 海門其林貝爾儀器制造有限公司；ECLIPSE Ti系列倒置顯微鏡 日本尼康株式會社；5415R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；SMA4000微量紫外分光光度計 美林恒通（北京）儀器有限公司；2300多功能酶標儀 美國PerkinElmer公司；KZ-II型研磨儀 武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 體外相關(guān)酶活力抑制能力測定

1.3.1.1α-葡萄糖苷酶活力抑制能力測定

參考Deng Yejun等[21]的方法并稍作修改。取廣佛手多糖FCP、FCP-1、FCP-2和FCP-2-1和阿卡波糖（陽性對照）分別用PBS配制成不同質(zhì)量濃度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL）的多糖溶液；采用PBS分別配制7.5 mmol/L PNPG溶液與0.2 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液。采用96 孔板反應體系，分別取50 μL多糖溶液加入孔板中，每孔加入100 μLα-葡萄糖苷酶溶液，于37 ℃下溫孵10 min后加入50 μL PNPG溶液，37 ℃反應25 min后，測定405 nm波長處吸光度A1。以等體積PBS取代多糖溶液，測定吸光度A0；以等體積PBS取代α-葡萄糖苷酶溶液，測定吸光度A2。按式（1）計算α-葡萄糖苷酶活力抑制率，采用SPSS Statistics 21軟件擬合計算IC50。

1.3.1.2α-淀粉酶活力抑制能力測定

采用Deng Yejun等[21]的方法并略作修改。采用PBS分別配制質(zhì)量分數(shù)5%可溶性淀粉溶液與2 U/mLα-淀粉酶溶液。參考趙凱等[22]的方法配制DNS試劑。向各試管中分別加入300 μL 1.3.1.1節(jié)不同質(zhì)量濃度的多糖溶液及400 μLα-淀粉酶溶液，混合均勻后于37 ℃下溫孵10 min，隨后分別加入300 μL可溶性淀粉溶液并在37 ℃反應15 min。最后分別加入2 mL DNS試劑顯色，并立即煮沸10 min以終止反應；冷卻后將混合體系用PBS定容至10 mL，測定其540 nm波長處吸光度A1。以等體積PBS取代多糖溶液，測定其540 nm波長處吸光度A0；以等體積PBS取代α-淀粉酶溶液，測定其540 nm波長處吸光度A2。按式（2）計算α-淀粉酶活力抑制率，采用SPSS Statistics 21軟件擬合計算IC50。

1.3.1.3 ACE活力抑制能力測定

參考Liu Jingbo等[23]的方法并略作修改。以PBS為溶劑分別配制不同質(zhì)量濃度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL）的廣佛手多糖溶液和卡托普利溶液（陽性對照）；采用pH 8.3、0.1 mol/L磷酸-硼砂緩沖液分別配制0.1 U/mL ACE溶液與2.5 mmol/L HHL溶液。取10 μL ACE溶液分別與40 μL不同質(zhì)量濃度的廣佛手多糖溶液、卡托普利溶液混合，并在37 ℃孵育5 min，然后加入150 μL HHL溶液啟動反應，37 ℃孵育30 min，最后加入200 μL 1.0 mol/L HCl溶液終止反應。反應溶液經(jīng)0.25 μm水系針式過濾器過濾后采用LC-10ATVP plus高效液相色譜儀進行分析。高效液相色譜條件：Diamonsil C18色譜柱（200 mm×4.6 mm）；流動相A為體積分數(shù)0.1%冰乙酸水溶液，流動相B為色譜純乙腈；梯度洗脫程序：0～5 min，10%～15%流動相B；5～15 min，15%～25%流動相B；檢測波長228 nm，流速0.8 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量10 μL。以等體積蒸餾水取代多糖溶液作為空白組，以馬尿酸為標準品制作標準曲線，采用外標法計算各組溶液中馬尿酸質(zhì)量濃度。按式（3）計算ACE活力抑制率，采用SPSS Statistics 21軟件擬合計算IC50。

式中：ρ1為空白組中馬尿酸質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρ2為廣佛手多糖組或陽性對照組中馬尿酸質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.2 體外細胞實驗

1.3.2.1 3T3-L1脂肪細胞培養(yǎng)及胰島素抵抗細胞模型建立

參考Shen Shengnan等[24]的方法并略作修改。3T3-L1前脂肪細胞在5% CO2、37 ℃、飽和濕度環(huán)境下用高糖完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基）培養(yǎng)至單層貼壁并接觸抑制狀態(tài)（細胞融合度≥90%）。胰酶消化液消化細胞后接種至6 孔培養(yǎng)板（5×105個/孔）中，并繼續(xù)培養(yǎng)至細胞完全融合，進行誘導分化。待分化的3T3-L1脂肪細胞用誘導液A（含10%胎牛血清、1%青鏈霉素、10 μg/mL胰島素、0.5 μmol/L IBMX、1 μmol/L羅格列酮、1 μmol/L地塞米松的DMEM高糖培養(yǎng)基）培養(yǎng)2～3 d后，換用誘導液B（含10%胎牛血清、1%青鏈霉素、10 μg/mL胰島素的DMEM高糖培養(yǎng)基）培養(yǎng)2～3 d，最后換高糖完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至10 d，當95%以上的細胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴（約9～10 d）即得到3T3-L1成熟脂肪細胞?？瞻讓φ战M為正常3T3-L1前脂肪細胞。使用含100 nmol/L胰島素的高糖完全培養(yǎng)基分別刺激兩組細胞30 min，采用葡萄糖試劑盒測定兩組細胞刺激前后培養(yǎng)液中葡萄糖質(zhì)量濃度，驗證胰島素抵抗模型是否建立成功。

1.3.2.2 3T3-L1脂肪細胞的顯微鏡觀察和油紅O染色鑒定

取1.3.2.1節(jié)3T3-L1成熟脂肪細胞和3T3-L1前脂肪細胞用PBS清洗2 次后在顯微鏡下觀察并拍照；采用質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛溶液固定細胞20 min后用PBS清洗2 次；按照油紅O染色試劑盒說明書配制染色液，避光靜置10 min；取1 mL油紅O染色液覆蓋培養(yǎng)板，室溫下染色10 min；棄去油紅O工作液，用PBS清洗1～2 次，如有殘余的油紅O染色液，用體積分數(shù)60%異丙醇溶液清洗，隨后立即置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.2.3 3T3-L1脂肪細胞存活率的測定

將1.3.2.1節(jié)3T3-L1成熟脂肪細胞接種于96 孔板（1×104個/孔），用含不同終質(zhì)量濃度（0（空白）、0.2、2、20、200、2 000 μg/mL）FCP-2-1的高糖完全培養(yǎng)基分別處理24、48 h和72 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL噻唑藍溶液，避光孵育培養(yǎng)4 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，搖床振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。每組設(shè)6個平行。采用酶標儀測定492 nm波長處光密度值（OD492nm），按式（4）計算細胞存活率。

1.3.2.4 細胞耗糖量、脂代謝相關(guān)指標和TNF-α質(zhì)量濃度的測定

將接種于24 孔板上的胰島素抵抗3T3-L1成熟脂肪細胞（1×105個/孔）用含不同終質(zhì)量濃度（10、50、150 μg/mL）廣佛手多糖的高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；陰性對照組加入高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，胰島素組加入含100 nmol/L胰島素的高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；二甲雙胍（陽性對照）組加入含40 μg/mL二甲雙胍的高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。各組細胞培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液，900 r/min離心5 min取上清液備用。

分別按照相應試劑盒說明書測定陰性對照組、廣佛手多糖組和胰島素組的葡萄糖質(zhì)量濃度；測定陰性對照組、廣佛手多糖組和二甲雙胍組的TG、TC、LDL-C、HDL-C、TNF-α水平。

1.3.2.5 免疫印跡分析

取1.3.2.4節(jié)陰性對照組、不同終質(zhì)量濃度（10、50、150 μg/mL）FCP-2-1組和二甲雙胍組細胞，吸去培養(yǎng)液后用PBS清洗細胞，然后每孔加入100 μL RIPA裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白質(zhì)量濃度。每孔裝載60 μg總蛋白，用質(zhì)量分數(shù)8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，質(zhì)量分數(shù)5%脫脂奶粉封閉1 h，在4 ℃下與一抗孵育18 h。用TBST緩沖液洗凈后與相應的二抗在室溫下孵育30 min，再次用TBST緩沖液洗凈。避光條件下配制ECL工作液，使PVDF膜與其充分反應1 min，棄去ECL工作液后加入顯影、定影試劑進行顯影和定影，然后使用曝光儀曝光顯色并拍照。采用AlphaView軟件分析目標蛋白條帶灰度。蛋白相對表達水平以相應蛋白灰度與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度的比值表示，以p-AKT與AKT相對表達水平的比值表示AKT磷酸化水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

實驗設(shè)置3個平行，結(jié)果以平均值±標準差表示，采用SPSS Statistics 21軟件進行數(shù)據(jù)處理和單因素方差分析，采用Duncan檢驗進行顯著性分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。采用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣佛手多糖對相關(guān)酶活力的體外抑制能力

2.1.1 廣佛手多糖對α-葡萄糖苷酶活力抑制能力

如圖1所示，各組分廣佛手多糖的α-葡萄糖苷酶活力抑制率隨質(zhì)量濃度的升高而增加，呈劑量-效應關(guān)系。4.00 mg/mL FCP-2-1對α-葡萄糖苷酶活力抑制能力最強，抑制率為65.66%，是相同質(zhì)量濃度阿卡波糖抑制率的75.04%。FCP-2-1對α-葡萄糖苷酶活力的IC50為2.74 mg/mL。FCP-2抑制能力其次，最高抑制率為49.76%，IC50為7.25 mg/mL。FCP-1和FCP抑制能力最差，最高抑制率分別為28.71%和15.18%，IC50分別為16.71、17.01 mg/mL。通過比較IC50可知，F(xiàn)CP-2-1對α-葡萄糖苷酶活力的抑制能力達到FCP的6.23 倍，F(xiàn)CP-2對α-葡萄糖苷酶活力的抑制能力達到FCP-1的3.96 倍。α-葡萄糖苷酶在人體消化系統(tǒng)中起到重要作用，也是臨床控制血糖的重要靶點[25]。多糖對α-葡萄糖苷酶活力的抑制作用被廣泛研究，其抑制作用與多糖支鏈基團、蛋白質(zhì)含量、葡萄糖含量和三螺旋構(gòu)象有關(guān)[26-27]。本研究結(jié)果與Jia Yanan等[28]的結(jié)果相似，該研究發(fā)現(xiàn)，玉米須多糖（CSP20）含有58.7%（質(zhì)量分數(shù)，下同）中性糖、27.9%糖醛酸、6.36%蛋白質(zhì)，對α-葡萄糖苷酶活力的IC50為7.75 mg/mL，高于本研究廣佛手多糖FCP-2-1和FCP-2。

圖1 廣佛手多糖對α-葡萄糖苷酶活力的抑制效果Fig. 1 Inhibitory effects of polysaccharides of finger citron from Guangdong province on α-glucosidase activity

2.1.2 廣佛手多糖對α-淀粉酶活力抑制能力

如圖2所示，各組分廣佛手多糖的α-淀粉酶活力抑制率隨質(zhì)量濃度的升高而增加，呈劑量-效應關(guān)系。當質(zhì)量濃度為4.00 mg/mL時，各組抑制率達到最高，F(xiàn)CP-1和FCP抑制率較低，分別為42.44%和37.91%，IC50分別為6.60、11.77 mg/mL；FCP-2抑制能力較強，最高抑制率為49.15%，IC50為1.37 mg/mL；FCP-2-1抑制α-淀粉酶活力的能力最強，抑制率為74.20%，IC50為0.87 mg/mL，其抑制率是陽性對照阿卡波糖的74.95%。由IC50可知，F(xiàn)CP-2-1對α-淀粉酶活力的抑制能力達到FCP的13.53 倍，F(xiàn)CP-2對α-淀粉酶活力的抑制能力達到FCP-1的4.82 倍。與α-葡萄糖苷酶類似，α-淀粉酶的活力也可影響餐后血糖濃度，因為二者都是消化吸收的關(guān)鍵酶，可水解食物中的糖類物質(zhì)產(chǎn)生葡萄糖。Zeng Aoqiong等[29]研究發(fā)現(xiàn)，紅海藻紫菜多糖在體外對α-淀粉酶具有較好的抑制作用，其IC50為12.72 mg/mL。該研究進一步證明，紅海藻紫菜多糖可在體內(nèi)抑制正常和糖尿病大鼠餐后血糖的升高。由此推測FCP-2-1組分具有較好的體內(nèi)降血糖效果。

圖2 廣佛手多糖對α-淀粉酶活力的抑制效果Fig. 2 Inhibitory effects of polysaccharides from finger citron from Guangdong province on α-amylase activity

2.1.3 廣佛手多糖對ACE活力抑制能力

如圖3所示，各組分廣佛手多糖的ACE抑制率也呈劑量-效應關(guān)系。4.00 mg/mL FCP-2-1、FCP-2、FCP-1、FCP溶液的ACE抑制率依次為88.02%、86.86%、66.71%、85.24%，其IC50依次為0.85、1.03、1.89、1.09 mg/mL。比較IC50可知，F(xiàn)CP-2-1對ACE的抑制能力是FCP-1的2.22 倍；FCP-2對ACE的抑制能力是FCP-1的1.83 倍。ACE活力抑制實驗常用于評價物質(zhì)的降血壓活性，同時，ACE活力也與II型糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)展密切相關(guān)[30]，對于ACE抑制劑類藥物的運用有助于降低心腦血管及腎臟疾病患者II型糖尿病的發(fā)病率[31]。因此，多糖抑制ACE活力也被廣泛研究，如Gara等[10]的研究表明，硫酸酯化的囊鏈藻多糖對ACE的IC50為58.35 μg/mL，并且使糖尿病大鼠的血糖濃度下降56%。

圖3 廣佛手多糖對ACE活力的抑制效果Fig. 3 Inhibitory effects of polysaccharides of finger citron from Guangdong province on ACE activity

2.2 3T3-L1胰島素抵抗模型建立

3T3-L1脂肪細胞屬于小鼠胚胎原纖維細胞，經(jīng)過誘導可分化為成熟脂肪細胞。脂肪細胞是發(fā)生胰島素抵抗的主要場所[32-33]，所以此細胞廣泛用于肥胖、代謝異常等生理活性研究。正常形態(tài)的3T3-L1前脂肪細胞呈梭狀（圖4A），經(jīng)過誘導分化后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細胞體積變大，邊緣圓潤，呈典型的戒環(huán)狀，油紅O染色觀察結(jié)果中脂滴呈橙紅色（圖4B）。經(jīng)100 nmol/L胰島素刺激后，成熟脂肪細胞培養(yǎng)液中葡萄糖質(zhì)量濃度極顯著高于空白對照正常3T3-L1前脂肪細胞（P＜0.01），和胰島素刺激前的正常3T3-L1前脂肪細胞沒有顯著差異（P＞0.05）（圖4C），說明細胞對胰島素刺激產(chǎn)生抵抗，不能及時將葡萄糖轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)。由此可知，胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細胞模型建立成功。

圖4 油紅O染色結(jié)果及胰島素抵抗建模結(jié)果Fig. 4 Results of oil red O staining and insulin resistance modeling

2.3 廣佛手多糖對3T3-L1脂肪細胞存活率的影響

如圖5所示，與空白組相比，在作用時間24 h、廣佛手多糖作用質(zhì)量濃度為0.2～2 000 μg/mL時，3T3-L1脂肪細胞的存活率最大增加了10.92%。FCP-1、FCP-2和FCP-2-1在高質(zhì)量濃度時對細胞的生長表現(xiàn)出抑制作用，當作用時間24 h、質(zhì)量濃度2 000 μg/mL時，F(xiàn)CP-1、FCP-2和FCP-2-1組細胞存活率分別為68.25%、92.60%、71.57%。并且這種抑制作用隨著作用時間的延長而加強，當作用時間72 h、質(zhì)量濃度2 000 μg/mL時，F(xiàn)CP-2和FCP-2-1組的細胞存活率分別僅為46.91%和50.91%。因此，4種廣佛手多糖的作用時間應不超過48 h、質(zhì)量濃度為0.2～200 μg/mL。

圖5 廣佛手多糖對3T3-L1脂肪細胞存活率的影響Fig. 5 Effects of polysaccharides of finger citron from Guangdong province on the proliferative viability of 3T3-L1 adipocytes

2.4 廣佛手多糖對3T3-L1脂肪細胞糖代謝的影響

如圖6所示，胰島素抵抗細胞經(jīng)胰島素刺激后，細胞培養(yǎng)液中葡萄糖質(zhì)量濃度極顯著下降（P＜0.01）。經(jīng)不同質(zhì)量濃度廣佛多糖組分處理后，與陰性對照組相比，各組葡萄糖質(zhì)量濃度均極顯著降低（P＜0.01），最高下降了45.06%。其中，不同質(zhì)量濃度的FCP-2-1干預后，細胞培養(yǎng)液中葡萄糖質(zhì)量濃度較胰島素組均極顯著下降（P＜0.01），最高下降了31.90%，同時與其他相同質(zhì)量濃度的廣佛手多糖組分相比也具有顯著差異（P＜0.05），說明FCP-2-1促進細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運的效率最高。

圖6 廣佛手多糖對3T3-L1脂肪細胞糖代謝的影響Fig. 6 Effects of polysaccharides of finger citron from Guangdong province on glucose metabolism in 3T3-L1 adipocytes

2.5 廣佛手多糖對3T3-L1脂肪細胞TNF-α分泌量的影響

如圖7所示，各質(zhì)量濃度的FCP-2-1和二甲雙胍均可以顯著降低胰島素抵抗細胞上清的TNF-α質(zhì)量濃度（P＜0.01）。其中，F(xiàn)CP-2-1能有效抑制TNF-α分泌，且呈劑量-效應關(guān)系。150 μg/mL FCP-2-1處理后TNF-α質(zhì)量濃度相比陰性對照組下降了67.09%，相比二甲雙胍組下降了50.06%。50、150 μg/mL的FCP-2和150 μg/mL的FCP-1也能顯著抑制TNF-α的分泌（P＜0.05），與陰性對照組相比分別下降了38.53%、48.53%和40.88%。糖尿病的發(fā)生常伴隨著氧化應激、細胞炎癥等不良反應，Litvinova等[34]通過分析臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，TNF-α等炎癥因子的水平和患者體質(zhì)量、血糖和膽固醇的增加有關(guān)。因此，廣佛手多糖抑制TNF-α分泌可能有助于緩解或減慢糖尿病病情的進程。

圖7 廣佛手多糖對3T3-L1脂肪細胞分泌TNF-α的影響Fig. 7 Effects of polysaccharides of finger citron from Guangdong province on TNF-α secretion from 3T3-L1 adipocytes

2.6 廣佛手多糖對3T3-L1脂肪細胞脂代謝的影響

如圖8所示，不同質(zhì)量濃度廣佛手多糖各組分均能極顯著降低3T3-L1脂肪細胞TG、LDL-C濃度（P＜0.01），極顯著提高HDL-C濃度（P＜0.01）。相比陰性對照組，F(xiàn)CP-2-1降低了細胞TC、TG和LDL-C分泌量，分別最高可降低35.68%、65.37%和46.42%，HDL-C分泌量最高可提高444%。與二甲雙胍組相比，不同質(zhì)量濃度FCP-2-1抑制TG分泌的效果更好，在作用質(zhì)量濃度為150 μg/mL時，F(xiàn)CP-2-1組TG濃度為陰性對照組的32.68%。其中FCP和FCP-2-1處理組隨質(zhì)量濃度的增加，TC濃度呈下降趨勢?，F(xiàn)有研究表明，脂代謝異常會加速脂質(zhì)沉積異常和胰島素抵抗的發(fā)展，國內(nèi)外臨床數(shù)據(jù)已證明脂代謝相關(guān)指標與胰島素抵抗具有相關(guān)性[35-36]。在多糖領(lǐng)域，Li Jiping等[37]和Qu Jian等[38]的研究表明，板藍根多糖和鐵皮石斛多糖可改善3T3-L1脂肪細胞的胰島素抵抗，并且兩種多糖降低了糖尿病小鼠和大鼠的血糖濃度，可能與其改善脂質(zhì)代謝有關(guān)。

圖8 廣佛手多糖對3T3-L1脂肪細胞脂代謝的影響Fig. 8 Effects of polysaccharides of finger citron from Guangdong province on lipid metabolism in 3T3-L1 adipocytes

2.7 廣佛手多糖對3T3-L1脂肪細胞PI3K/AKT相關(guān)通路蛋白表達的影響

PI3K/AKT通路在組織和細胞中起到轉(zhuǎn)運葡萄糖的重要作用。其中PI3K、AKT、GLUT4蛋白的表達會影響細胞或組織對葡萄糖的利用率。有研究報道，此通路被抑制與II型糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，例如Jia等[39]研究發(fā)現(xiàn)，患有II型糖尿病的大鼠其PI3K/AKT通路異常，損害了胰島素信號傳導。

綜合體外酶活力和細胞實驗結(jié)果，選擇FCP-2-1探究其對3T3-L1脂肪細胞PI3K/AKT相關(guān)通路蛋白表達的影響，結(jié)果如圖9所示。相比于陰性對照組，二甲雙胍和不同質(zhì)量濃度FCP-2-1均能使3T3-L1脂肪細胞中PI3K、GLUT4、AKT和p-AKT蛋白相對表達水平極顯著增高（P＜0.01），其中FCP-2-1質(zhì)量濃度與AKT磷酸化水平呈劑量-效應關(guān)系。50 μg/mL FCP-2-1促進PI3K蛋白表達的效果極顯著優(yōu)于二甲雙胍（P＜0.01），相比提高了157.14%。50 μg/mL FCP-2-1促進GLUT4和p-AKT表達的效果也顯著優(yōu)于二甲雙胍（P＜0.05），促進率分別提高了38.46%和26.67%。類似的結(jié)果在Xu Hui等[40]的研究中也有體現(xiàn)，其發(fā)現(xiàn)海參中的褐藻多糖可增強3T3-L1脂肪細胞中PI3K的磷酸化，促進GLUT4易位，在體內(nèi)實驗中褐藻多糖可降低糖尿病小鼠的空腹血糖水平，提高口服葡萄糖耐受能力。

圖9 廣佛手多糖對3T3-L1脂肪細胞PI3K/AKT通路蛋白表達的影響Fig. 9 Effects of polysaccharides of finger citron from Guangdong province on protein expression in the PI3K/AKT signaling pathway in 3T3-L1 adipocytes

3 結(jié) 論

廣佛手多糖通過分離純化得到FCP、FCP-1、FCP-2和FCP-2-1 4個不同純化程度的組分，通過體外酶活力模型篩選出降血糖活性最優(yōu)的組分為FCP-2-1，其次為FCP-2，兩者可有效抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和ACE的活力。通過體外建立胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FCP-2-1可改善3T3-L1脂肪細胞的糖、脂代謝和TNF-α分泌量，緩解細胞胰島素抵抗，同時可提高細胞PI3K/AKT通路中PI3K、GLUT4、AKT和p-AKT蛋白的表達。綜上所述，F(xiàn)CP-2-1可通過抑制相關(guān)酶活力和改善糖、脂代謝發(fā)揮其降血糖活性，其機制可能是FCP-2-1激活了葡萄糖轉(zhuǎn)運重要通路PI3K/AKT中相關(guān)蛋白的表達。