丁香酚、香芹酚和百里香酚對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌活性及機(jī)制

崔 醒，朱秋勁，侯 瑞，萬(wàn) 婧,3,*

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)林學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

鐮刀菌屬真菌可以侵染多種農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物，引起小麥、大麥和燕麥的赤霉病和莖基腐病以及玉米的穗腐病等[1]。鐮刀菌侵染農(nóng)作物后分泌的單端孢霉烯族毒素是目前糧食及食品加工產(chǎn)品中主要的真菌毒素來(lái)源。這些真菌疾病一直威脅著全球糧食的產(chǎn)量和質(zhì)量（受感染的谷物含有毒性很強(qiáng)的嘔吐毒素（deoxynivalenol，DON）），也是制約我國(guó)及世界糧食安全和食品安全的重要因素。被感染的谷物在收獲、貯藏運(yùn)輸或加工過(guò)程若遭遇高溫高濕條件則可能出現(xiàn)真菌的二次生長(zhǎng)，所產(chǎn)生的毒素由于穩(wěn)定性較高會(huì)經(jīng)由加工鏈進(jìn)入食品或飼料，嚴(yán)重危害人畜健康，如玉米赤霉烯酮可使豬發(fā)生雌性激素亢進(jìn)癥，單端孢霉素類則阻礙蛋白質(zhì)合成而引起動(dòng)物嘔吐、腹瀉和拒食[2]。世界范圍內(nèi)的真菌污染導(dǎo)致約20%的田間減產(chǎn)和約10%的采后損傷。據(jù)美國(guó)疾病控制中心估算，全球約有超過(guò)450萬(wàn) 人長(zhǎng)期暴露于高真菌毒素含量的食物[3]。由于真菌及其毒素的污染無(wú)法完全從田間去除，因此，開(kāi)發(fā)積極有效的采后真菌和真菌毒素控制措施是農(nóng)產(chǎn)品和食品工業(yè)中亟待解決的重要問(wèn)題。目前，我國(guó)用于控制農(nóng)產(chǎn)品采后真菌及真菌毒素污染的方法主要是人工合成的殺菌劑，如吡咯苯類、咪唑類和硫氰酸類等，但因受到其化學(xué)殘留安全性、環(huán)境降解周期長(zhǎng)，尤其是過(guò)度使用造成的真菌耐藥性問(wèn)題凸顯而逐漸被禁用，迫使農(nóng)業(yè)及食品工業(yè)積極探索毒副作用小、環(huán)境友好且具有新型作用機(jī)制的抗菌劑或殺菌劑。植物精油因其高效的廣譜抗菌性、良好的生物降解性和食品安全性而成為化學(xué)合成殺菌劑最熱門的候選之一[4]。植物精油是芳香植物為進(jìn)行自我防御而產(chǎn)生的次級(jí)代謝物，通過(guò)在花、芽、葉和樹(shù)皮等部位提取而得到的揮發(fā)性物質(zhì)的復(fù)雜混合物。由于精油的化學(xué)組分復(fù)雜且異變（易受生長(zhǎng)環(huán)境和提取條件的影響），極大地削弱了精油的生物活性且使闡明其抑菌機(jī)制變得困難。團(tuán)隊(duì)前期篩選出富含苯酚類化合物如丁香酚、百里香酚和香芹酚的植物精油（丁香精油和百里香精油）能高效抑制禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)毒[5-6]。因此，可以從精油中分離出丁香酚、百里香酚和香芹酚單獨(dú)研究其對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌作用和機(jī)制。

植物精油及其活性成分抑制微生物的機(jī)制主要包括：1）損傷真菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜[7]；2）使菌絲體DNA、RNA、脂類和蛋白質(zhì)等生物合成受到抑制，相關(guān)基因不能表達(dá)，進(jìn)而使其失去對(duì)代謝的調(diào)節(jié)控制以及自我復(fù)制的正常進(jìn)行，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8]；3）損傷真菌的細(xì)胞能量代謝途徑[9]；4）對(duì)真菌產(chǎn)毒基因的抑制作用[10]。盡管植物精油及其活性成分的抗菌機(jī)制在細(xì)胞水平被廣泛報(bào)道，但在對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制機(jī)制在基因水平的闡明還很匱乏。禾谷鐮刀菌全基因組序列的公布以及單端孢霉烯族毒素合成基因、基因簇和生物合成途徑的不斷挖掘?yàn)榛蛩窖芯恐参锞图捌浠钚猿煞謱?duì)禾谷鐮刀菌的作用機(jī)制提供了便利。目前已經(jīng)明確單端孢霉烯族毒素的生物合成至少涉及到3個(gè)基因家族，分別為Tri5基因簇、Tri1-Tri16基因簇和Tri101基因簇[11]。利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)可研究苯酚類化合物對(duì)禾谷鐮刀菌細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平，包括編碼和非編碼蛋白R(shí)NA的影響及其差異[12-13]。綜上所述，在前期工作的基礎(chǔ)上，以具有高效抗菌活性的3種苯酚類植物精油活性成分丁香酚、香芹酚和百里香酚為研究對(duì)象，明確其對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)和DON合成的抑制效應(yīng)，從細(xì)胞水平研究其對(duì)禾谷鐮刀菌細(xì)胞膜、細(xì)胞內(nèi)容物和能量代謝等生理影響，最后通過(guò)RNA-Seq測(cè)序從轉(zhuǎn)錄組水平探明3 類苯酚類化合物抑制禾谷鐮刀菌的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）由貴州大學(xué)林學(xué)院提供。

丁香酚、香芹酚和百里香酚（食品級(jí)≥98%） 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）及其他試劑 貴州慕為美科技有限公司；KA08304H DON殘留酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試試劑盒 北京勤邦生物技術(shù)有限公司；微量丙二醛（malondialdehyde，MDA）、ATP含量檢測(cè)試劑盒南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectra Max 190光吸收型酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；GTR16-2醫(yī)用離心機(jī) 北京新時(shí)代北利醫(yī)療器械有限公司；Mini系列桌面型離心機(jī) 生工生物工程（上海）股份有限公司；SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；ROB15 HEAL FOECE超純水系統(tǒng) 上?？道追治鰞x器有限公司；DMEX20系列生物顯微鏡 寧波舜宇儀器有限公司；DDSJ-308A電導(dǎo)率儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種制備

菌種活化：從-80 ℃斜面保存的禾谷鐮刀菌菌種中，挑取一小塊菌絲，接種于PDA平板，25 ℃黑暗環(huán)境中培養(yǎng)3 d，菌落邊緣切取菌絲塊，接種于PDA平板，同樣條件下活化3 d。

孢子儲(chǔ)備液制備：取7 mm新鮮菌餅，接種到綠豆瓊脂培養(yǎng)基平板，25 ℃、12 h紫外/12 h黑暗環(huán)境下培養(yǎng)4～8 d后，每個(gè)平板用5 mL滅菌超純水洗脫，經(jīng)過(guò)2 層拭鏡紙過(guò)濾后，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。將洗脫下的孢子液以體積比1∶100添加到滅菌后的羧甲基纖維素培養(yǎng)基中，25 ℃、175 r/min見(jiàn)光培養(yǎng)3 d，抽濾。得到的孢子液在4 ℃、8 600 r/min下離心10 min，下層沉淀為孢子儲(chǔ)備液。

菌絲富集：用10 mL滅菌超純水將菌絲從PDA平板洗脫，所得的菌絲溶液以體積比1∶100添加到滅菌后的酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)液中，25 ℃、175 r/min見(jiàn)光培養(yǎng)3 d。抽濾除去廢液，所得菌絲體用無(wú)菌純水洗滌3 次。

1.3.2 丁香酚、香芹酚和百里香酚對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制能力測(cè)定

丁香酚、香芹酚和百里香酚溶于無(wú)水乙醇得到0.006、0.012、0.018、0.024、0.036 mol/L的丁香酚溶液、0.007、0.013、0.019、0.026、0.039 mol/L的香芹酚溶液和百里香酚溶液。采用平板涂布法將400 μL不同活性成分溶液涂抹在PDA平板表面，接種新鮮菌餅（直徑5 mm），25 ℃避光環(huán)境下培養(yǎng)3 d，測(cè)量菌絲直徑。以不含植物精油活性成分的無(wú)水乙醇為對(duì)照組。參照Wan Jing等[14-15]的方法計(jì)算百里香酚、丁香酚和香芹酚抑制菌絲生長(zhǎng)的半數(shù)有效作用濃度（50% effective concentration，EC50）。

1.3.3 丁香酚、香芹酚和百里香酚對(duì)禾谷鐮刀菌的孢子萌發(fā)抑制能力測(cè)定

將丁香酚、香芹酚和百里香酚溶于無(wú)水乙醇得到0.030、0.059、0.089、0.119、0.149、0.239 mol/L的丁香酚溶液、0.032、0.065、0.097、0.130、0.162、0.261 mol/L的香芹酚溶液和百里香酚溶液。500 μL溶液與孢子液（1×105個(gè)/mL）等體積混合后，取40 μL混合液涂抹在瓊脂平板表面，25 ℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)10 h后，生物顯微鏡下計(jì)數(shù)。對(duì)照組使用500 μL孢子液與無(wú)水乙醇等體積混合。參照Wan Jing等[15]的方法計(jì)算丁香酚、香芹酚和百里香酚抑制孢子萌發(fā)的EC50。

1.3.4 丁香酚、香芹酚和百里香酚對(duì)DON毒素生物合成抑制測(cè)定

禾谷鐮刀菌的孢子液（1×107個(gè)/mL）按體積比1∶1與濃度為EC50和10×EC50的不同活性成分溶液混合。接種到已滅菌的大米培養(yǎng)基上，25 ℃避光條件下培養(yǎng)30 d，每天定時(shí)搖勻培養(yǎng)基[14-15]。對(duì)照組使用孢子液與無(wú)水乙醇等體積混合。大米培養(yǎng)基經(jīng)真空冷凍干燥后粉碎，按照DON殘留酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)培養(yǎng)基中DON含量。

1.3.5 丁香酚、香芹酚和百里香酚對(duì)菌絲電導(dǎo)率的影響

參考Duan Yabing等[16]的方法并作適當(dāng)修改，將1 g菌絲體重懸于10 mL不同濃度（EC50、10×EC50、100×EC50）的活性成分溶液中，用電導(dǎo)率儀測(cè)定0 h菌絲溶液的電導(dǎo)率，2.5 h后將菌絲體煮沸5 min，測(cè)定最終電導(dǎo)率。2.5 h電導(dǎo)率差值計(jì)算公式如下。

1.3.6 丁香酚、香芹酚和百里香酚對(duì)菌絲體中MDA和ATP含量的影響

稱取1 g菌絲體重懸于10 mL不同濃度（EC50、10×EC50、100×EC50）的活性成分溶液中，混勻5 s，25 ℃黑暗環(huán)境培養(yǎng)12 h，無(wú)菌超純水洗滌3 次，加入體積分?jǐn)?shù)0.9%無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行超聲破碎，5 000 r/min離心5 min取上清液。對(duì)照組使用孢子液與無(wú)水乙醇等體積混合。按照微量MDA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，每個(gè)樣品取100 μL檢測(cè)其MDA含量；按照ATP含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，每個(gè)樣品取30 μL檢測(cè)其ATP含量。

1.3.7 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

菌絲處理方式參考1.3.6節(jié)。洗滌后的菌絲用3 mL離心管凍存，委托北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行RNA提取和RNA-Seq測(cè)序。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)過(guò)濾獲得Clean Reads。采用每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的片段數(shù)（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，F(xiàn)PKM）（即每百萬(wàn)Reads的每kb外顯子片段）方法計(jì)算和歸一化EC50丁香酚乙醇溶液處理的Eug01組、EC50香芹酚乙醇溶液處理的Car01組、EC50百里香酚乙醇溶液處理的Thy01組以及生理鹽水處理的NS組的基因表達(dá)水平。以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）小于0.01和差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）大于4作為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因。使用ClusterProfile軟件進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。用Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)并作圖，采用SPSS 2.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種活性成分溶液對(duì)菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的影響

丁香酚、香芹酚和百里香酚對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)有抑制作用且呈劑量依賴性。隨著活性成分濃度的升高，菌落直徑明顯縮小，生長(zhǎng)趨勢(shì)減弱，孢子存活概率小，喪失繁殖能力。用抑制50%菌絲生長(zhǎng)或孢子萌發(fā)的EC50衡量3種苯酚類活性成分對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抗菌活性，由表1可知，百里香酚和香芹酚對(duì)禾谷鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)的抑制效果優(yōu)于丁香酚；百里香酚對(duì)禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制效果最好，丁香酚和香芹酚次之。

表1 丁香酚、香芹酚和百里香酚對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)抑制作用的EC50Table 1 EC50 of eugenol, carvacrol, and thymol against the mycelium growth and spore germination of F. graminearum

2.2 3種活性成分溶液對(duì)DON合成的影響

DON是由禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌及其他產(chǎn)毒的鐮刀菌木霉菌等產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，作為一種常見(jiàn)的單端孢霉烯族毒素，DON在谷物食品中檢出率和超標(biāo)率較高。DON含量的減少能夠降低谷類及其相關(guān)制品的安全風(fēng)險(xiǎn)。由圖1可知，與對(duì)照組相比，丁香酚、香芹酚和百里香酚均能顯著降低DON的合成（P＜0.05）。10×EC50百里香酚溶液相對(duì)于EC50百里香酚溶液處理后，20 g大米培養(yǎng)基中DON含量由96.848 μg/L降低到81.465 μg/L。相對(duì)于EC50，10×EC50丁香酚和香芹酚處理后，DON含量分別降低了21.304 μg/L和4.384 μg/L。在EC50水平下百里香酚抑制DON生成的效果顯著優(yōu)于丁香酚和香芹酚，在10×EC50處理濃度下百里香酚和丁香酚的抑制效果顯著優(yōu)于香芹酚，說(shuō)明百里香酚和丁香酚抑制DON生成的效果較好。經(jīng)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，百里香酚能同時(shí)引起DON生物合成相關(guān)基因TRI5和TRI6的下調(diào)，而丁香酚和香芹酚只分別作用于TRI6和TRI5。綜上所述，百里香酚對(duì)禾谷鐮刀菌產(chǎn)生DON的抑制效果優(yōu)于香芹酚和丁香酚處理。

圖1 丁香酚、香芹酚和百里香酚對(duì)DON合成的影響Fig. 1 Effects of eugenol, carvacrol, and thymol against the biosynthesis of deoxynivalenol by F. graminearum

2.3 3種活性成分溶液對(duì)電解質(zhì)泄漏的影響

細(xì)胞膜是微生物屏障，既可以阻擋外源物質(zhì)進(jìn)入，也可以防止內(nèi)部物質(zhì)流出。若細(xì)胞膜遭受損壞，流動(dòng)性被抑制，膜滲透性改變，胞內(nèi)電解質(zhì)發(fā)生外漏，最終會(huì)影響菌體生長(zhǎng)[17]。采用電導(dǎo)率法驗(yàn)證了在丁香酚、香芹酚和百里香酚作用下禾谷鐮刀菌菌絲體膜通透性的變化（表2）。與對(duì)照組相比，丁香酚、香芹酚和百里香酚均引起禾谷鐮刀菌電導(dǎo)率值增加，且隨著處理液濃度的增大，菌絲體溶液的電導(dǎo)率值呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明丁香酚、香芹酚和百里香酚引發(fā)細(xì)胞膜損傷。100×EC50作用下，香芹酚對(duì)細(xì)胞膜的損傷程度明顯超過(guò)丁香酚和百里香酚。百里香酚及其納米乳處理禾谷鐮刀菌后，掃描電子顯微鏡下均能觀察到菌絲體出現(xiàn)不規(guī)則收縮，細(xì)胞內(nèi)膜的完整性和通透性被破壞[8,18]。

2.4 3種活性成分溶液對(duì)菌絲體中MDA和ATP含量的影響

植物精油可能引起禾谷鐮刀菌細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，脂質(zhì)過(guò)氧化改變膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，產(chǎn)生MDA副產(chǎn)物。由表2可知，各處理組MDA濃度與對(duì)照組相比均增加，隨著處理液濃度的升高，菌絲體溶液的MDA濃度增加，說(shuō)明禾谷鐮刀菌受到刺激后，細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化程度增加。與之結(jié)果相似，Kalagatur等[19]發(fā)現(xiàn)魯沙香茅精油處理后的小麥赤霉病菌細(xì)胞中MDA含量增加。MDA可進(jìn)一步與DNA發(fā)生反應(yīng)，與2’-脫氧鳥(niǎo)苷產(chǎn)生丙烷加合物，對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、增殖、分化和凋亡等生理功能產(chǎn)生不利影響。

表2 丁香酚、香芹酚和百里香酚對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲體電導(dǎo)率、ATP、MDA濃度的影響Table 2 Effects of eugenol, carvacrol, and thymol on the conductivity, ATP content, and MDA level of mycelium solution

ATP作為能量轉(zhuǎn)換載體，其水平的改變會(huì)影響細(xì)胞功能。由表2可知，各處理組禾谷鐮刀菌菌絲溶液中ATP濃度均低于對(duì)照組，且隨著處理濃度的增加，ATP含量不斷下降；與EC50相比，10×EC50香芹酚處理禾谷鐮刀菌后，菌絲溶液中ATP含量由0.090 mmol/L降為0.046 mmol/L，但無(wú)顯著差異（P＞0.05）；表明經(jīng)過(guò)處理的禾谷鐮刀菌細(xì)胞內(nèi)線粒體產(chǎn)能不足。通常，ATP含量降低預(yù)示線粒體功能受損，細(xì)胞處于凋亡、壞死或毒性狀態(tài)下。丁香酚還能夠引發(fā)婁地青霉和黑曲霉線粒體形態(tài)損傷和功能受損[20]。

2.5 基因差異表達(dá)分析

從圖2看出，丁香酚對(duì)禾谷鐮刀菌的影響最大，顯著差異基因數(shù)最多（225個(gè)），上調(diào)差異基因19個(gè)，下調(diào)差異基因206個(gè)。與對(duì)照組相比，香芹酚處理禾谷鐮刀菌后得到139個(gè)差異基因，其中30個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，109個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。百里香酚溶液處理后，得到135個(gè)差異基因，上調(diào)基因（10個(gè)）占7.41%。此外，禾谷鐮刀菌經(jīng)處理后表達(dá)下調(diào)的基因數(shù)高于上調(diào)基因，這些基因的表達(dá)可能受到丁香酚、香芹酚和百里香酚明顯的干預(yù)。高弢等[21]利用麝香草酚處理禾谷鐮孢菌后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析也發(fā)現(xiàn)了類似趨勢(shì)。這說(shuō)明菌株可以通過(guò)調(diào)整部分基因的表達(dá)應(yīng)對(duì)不同苯酚類植物精油活性成分的刺激。

圖2 禾谷鐮刀菌響應(yīng)丁香酚、香芹酚和百里香酚刺激下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析Fig. 2 Transcriptomic analysis of F. graminearum treated with eugenol,carvonol or thymol

2.6 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析結(jié)果

差異表達(dá)基因的GO功能富集分析結(jié)果表明（圖3），與對(duì)照組相比，丁香酚、香芹酚和百里香酚處理后所得差異基因在生物學(xué)過(guò)程的核糖體生物發(fā)生、核糖核蛋白復(fù)合物生物發(fā)生、rRNA加工、rRNA代謝過(guò)程、ncRNA加工、細(xì)胞成分生物發(fā)生；細(xì)胞組分的氧化還原酶復(fù)合物、質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP合酶復(fù)合物、耦合因子F(o)的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP合酶復(fù)合物、質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)雙區(qū)ATP酶復(fù)合物和分子功能的血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、分子內(nèi)氧化還原酶活性等12 條GO term均存在富集。

圖3 禾谷鐮刀菌響應(yīng)丁香酚、香芹酚和百里香酚刺激下的GO功能富集前30個(gè)通路Fig. 3 Top 30 GO enriched pathways of F. graminearum treated with eugenol, carvonol or thymol

丁香酚、香芹酚和百里香酚破壞核糖體和線粒體結(jié)構(gòu)，影響禾谷鐮刀菌的能量和物質(zhì)代謝。這也驗(yàn)證了禾谷鐮刀菌細(xì)胞內(nèi)ATP含量降低是由于丁香酚、香芹酚和百里香酚破壞了禾谷鐮刀菌線粒體的結(jié)構(gòu)，造成能量供應(yīng)不足。此外，GO富集結(jié)果顯示丁香酚借助甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控基因表達(dá)和生理過(guò)程中間產(chǎn)物的合成與降解反應(yīng)。香芹酚改變了禾谷鐮刀菌膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，這可能是由于脂質(zhì)過(guò)氧化的存在。禾谷鐮刀菌通過(guò)調(diào)整微管蛋白和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架響應(yīng)里香酚的刺激。

2.7 差異表達(dá)基因的KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分析結(jié)果

通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)分析差異表達(dá)基因在禾谷鐮刀菌中的代謝途徑和功能。結(jié)果表明，丁香酚、香芹酚和百里香酚處理的禾谷鐮刀菌差異基因被共同注釋到18 條通路（表3）。此外，丁香酚處理（Eug01組）的禾谷鐮刀菌差異基因還被注釋到氮代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、乙醚脂質(zhì)代謝、抗壞血酸和醛糖代謝、肌醇磷酸代謝、苯丙氨酸代謝、戊糖和葡萄糖醛酸互變、酪氨酸代謝等。香芹酚處理（Car01組）的禾谷鐮刀菌差異基因還注釋到氮代謝、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、精氨酸和脯氨酸代謝、檸檬酸循環(huán)（三羧酸循環(huán)）、核苷酸切除修復(fù)、乙醛酸鹽和二羧酸鹽和碳代謝。百里香酚處理（Thy01組）的禾谷鐮刀菌差異基因還被注釋到RNA降解和酪氨酸代謝。

表3 DON生物合成中心基因的轉(zhuǎn)錄水平Table 3 Transcriptional levels of the central genes of DON biosynthesis

RNA翻譯到蛋白質(zhì)發(fā)生在核糖體。真核生物的80S核糖體定位于其胞質(zhì)，由核糖體RNA及核糖體蛋白質(zhì)組成。核糖體的大小亞基相互配合共同在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中將mRNA轉(zhuǎn)化為多肽鏈。香芹酚處理后，下調(diào)基因富集到真核生物中的核糖體生物發(fā)生，大多數(shù)核糖體基因與翻譯功能、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生有關(guān)，這表明核糖體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，轉(zhuǎn)錄過(guò)程受到影響，蛋白質(zhì)合成受到抑制。

氧化磷酸化由電子傳遞鏈和磷酸化兩部分構(gòu)成，電子通過(guò)電子傳遞鏈產(chǎn)生跨膜的質(zhì)子梯度即質(zhì)子動(dòng)勢(shì)，用于驅(qū)動(dòng)ATP合酶合成ATP，為DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和蛋白合成等生理過(guò)程提供能量[22]。禾谷鐮刀菌經(jīng)丁香酚、香芹酚和百里香酚處理后，差異基因在氧化磷酸化途徑存在顯著富集，說(shuō)明參與氧化磷酸化的線粒體復(fù)合物I、復(fù)合物II、復(fù)合物III、復(fù)合物IV和復(fù)合物V受到嚴(yán)重影響，能量合成被抑制，ATP含量降低。線粒體功能障礙導(dǎo)致細(xì)胞中的活性氧迅速增加，氧化還原酶和過(guò)氧化氫酶活力被降低，活性氧水平超過(guò)防御機(jī)制，細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，MDA含量增加，細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性發(fā)生改變，菌絲體溶液電導(dǎo)率增加。檸檬醛通過(guò)積累大量活性氧破壞氧化磷酸化途徑和細(xì)胞膜的完整性，抑制洋青霉菌生長(zhǎng)[23]。氧化應(yīng)激還會(huì)引起蛋白質(zhì)氧化、核酸損傷、酶抑制，甚至造成細(xì)胞程序性死亡。

微生物受到不良刺激后，激活自我保護(hù)系統(tǒng)，改變細(xì)胞膜脂肪酸組分來(lái)保持其流動(dòng)性。脂肪酸合成與代謝通路相關(guān)的差異基因表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明丁香酚、香芹酚和百里香酚可能抑制了禾谷鐮刀菌自我保護(hù)能力。百里香酚具有擾亂細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層的能力，可導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性的增加。

核苷酸切除修復(fù)是最普遍的DNA修復(fù)機(jī)制，識(shí)別和處理活細(xì)胞中多種類型的DNA損傷[12]。禾谷鐮刀菌菌絲調(diào)控DNA修復(fù)機(jī)制應(yīng)對(duì)丁香酚引起的DNA損傷。單萜橙花醇引起了甘薯黑斑病菌核染色質(zhì)的濃縮和伴隨的DNA裂解，導(dǎo)致DNA修復(fù)基因表達(dá)上調(diào)，丁香酚也破壞和降解婁地青霉和黑曲霉的DNA[24-25]。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在禾谷鐮刀菌的抗藥性和發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要而多樣的作用[26-27]。丁香酚、香芹酚和百里香酚處理后，差異基因富集到ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，說(shuō)明物質(zhì)的主動(dòng)運(yùn)輸過(guò)程發(fā)生改變，重金屬解毒、脂質(zhì)代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、多藥抗性、核糖體生物合成和mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生命活動(dòng)均受到影響[28]。

從上述結(jié)果來(lái)看，丁香酚、香芹酚和百里香酚有可能通過(guò)影響禾谷鐮刀菌核糖體結(jié)構(gòu)和功能，造成氧化磷酸化途徑相關(guān)酶活的改變，導(dǎo)致線粒體功能障礙，ATP合成減少，氧化應(yīng)激狀態(tài)被激活，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，細(xì)胞膜損傷。同時(shí)，禾谷鐮刀菌自我保護(hù)能力被抑制，加劇了細(xì)胞損傷程度，耐藥性下降。

2.8 參與DON生物合成途徑的基因表達(dá)分析結(jié)果

DON的生物合成包含一系列的酶促反應(yīng)，約有12～16個(gè)相關(guān)基因參與調(diào)控。丁香酚、香芹酚和百里香酚作用后，禾谷鐮孢菌中參與DON生物合成的TRI基因轉(zhuǎn)錄水平變化如表4所示。在本研究中，與NS組相比，丁香酚、香芹酚和百里香酚處理后，編碼C7、C8或C7,8加氧酶的TRI1基因、編碼轉(zhuǎn)錄蛋白的TRI10基因、編碼C15羥化酶的TRI11基因、編碼C3乙?；傅腡RI101基因出現(xiàn)不同程度的下調(diào)表達(dá)，編碼單端孢霉烯3-O-酯酶的TRI8基因和編碼毒素外排泵的TRI12基因上調(diào)表達(dá)。百里香酚引起DON生物合成通路關(guān)鍵基因TRI5和TRI6基因下調(diào)表達(dá)，TRI5基因是DON生物合成第一步的關(guān)鍵基因[29]，其編碼的單端孢霉二烯酶催化法尼基焦磷酸骨架結(jié)構(gòu)環(huán)化形成母核結(jié)構(gòu)單端孢二烯[30]。TRI6是單端孢霉烯合成的正調(diào)控因子，禾谷鐮刀菌中TRI6基因缺失后DON和T-2毒素合成能力完全喪失，且多個(gè)參與DON毒素合成的TRI表達(dá)量也明顯下調(diào)[31-33]。體外產(chǎn)毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)百里香酚對(duì)禾谷鐮刀菌產(chǎn)生DON的抑制效果最優(yōu)。

表4 DON生物合成中心基因的轉(zhuǎn)錄水平Table 4 Transcriptional levels of the central genes of DON biosynthesis

2.9 MAPK信號(hào)通路相關(guān)的基因表達(dá)分析結(jié)果

DON的生物合成除受TRI基因調(diào)控以外，還受到MAPK信號(hào)通路的調(diào)控。禾谷鐮刀菌MAPK通路包含3個(gè)磷酸化途徑：參與調(diào)控細(xì)胞壁完整性的Mgv1、參與信息素信號(hào)途徑的Gpmk1、參與高滲透性甘油信號(hào)途徑的FgHog1[34-35]。丁香酚、香芹酚和百里香酚均上調(diào)了Gpmk1磷酸化途徑的FgSte11、FgSte7基因，下調(diào)了Mgv1磷酸化途徑的FgMgv1基因和FgHog1磷酸化途徑的FgPBS2、FgSSK2中心激酶基因（表5）。FgMgv1中心激酶基因缺失后，DON毒素的生物合成能力基本喪失，細(xì)胞壁嚴(yán)重缺損，菌落生長(zhǎng)緩慢[36]。破壞禾谷鐮刀菌Gpmk1磷酸化途徑導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)緩慢，分生孢子產(chǎn)率和DON產(chǎn)量下降[37]。FgHog1磷酸化途徑的FgPBS2、FgSSK2中心激酶基因同樣參與了菌絲生長(zhǎng)、有性生殖、毒素合成和植物侵染等過(guò)程[38]。

表5 MAPK信號(hào)通路中心激酶基因的轉(zhuǎn)錄水平Table 5 Transcription levels of central kinase genes in MAPK signaling pathway

3 結(jié) 論

通過(guò)體外抑菌實(shí)驗(yàn)表明丁香酚、香芹酚和百里香酚對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)抑制的EC50為0.015、0.006 mol/L和0.005 mol/L，對(duì)孢子萌發(fā)抑制的EC50為0.116、0.130 mol/L和0.076 mol/L。丁香酚、香芹酚和百里香酚作用于禾谷鐮刀菌核糖體和線粒體，抑制酶的生成，氧化磷酸化途徑失調(diào)，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，電解質(zhì)滲漏，能量代謝失衡。百里香酚下調(diào)了DON生物合成途徑中關(guān)鍵基因TRI5和TRI6的表達(dá)，達(dá)到最優(yōu)抑制效果。丁香酚、香芹酚和百里香酚通過(guò)Mgv1磷酸化信號(hào)通路調(diào)節(jié)DON毒素合成。本研究從分子水平闡釋了丁香酚、香芹酚和百里香酚3種精油活性成分對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制機(jī)制，對(duì)精油活性成分用于食品工業(yè)采后真菌和真菌毒素控制具有參考價(jià)值。RNA-Seq測(cè)序發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)處理的禾谷鐮刀菌有關(guān)自身修復(fù)的基因下調(diào)，自我保護(hù)能力被抑制，可能會(huì)加劇細(xì)胞損傷程度，造成耐藥性下降，后續(xù)工作可圍繞這一點(diǎn)展開(kāi)研究。