水溶性聚合物PEDOT:PSS的光熱性能評價及抗菌活性研究

李國梁,周曉倩,唐煥峰,王 瑋,陳克正

(青島科技大學 材料科學與工程學院,山東 青島 266042)

隨著抗生素的濫用,引起了細菌多重耐藥性,大大削弱了傳統(tǒng)抗生素的治療效果。據(jù)統(tǒng)計,大多數(shù)致死性細菌感染是由耐藥菌引起的[1]。研究發(fā)現(xiàn),與耐藥菌有關(guān)的感染通常表現(xiàn)出對抗生素有較強的抵抗力和不敏感性。細胞壁和細胞膜作為細菌的屏障,可保護細菌免受各種抗菌劑的侵害,有證據(jù)表明,抗菌劑吸收的增加可提高抗菌效率[2]。快速膜穿透的材料便可以跨越這道保護屏障,穿透細胞壁、細胞膜,直接進入細菌內(nèi)部,破壞膜的調(diào)節(jié)功能,進而使蛋白質(zhì)和DNA/RNA分子失活[3-4]。到目前為止,已經(jīng)開發(fā)出了幾種抗菌劑[5],基于帶正電的試劑和帶負電的膜之間的靜電吸引,采用陽離子策略通過細菌策略轉(zhuǎn)移到細菌的細胞膜上。但是,陽離子化合物會引起哺乳動物細胞膜的破壞,較高的細胞毒性限制了其應用。生物相容性好、能夠穿透膜結(jié)構(gòu)的材料便可解決該問題,并且目前有關(guān)材料能夠穿膜進行抗菌的報道比較少見。

光熱抗菌劑(PTA)被認為是最潛在的抗菌策略之一。許多文獻已經(jīng)證明,從光能轉(zhuǎn)換而來的熱量可以抑制多藥耐藥細菌的生長[6]。更重要的,近紅外光具有高組織滲透性以及可忽略不計的熱損傷等特點[7]。聚噻吩(PEDOT)是一種眾所周知的聚合物光熱材料,具有良好的生物相容性和可降解性,因此在臨床上具有更好的應用前景。目前報道的聚合物基光熱材料大多是非水溶性的納米顆粒,在用于體內(nèi)治療之前需要進行復雜的表面修飾,使材料的光熱性能、生物相容性受到限制。制備水溶性聚合物雖然采用天然的氧化還原酶做催化劑可以解決這一問題,但天然酶易變性、不穩(wěn)定等缺點嚴重限制了這一制備工藝的發(fā)展。而磷酸銅納米酶(CuPOs)具有高催化活性,且結(jié)構(gòu)簡單,耐酸耐堿、穩(wěn)定性好,克服了傳統(tǒng)模擬酶合成復雜、提純困難和對環(huán)境敏感的問題。

本研究從開發(fā)快速、高效、副作用最小的抗菌方案的角度出發(fā),報道了一種對于生物系統(tǒng)相容性至關(guān)重要的酶模擬水合成方法,以磷酸銅(CuPOs)納米酶為催化劑,3,4-乙烯二氧噻吩(3,4-ethoxylene dioxy thiophene,EDOT)為單體,聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)為模板,雙氧水為引發(fā)劑,評價了水溶性PEDOT:PSS的綠色合成及其抗菌應用研究。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

3,4-乙烯二氧噻吩(3,4-ethylenedioxythiophene,EDOT),聚苯乙烯磺酸鈉(poly(p-styrenesulfonic acid),PSS),尿素(H2NCONH2),乙醇,二甲苯,硫酸銅(CuSO4·5H2O),磷酸(H3PO4),磷酸氫二鈉十二水合物(Na2HPO4·12 H2O),檸檬酸一水合物(C6H8O7·H2O),H2O2(30%)等購自西格瑪實試劑公司;二甲基亞砜(DMSO),瓊脂,酵母提取物,胰蛋白胨等購自Bodi Chemical Co.,Ltd(中國天津)。

高壓反應釜,170 m L,上海安譜科學儀器有限公司;恒溫箱,SX2-X-16系列,濟南精密科學儀器有限公司;高速離心機(TG/16G),天津市奧特賽恩斯儀器廠;全波長酶標儀(FLASH),美國賽默飛世爾科技公司;紫外-可見-近紅外分光光度計(UV-Vis-NIR),TU-1810型,北京普析通用儀器有限責任公司;共聚焦熒光顯微鏡(CLSM),ECLIPSE Ti2-E型,日本Nikon公司;熒光分光光度計,F4600型,日本Hitachi公司;近紅外熱成像相機,Ti200型,美國Fluke公司。

1.2 水溶性PEDOT:PSS的合成

1.2.1 CuPOs納米酶的制備

取尿素(H2NCONH2)6.000 g,置于250 m L燒杯中,加入84 m L超純水攪拌至溶解;稱取0.050 g十二烷基硫酸鈉(SDS)于溶液中,攪拌10 min;取0.125 g五水合硫酸銅(CuSO4·5 H2O)溶于8 m L超純水攪拌10 min后;0.049 g磷酸(20%(質(zhì)量分數(shù))H3PO4)溶于8 m L超純水加入其中攪拌1 h;將溶液迅速移至150 m L高壓反應釜;80℃恒溫反應2 h;室溫冷卻1 h,將產(chǎn)物離心,先用超純水、后用無水乙醇分別洗滌3遍;將沉淀物60℃干燥24 h,得到最終產(chǎn)物CuPOs納米酶。

1.2.2 水溶性PEDOT:PSS的制備

取檸檬酸(19.2 m L,0.1 mol·L－1)與磷酸氫二鈉(0.8 m L,0.2 mol·L－1)的緩沖液(p H＝2.2)于50 m L燒杯,加入124.0 mg的聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)攪 拌30 min;加 入87.0 mg噻 吩 單 體(EDOT)攪拌1 h;加入5.0 mg Cu POs納米酶,將612μL雙氧水(1.0 mol·L－1)逐滴滴加于上述溶液中;60℃恒溫水浴24 h,產(chǎn)品經(jīng)透析膜(cutoff KDa為8 000～14 000)透析48 h;將透析完成的產(chǎn)物置于溫度為60℃的鼓風干燥箱中烘干,得到水溶性PEDOT:PSS。

1.3 水溶性PEDOT:PSS的性能表征

1.3.1 熒光表征

在室溫下,配制0.5 mg·m L－1PEDOT:PSS水溶液,使用熒光分光光度計,通過808 nm二極管激光器作為激發(fā)源,進行熒光性能測量。

近日，從全國工商聯(lián)組織工作會議上傳來消息，云南省昆明市官渡區(qū)工商聯(lián)連續(xù)第二次被評為全國“五好”縣級工商聯(lián)。全國“五好”縣級工商聯(lián)是官渡區(qū)圍繞“領(lǐng)導班子好、會員發(fā)展好、商會建設(shè)好、作用發(fā)揮好、工作保障好”等五個方面努力得到的成果，尤其是多措并舉為會員企業(yè)破解融資難題獲得一致贊譽。

1.3.2 光熱升溫性能表征

1)將不同濃度的材料水溶液(500μL,0、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 mg·mL－1)加入1.5 mL EP管中,進行近紅外激光照射(808 nm,1.5 W·cm－2,5 min)。每隔20 s,用近紅外熱成像相機記錄溶液的溫度,并將升溫數(shù)據(jù)繪制成升溫曲線。

2)將不同濃度的材料水溶液(500μL,0、0.1、0.2、0.5 mg·m L－1)加入1.5 m L EP管中,分別進行不同功率密度的近紅外激光照射(808 nm,0.33、0.75、1.00、1.50 W·cm－2,5 min)。用近紅外熱成像相機記錄溶液被照射5 min后的最終溫度。

1.3.3 光熱循環(huán)穩(wěn)定性及光熱轉(zhuǎn)換效率評價

取0.4 m L H2O于1.5 m L EP管 中,稱 量H2O的 凈 重,用 近 紅 外 激 光(808 nm,1.0 W·cm－2,5 min)照射5 min后,在正常條件下冷卻至室溫。在此期間,每20 s記錄一次EP管的實時溫度。然后在相同實驗條件下,用近紅外激光(808 nm,1.0 W·cm－2,5 min)照射材料水溶液(0.4 m L,2.0 mg·m L－1),重復5次,每次都需對溶液凈重進行測量,最后根據(jù)升溫降溫數(shù)據(jù)繪制時間-溫度曲線。

最后,根據(jù)繪制的時間-溫度曲線,并通過公式計算材料的光熱轉(zhuǎn)換效率[8]:

其中,η是材料的光熱轉(zhuǎn)換效率,Tmax是溶液通過升溫所能達到的最高溫度,Tsurr是溶液實驗過程的環(huán)境溫度,A808是材料水溶液在808 nm處的吸光度,Qdis是溶液在升溫過程中與環(huán)境熱交換消耗的熱量,C是水的比熱容,m是實驗過程中溶液的凈重,T是實驗過程中溶液的實時溫度,τs為材料溶液降溫曲線擬合直線的斜率,I為近紅外激光器的功率密度。

收集Wistar大鼠動脈血(來自心臟或腹主動脈的血液),并加入肝素抗凝。將抗凝血3 000 r·min－1、4℃環(huán)境下離心5 min后獲得紅細胞,用PBS洗滌3次后,配制一定體積5%紅細胞懸液待用。制備500μL不同濃度(0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 mg·m L－1)的樣品溶液,以PBS作為陰性對照,以1% Triton X100作為陽性對照,分別與500μL 5%紅細胞懸液混勻。將混合物在37℃下孵育3～4 h,離心分離并留存照片,并測定上清液在540、570 nm的OD值。參考以下公式計算溶血率x(由于樣品在540、570 nm處有吸收,故設(shè)置對應空白材料組以除去材料吸收對實驗的影響):

1.4 水溶性PEDOT:PSS的抗菌性能評價

細菌選用革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌(S.aureus)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)為實驗模型,培養(yǎng)實驗過程需要細菌操作間和潔凈臺及主要器械耗材的消毒。

1.4.1 熒光共定位

孵育細菌MRSA過夜;次日,將搖好的菌液用PBS洗滌后,利用LB培養(yǎng)基將細菌懸液濃縮至4×109CFU·m L－1(OD600＝4),與PEDOT:PSS(0.2 mg·m L－1)共孵育30 min;PBS離心洗滌3次去除殘留的PEDOT:PSS,用DAPI溶液(1.0 m L,10 μg·m L－1)室溫重懸5 min;最后用PBS洗滌2次,進行共聚焦成像。

1.4.2 平板計數(shù)

1)將制備的濃度為109CFU·m L－1(OD600＝1)的細菌懸液隨機分為4組:“Control”“NIR-only”“PEDOT:PSS-only”和“PEDOT:PSS＋NIR”;

2)依次加入125μL PBS、125μL PBS、125μL PEDOT:PSS(1 mg·m L－1)、125μL PEDOT:PSS(1 mg·m L－1),然后加入菌液至500μL,依次命名為“Control”“NIR-only”“PEDOT:PSS-only”和“PEDOT:PSS＋NIR”,搖床搖幌30 min,將“NIRonly”“PEDOT:PSS＋NIR”組取出進行近紅外激光照射(808 nm,1.0 W·cm－2,5 min)后孵育2 h。

3)細菌涂板:將共孵育菌液用PBS稀釋10萬倍(10×10×20×50稀釋),取100μL稀釋后的菌液于培養(yǎng)皿中心位置,并用滅菌三角形涂板棒將菌液涂抹均勻(設(shè)置3組平行試驗)。最后做好標記將培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫孵箱靜置培養(yǎng)。

4)菌落計數(shù):待固體培養(yǎng)基上長出單克隆菌落后,使用化學發(fā)光成像儀對菌落記錄,并對每個培養(yǎng)皿中的單克隆菌落數(shù)量進行計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 水溶性PEDOT:PSS紅外光譜分析

PEDOT:PSS的合成示意圖見圖1。

圖1 PEDOT:PSS的合成示意圖Fig.1 Schematic diagram of the synthesis of PEDOT:PSS

如圖2(a)所示,產(chǎn)物在CuPOs納米酶的催化條件下成功合成,并在808 nm處有強吸收。另外,由圖2(b)可知,產(chǎn)物在3 442 cm－1處有非常強的吸收峰,是由產(chǎn)物的水分中的－OH伸縮振動產(chǎn)生的;在2 925 cm－1處的吸收峰為EDOT中CH2的伸縮振動造成的;1 604 cm－1處的吸收峰為苯環(huán)中的骨架振動引起的;1 185、1 129 cm－1處的吸收峰為EDOT中C－O鍵的伸縮振動造成的;1 041、1 009和939 cm－1處的吸收峰是C－O－C鍵的對稱伸縮振動;775、673和518 cm－1處的吸收峰為C－S鍵的伸縮振動導致。綜上,證明了水溶性聚合物PEDOT:PSS的成功合成。

圖2 有無CuPOs納米酶催化條件下產(chǎn)物的紫外-可見-近紅外吸收和PEDOT:PSS的紅外譜圖Fig.2 UV-Vis-NIR absorption of the product with or without CuPOs nanoenzyme catalysis and the infrared spectrum of PEDOT:PSS

2.2 水溶性PEDOT:PSS光熱升溫性能評價

為了進一步驗證所合成的水溶性PEDOT:PSS的光熱性能,評價了不同濃度的PEDOT:PSS溶液(0、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 mg·m L－1)在近紅外激光照射(808 nm,1.00 W·cm－2,5 min)后的升溫情況,結(jié)果見圖3。從圖3(a)可以看出,PBS溶液經(jīng)過5 min照射后,溫度始終維持在25.9℃;當PEDOT:PSS濃度為0.05 mg·m L－1時,最高溫度就可達51.4℃,具有良好的光熱升溫效果,可對材料能否應用于光熱抗菌領(lǐng)域進行進一步研究;當PEDOT:PSS濃度為0.50 mg·mL－1時,升溫高達82℃;然而當濃度繼續(xù)升高時,發(fā)現(xiàn)溫度的上升受到限制,猜測其原因可能是溶液與環(huán)境強烈的熱交換限制了其溫度的進一步升高。另外又對不同濃度(0.1、0.2、0.5 mg·m L－1)的PEDOT:PSS進行了在不同功率密度(0.33、0.75、1.00、1.50 W·cm－2)照射5 min后的升溫情況評價,如圖3(b)所示,進一步說明了水溶性PEDOT:PSS優(yōu)異的光熱升溫效果,后續(xù)抗菌實驗選用濃度為0.2 mg·m L－1的PEDOT:PSS水溶液,照射參數(shù)為808 nm,1.50 W·cm－2,5 min。

圖3 不同濃度PEDOT:PSS在不同條件下的升溫曲線及最終溫度Fig.3 Heating curve and final temperature of different concentrations of PEDOT:PSS under different conditions

2.3 水溶性PEDOT:PSS光熱循環(huán)穩(wěn)定性及光熱轉(zhuǎn)換效率評價

光熱材料不僅僅需要具有良好的光熱升溫效果,還需要具有良好的光熱循環(huán)穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)換效率等,才能更有利于應用于光熱抗菌領(lǐng)域。因此,本研究進一步評價了PEDOT:PSS的光熱循環(huán)穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)換效率,結(jié)果見圖4。對濃度為2.00 mg·m L－1的水溶性PEDOT:PSS的水溶液進行了5次升溫循環(huán),近紅外激光照射(808 nm,1.00 W·cm－2,5 min)后均能達到80℃左右,具有良好的光熱循環(huán)穩(wěn)定性。同時,經(jīng)過計算,PEDOT:PSS的光熱轉(zhuǎn)換效率高達46.4%,具有優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換效率。

圖4 PEDOT:PSS的升溫循環(huán)曲線及光熱轉(zhuǎn)換效率Fig.4 Heating cycle curves and photothermal conversion efficiency of PEDOT:PSS

2.4 水溶性PEDOT:PSS生物相容性評價

水溶性PEDOT:PSS對于宿主來說始終是異物,可能會產(chǎn)生一些排異反應,因此,其生物相容性評價至關(guān)重要,溶血率低于3%被認為是不溶血的、生物相容性好的[9]。圖5為不同濃度下PEDOT:PSS的溶血率。即使PEDOT:PSS的濃度為1.00 mg·m L－1時,溶血率僅為4.59%±0.14%,可以認為溶血率很低,而劑量在0.50 mg·m L－1時,溶血率僅為1.83%±0.13%,表明了合成的水溶性PEDOT:PSS具有良好的生物安全性。

圖5 不同濃度下PEDOT:PSS的溶血率Fig.5 Hemolysis rate of PEDOT:PSS under gradient concentration

2.5 水溶性PEDOT:PSS光熱抗菌評價

將MRSA與水溶性PEDOT:PSS溶液共孵育5、30、120 min后的熒光共定位,如圖6所示。紅色熒光代表細菌,綠色熒光代表PEDOT:PSS,發(fā)現(xiàn)共孵育5 min時,PEDOT:PSS所發(fā)出的綠色熒光已被紅色熒光所包含,證明了PEDOT:PSS能夠在5 min時很快地進去細菌內(nèi)部,證明合成的水溶性PEDOT:PSS優(yōu)異的穿膜性質(zhì)。由于蛋白質(zhì)在高于60～70℃環(huán)境下就會變質(zhì)[7],而PEDOT:PSS光熱升溫能達到78.467℃,材料穿膜后再結(jié)合激光照射,所產(chǎn)生的熱量將會直接在細菌內(nèi)部對生命活性分子如蛋白質(zhì)等造成十分嚴重的不可逆熱損傷,從而大大提升PEDOT:PSS的光熱抗菌效率。

圖6 DAPI染色的MRSA與PEDOT:PSS共孵育5、30和120 min的CLSM圖像Fig.6 CLSM images of DAPI-stained MRSA co-incubated with PEDOT:PSS for 5,30 and 120 min

對于水溶性PEDOT:PSS的抗菌評價,采用了平板計數(shù)法研究其對MRSA、S.aureus的光熱抗菌活性,如圖7所示。與“Control”組相比,未添加PEDOT∶PSS,僅用NIR細菌存活率出現(xiàn)上升,表明NIR對細菌的生長具有一定的促進作用;“PEDOT:PSS-only”組細菌存活率沒有明顯變化,表明材料本身對細菌沒有毒性;而“PEDOT:PSS＋NIR”組的抗菌效果明顯,菌落數(shù)量顯著降低,MRSA的生存率:僅為0.97%±0.56%,S.aureus的生存率:僅為0.06%±0.10%,表明材料因光熱升溫對細菌造成了嚴重破壞,光熱抗菌效果顯著。進一步驗證了水溶性PEDOT:PSS應用于光熱抗菌領(lǐng)域的巨大潛力。

圖7 PEDOT:PSS光熱治療細菌S.aureus、MRSA的平板克隆及量化Fig.7 Plate cloning and quantification of PEDOT:PSS photothermal treatment of S.aureus and MRSA

3 結(jié) 論

實驗合成的水溶性聚合物PEDOT:PSS能將光能高效的轉(zhuǎn)化為熱能,光熱轉(zhuǎn)換效率高達46.4%;劑 量 在0.5 mg·m L－1時,溶 血 率 僅 為1.83%±0.13%,表明材料具有良好的生物安全性;能有效通過跨膜穿透細菌膜結(jié)構(gòu)進去細菌內(nèi)部,光熱抗菌評價實驗表明材料光熱抗菌效果顯著,驗證了水溶性聚合物PEDOT:PSS應用于光熱抗菌領(lǐng)域的巨大潛力。