新型鴨呼腸孤病毒的分離鑒定及板藍(lán)根合劑的預(yù)防效果評(píng)價(jià)

朱明恩，王光鋒，提金鳳，李 舫，李汝春，孫秋艷

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院/山東省畜禽抗菌藥使用減量化工程技術(shù)研究中心/山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，山東 濰坊 261061）

新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）主要引起雛鴨肝臟和脾臟的出血性壞死，臨床上也稱(chēng)之為“鴨新肝病” “鴨白點(diǎn)病” “鴨脾壞死病”等[1]，后統(tǒng)稱(chēng)“新型鴨呼腸孤病毒病”，其在血清學(xué)、基因型、抗原性、致病性等方面均不同于經(jīng)典番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）。新型鴨呼腸孤病毒病一般分為鴨出血性壞死性肝炎和鴨脾壞死病兩類(lèi)，鴨出血性壞死性肝炎與感染 MDRV的患鴨臨床癥狀相似，但 MDRV對(duì)北京鴨無(wú)感染性；而鴨脾壞死病的主要病變?cè)谄⑴K，與感染 MDRV的患鴨發(fā)病時(shí)期不同，脾臟病變亦存在著一定差異[2]。該病最初在 2005年的福建、廣東和浙江等地區(qū)陸續(xù)開(kāi)始出現(xiàn)，進(jìn)而快速的傳遍了中國(guó)主要的鴨生產(chǎn)地，現(xiàn)在已經(jīng)成為一種鴨的常見(jiàn)病和多發(fā)病[3]。該病在一年四季均有發(fā)生，且櫻桃谷鴨、麻鴨、番鴨、半番鴨等多種品種的鴨都可發(fā)病，發(fā)病日齡一般為 5~25 d，其發(fā)病率為 5 %～35 %，死亡率為 2 %～20 %。一般來(lái)說(shuō)，鴨的日齡越小，其發(fā)病率和死亡率越高。此外，隨著天氣越加寒冷，該病的發(fā)病率和死亡率也隨之增加[3-6]。該病毒可引起鴨脾臟壞死等病理性損傷，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制，進(jìn)而更容易引起細(xì)菌的繼發(fā)性感染[3,7,8]。近年來(lái)，NDRV在全國(guó)各地大面積流行，其作為鴨養(yǎng)殖地區(qū)流行的一種危害嚴(yán)重的傳染病，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失。

NDRV的基因組分為L(zhǎng)、M和S三類(lèi)基因片段。其中，L由 L1、L2、L3三條大片段組成，M 由 M1、M2、M3三條中片段組成，S則由S1、S2、S3、S4四條小片段組成?；蚪M可編碼至少14個(gè)蛋白（10個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白），其中 S1片段中的 σC蛋白是構(gòu)成病毒外衣殼的重要組成成分，其主要功能是吸附細(xì)胞和產(chǎn)生新型特異性中和抗體，是NDRV重要的免疫原性蛋白[9-11]。此外，σC蛋白不僅是禽呼腸孤病毒編碼蛋白中最容易變異的蛋白，也是鴨呼腸孤病毒同源性及遺傳進(jìn)化分析的重要參考依據(jù)[12-14]。本研究從山東多個(gè)地區(qū)的疑似呼腸孤病毒感染的鴨病料中分離鑒定出 5株 NDRV，并針對(duì)其 σC基因進(jìn)行測(cè)序分析，進(jìn)一步進(jìn)行同源性及遺傳進(jìn)化分析，以探究不同地區(qū)分離株的生物學(xué)特性差異。板藍(lán)根是常用的清熱解毒中藥，在防治各種病毒感染性疾病中發(fā)揮著重要作用。本研究利用5株分離株對(duì)板藍(lán)根合劑藥物對(duì)新型鴨呼腸孤病毒病的防治效果進(jìn)行的評(píng)價(jià)，以探究板藍(lán)根等藥物對(duì)新型鴨呼腸孤病毒病的防治效果，為該病的治療和防控提供新的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料樣品和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 疑似感染鴨呼腸孤病毒病料分別采自山東高唐、商河、新泰、濰坊、莘縣 5個(gè)地區(qū)的鴨場(chǎng)，10日齡 SPF鴨胚購(gòu)自山東濰坊地區(qū)某孵化場(chǎng)，7日齡雛鴨購(gòu)自山東臨沂某孵化場(chǎng)。

1.1.2 主要儀器和試劑 PCR儀購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad公司，凝膠成像設(shè)備購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad公司，均由學(xué)院動(dòng)物疫病檢測(cè)中心提供；HiScript II One Step RT-PCR Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 取適量疑似病鴨的壞死脾臟，用無(wú)菌剪刀剪碎后按照 1:5比例加入 PBS，用無(wú)菌的研磨器進(jìn)行研磨處理，將研磨好的組織勻漿轉(zhuǎn)移至無(wú)菌5 ml離心管中，置于-20 ℃ 反復(fù)凍融3次，6 000 rpm離心5 min，取上清液備用。

1.2.2 病毒分離培養(yǎng) 將 1.2.1中獲取的上清液用 0.22 μm 濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌，然后按照每個(gè)鴨胚0.2 ml的劑量，將其接種于10日齡SPF鴨胚中，每個(gè)樣品分別接種 5個(gè)鴨胚。此外，用無(wú)菌PBS溶液接種5個(gè)鴨胚作為陰性對(duì)照。將所有鴨胚置于 37 ℃ 恒溫箱中孵育培養(yǎng)，時(shí)刻觀察鴨胚的狀態(tài)，將24 h內(nèi)死亡的鴨胚棄掉，無(wú)菌操作收集72 h內(nèi)死亡的鴨胚及其尿囊液。將尿囊液按照上述方法接種于新的 SPF鴨胚中，連續(xù)傳代 3次，無(wú)菌收集第3代鴨胚的尿囊液備用。

1.2.3 RNA提取及 PCR鑒定 采用 Trizol法對(duì)1.2.2中第3代鴨胚的尿囊液樣品進(jìn)行RNA的提取，利用HiScript II One Step RT-PCR Kit試劑盒按照說(shuō)明書(shū)對(duì)鴨呼腸孤病毒 σC基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物為P1: 5'-ATGATGGATCGC AACGAGGCG-3'，下游引物為 P2: 5'-GGCGAAT AGCTCTTCTCATTAC-3'[15]。RT-PCR 反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min，PCR產(chǎn)物進(jìn)行 1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為本研究使用的 P1和P2引物。

1.2.4 測(cè)序結(jié)果分析 首先使用 Chromas軟件對(duì)雙向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接和校對(duì)，并在線與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 Blast分析，根據(jù)同源性來(lái)初步鑒定毒株；利用DNAStar軟件對(duì)病毒分離株σC蛋白的核苷酸和氨基酸序列分別進(jìn)行同源性分析；利用 MEGA7軟件對(duì)病毒分離株 σC蛋白的核苷酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析。同源性分析和進(jìn)化樹(shù)分析參考序列如下：NDRV-SY（MK 955827.1）、NDRV-SDLY18（MN 064706.1）、NDRV-SDHZYC（MK789277.1）、MDRV-ZJ99（DQ 643970.1）、MDRV-C4（DQ 066924.1）、MDRV-S12（DQ643970.1）、ARV-DVB03（KX 901897.1）、ARV-XY01（KX 451229.1）、ARVS1133（KF741762.1）。

1.2.5 病毒感染雛鴨的致病性試驗(yàn) 將 5株病毒分離株感染的第 3代的鴨胚尿囊液通過(guò)肌肉注射方式分別攻毒 10只 7日齡健康雛鴨（1.0 ml/只），另外取 10只健康雛鴨注射等體積無(wú)菌PBS，作為對(duì)照組。攻毒后每日觀察記錄雛鴨的發(fā)病和死亡情況。在第 7天處死所有雛鴨，觀察記錄肝臟病變情況。

1.2.6 板藍(lán)根合劑對(duì)新型鴨呼腸孤病毒防治效果評(píng)價(jià) 自制板藍(lán)根合劑配方：黃芪 30 g，板藍(lán)根、大青葉、貫眾、黃柏、茜草各 15 g，蒼術(shù)12 g，丹皮、澤瀉各 10 g，甘草 3 g。選取 40只7日齡健康雛鴨，隨機(jī)分為4個(gè)組（10只/組），1組和 2組飲用水中添加自制板藍(lán)根合劑（板藍(lán)根合劑 50 ml + 水 1 000 ml），30 ml/只，1 劑/d。3組和 4組飲用水中不添加藥物。連續(xù)喂藥 7 d后，按照 1.2.4中的方法對(duì) 2組和 3組進(jìn)行攻毒，試驗(yàn)動(dòng)物具體分組情況見(jiàn)表 1。每日觀察記錄雛鴨的發(fā)病和死亡情況，第 7天處死所有雛鴨，觀察記錄肝臟病變情況。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物分組信息

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離培養(yǎng)

SPF鴨胚接種樣本上清液后，自第 3代開(kāi)始，鴨胚的死亡時(shí)間和剖檢病變趨于穩(wěn)定。鴨胚的死亡時(shí)間主要集中在 48~72 h之間，且第3代的鴨胚死亡率達(dá)到了 100 %。不同時(shí)間點(diǎn)死亡的鴨胚均出現(xiàn)全身性的出血以及水腫。48 h死亡鴨胚和72 h死亡鴨胚的病變情況如圖1所示。

圖1 攻毒鴨胚的病變情況

2.2 病毒的分子生物學(xué)鑒定分析

對(duì)接種第 3代的鴨胚尿囊液進(jìn)行 RNA的提取，并以此為模板進(jìn)行 RT-PCR的檢測(cè)，5個(gè)待測(cè)樣品分別命名為 GT-1，SH-2，XT-3，WF-4，SX-5，RT-PCR檢測(cè)的凝膠電泳結(jié)果如圖 2所示，5個(gè)樣品均擴(kuò)增出 1000 bp左右的特異性條帶，條帶大小與預(yù)期的σC基因大小相一致。

圖2 5個(gè)分離株σC基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 分離株σC序列的同源性分析

使用DNAStar軟件，根據(jù)5個(gè)分離株的PCR陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果，將其與 GenBank中發(fā)布的NDRV-SY（MK955827.1）、NDRV-SDLY18（MN 064706.1）和NDRV-SDHZYC（MK789277.1）的σC核苷酸序列以及氨基酸序列分別進(jìn)行同源性分析，結(jié)果如表 2所示。5個(gè)分離株 σC基因的核苷酸和氨基酸同源性分別為 95.2 % ~ 99.6 %和 94.4 % ~ 99.7 %；而 5個(gè)分離株與其它 3個(gè)NDRV分離株的 σC基因的核苷酸和氨基酸同源性分別為96.9 % ~ 98.6 %和94.1 % ~ 99.4 %。

表2 分離株與NDRV的σC蛋白核苷酸和氨基酸同源性分析

2.4 分離株σC序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

根據(jù) σC基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)（圖3）發(fā)現(xiàn)，5個(gè)分離株與 NDRV毒株構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支，其中GT-1和SH-2以及XT-3和SX-5的遺傳距離較近，分別位于一個(gè)小分支，而WF-4則與其它 4株的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)；番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus, MDRV）代表株（MDRV-ZJ99、MDRV-S12和 MDRV-C4）和禽呼腸孤病毒（Avian reovirus, ARV）代表株（ARV-S1133、ARV-DVB03、ARV-XY01）也分別形成一個(gè)進(jìn)化分支。而 NDRV分支與MDRV、ARV分支親緣關(guān)系都相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖3 NDRV分離株σC基因序列進(jìn)化樹(shù)分析

2.5 病毒致病性分析

將5個(gè)病毒分離株各攻毒5只健康7日齡雛鴨，攻毒后觀察雛鴨的發(fā)病情況。攻毒雛鴨在24 h后開(kāi)始發(fā)病，表現(xiàn)為精神沉郁，食欲不振。攻毒 7 d后，頸靜脈放血處死所有雛鴨，剖檢并觀察肝臟病理變化，如圖 4所示，與對(duì)照組相比，5株分離株感染雛鴨的肝臟均出現(xiàn)不同程度的腫大和出血。如圖 5所示，與對(duì)照組相比，5株分離株感染雛鴨的脾臟出現(xiàn)不同程度的出血和壞死。

圖4 NDRV分離株感染雛鴨的肝臟病變

圖5 NDRV分離株感染雛鴨的脾臟病變

2.6 板藍(lán)根合劑對(duì)新型鴨呼腸孤病毒防治效果評(píng)價(jià)

板藍(lán)根防治效果評(píng)價(jià)試驗(yàn)共分為 4組：1組（板藍(lán)根組），2組（板藍(lán)根-攻毒組），3組（攻毒組），4組（空白對(duì)照組），每組10只雛鴨。攻毒后每日觀察記錄雛鴨狀態(tài)，在攻毒 7 d后，將所有雛鴨處死，剖檢并觀察肝臟病理變化，統(tǒng)計(jì)各組的發(fā)病雛鴨的數(shù)目。各組肝臟病變及發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表 3所示，各組肝臟病理變化如圖6所示。結(jié)果顯示，板藍(lán)根-攻毒組的發(fā)病率只有10 %，而攻毒組的發(fā)病率為 100 %，且肝臟病理結(jié)果表明在攻毒 7 d后，攻毒組雛鴨肝臟均有明顯的出血現(xiàn)象，而板藍(lán)根的使用明顯減弱了攻毒帶來(lái)的肝臟病變情況（圖6）。

表3 各組雛鴨肝臟病變及發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖6 板藍(lán)根合劑使用后NDRV分離株感染雛鴨的肝臟病變

3 討論

目前，新型鴨呼腸孤病毒病已經(jīng)成為鴨的一種常見(jiàn)病，該病主要導(dǎo)致雛鴨的肝臟和脾臟出血以及壞死，其死亡率并不高，但是其可引起脾臟壞死和免疫抑制，進(jìn)而可造成嚴(yán)重的繼發(fā)性感染和生長(zhǎng)遲緩等。此外，NDRV可以進(jìn)行垂直傳播，當(dāng)種鴨感染NDRV時(shí)，其很容易引起后代的大面積快速傳播[16]。因此，NDRV感染在實(shí)際生產(chǎn)中的防控非常困難。近年來(lái)，NDRV由于其高致病性和廣泛的宿主范圍，對(duì)養(yǎng)鴨產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的危害，現(xiàn)在急需開(kāi)發(fā)更有效的藥物和疫苗來(lái)防控NDRV感染[17]。

2011年該病在山東地區(qū)開(kāi)始流行傳播，近年來(lái)NDRV的報(bào)道逐漸增多，其作為鴨養(yǎng)殖地區(qū)流行的一種危害嚴(yán)重的傳染病，給山東地區(qū)養(yǎng)鴨業(yè)造成了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失[14]。為了進(jìn)一步明確山東地區(qū)NDRV的分布特征、致病性以及變異情況。筆者分別從高唐、商河、新泰、濰坊、莘縣地區(qū)收集并成功獲取 5個(gè)分離株，并對(duì)其進(jìn)行了同源性以及遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，本研究分離得到的5株毒株來(lái)均自不同地區(qū)，且與NDRV參考株的 σC基因的核苷酸和氨基酸同源性很高，這不僅支持了5個(gè)毒株屬于NDRV的觀點(diǎn)，也證實(shí)了NDRV在山東地區(qū)的廣泛流行。此外，5株分離株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示 5個(gè)分離株與 NDRV共同構(gòu)成同一遺傳分支，而與MDRV和 ARV的遺傳關(guān)系都相對(duì)較遠(yuǎn)。這也再次說(shuō)明了本研究鑒定的 5個(gè)分離株均屬于NDRV。分離株接種鴨胚試驗(yàn)結(jié)果顯示，5株NDRV連續(xù)接種3代之后，鴨胚的死亡時(shí)間和剖檢病變趨于穩(wěn)定。這些毒株均能致死鴨胚，且鴨胚的死亡時(shí)間主要集中于在 48~72 h之間，第 3代的鴨胚死亡率達(dá)到了100 %。48 h和72 h時(shí)間點(diǎn)死亡的鴨胚均出現(xiàn)全身性的出血以及水腫。此外，病毒感染雛鴨后24 h均引起雛鴨的精神沉郁、食欲不振等癥狀，病毒感染 7 d后發(fā)病率 100 %，且感染雛鴨的肝臟均出現(xiàn)不同程度的腫大和出血現(xiàn)象。上述結(jié)果顯示這些毒株與已報(bào)道的其他NDRV感染鴨胚時(shí)的致病特征基本相一致[14-15]。

板藍(lán)根是常用的清熱解毒中藥，多糖作為板藍(lán)根的主要成分，抗病毒效果顯著且應(yīng)用范圍廣泛，板藍(lán)根多糖既可以直接作用于病毒及其感染過(guò)程，在病毒感染細(xì)胞初期起到阻斷及抑制作用，又可在感染病毒后，以多種途徑參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，間接地起到抗病毒作用。板藍(lán)根多糖對(duì)多種病毒具有較好的阻斷及抑制作用，在我國(guó)已有悠久的應(yīng)用歷史[18-19]，在獸醫(yī)臨床上也被廣泛應(yīng)用[20-21]。本研究利用NDRV構(gòu)建了雛鴨的動(dòng)物感染模型，對(duì)板藍(lán)根合劑的預(yù)防效果進(jìn)行了分析評(píng)價(jià)。研究發(fā)現(xiàn)，NDRV攻毒雛鴨 7 d后，雛鴨的發(fā)病率為 100 %，且雛鴨肝臟均有出血等明顯的病理變化。板藍(lán)根合劑使用后再進(jìn)行攻毒，攻毒7 d后雛鴨的發(fā)病率僅為10 %，顯著低于攻毒組。與對(duì)照組相比，肝臟也沒(méi)有明顯的出血現(xiàn)象。上述結(jié)果揭示了本研究制備的板藍(lán)根合劑對(duì)新型鴨呼腸孤病毒病具有良好的預(yù)防效果，能夠有效抵抗NDRV的感染。

綜上所述，本研究從山東不同地區(qū)分離鑒定出 5株 NDRV，其 σC蛋白基因序列與其他NDRV具有很高的同源性，其致病性并未發(fā)生明顯的變化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)自制板藍(lán)根合劑在對(duì)抗NDRV時(shí)具有良好的預(yù)防效果，這不僅為鴨呼腸孤病毒病藥物研發(fā)上提供了新的思路，也為未來(lái)新型鴨呼腸孤病毒病的防控提供了重要的理論基礎(chǔ)。