熱滅活枯草芽孢桿菌對小鼠免疫機(jī)能的影響

魏可鋒，李 可, 于忠芳, 馮玉祥, 蘇 越，馬衛(wèi)明，閆振貴*

（1.山東省畜牧業(yè)貿(mào)易服務(wù)中心有限公司，山東 濟(jì)南 250000；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安）

益生菌（probiotics）廣泛存在于自然界和動(dòng)植物體內(nèi)，能分泌多種代謝產(chǎn)物，對宿主具有廣泛的益生作用?？莶菅挎邨U菌作為一種芽孢桿菌屬益生菌，具有環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，安全性高，用途廣泛等特點(diǎn)[1]。有研究表明，部分失去活性的益生菌仍能發(fā)揮活菌體原有的益生功能，并且在制備運(yùn)輸、安全性、臨床應(yīng)用等方面較活菌具備更大的優(yōu)勢，可廣泛用于功能性食品、臨床治療、飼料添加等各個(gè)領(lǐng)域，具有極大的研究價(jià)值[2-3]。目前，日本、美國等對滅活益生菌的應(yīng)用已形成了一定的產(chǎn)業(yè)規(guī)模[4]，而國內(nèi)相關(guān)益生菌的研究則主要集中在活菌上，對滅活菌功能和應(yīng)用的研究還比較少。因此，本研究利用熱滅活枯草芽孢桿菌灌服小鼠，評估其對小鼠免疫機(jī)能的作用，為相關(guān)滅活益生菌制劑的開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株及動(dòng)物 枯草芽孢桿菌，由山東青島根源生物公司提供，批號 W161041；SPF級昆明種小鼠，體重 18～22 g，購自山東泰邦生物制品有限公司。

1.1.2 主要試劑及溶液 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）生化試劑板購自北京安普生化有限公司；IL-2、IFN-γ ELISA 試劑盒由上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司提供；RIPA高效組織裂解液購自北京索萊寶公司、總 RNA提取試劑盒購自北京康為公司、M5 Super qPCR RT Kit、2×Fast Super EvaGreen? qPCR Mastermix購自US Everbright公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 滅活枯草芽孢桿菌菌液制備 枯草芽孢桿菌接種于 LB肉湯中，37 ℃ 振蕩培養(yǎng) 12 h，培養(yǎng) 3代后用菌落平板計(jì)數(shù)法計(jì)算菌液濃度。隨后在高壓滅菌鍋中滅活40 min，PBS重懸備用。

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物及分組 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 3 d后隨機(jī)分將成 5組，每組 4只，按照如下方式處理：空白對照組 BC（PBS），活菌對照組 VC（107CFU/ml活菌），低劑量（IV-L）、中劑量（IV-M）、高劑量（IV-H）滅活菌組（106、107、108CFU/ml滅活菌）。每只小鼠每天灌服菌液或PBS 0.3 ml，試驗(yàn)期間自由采食飲水，于灌胃7 d和14 d時(shí)處死小鼠，采集樣品進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 小鼠血清肝腎生化指標(biāo)測定 眼眶采血后離心獲取小鼠血清樣本，使用生化分析儀檢測樣品血清ALT、BUN、CREA的含量。

1.2.4 小鼠全血淋巴細(xì)胞數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)測定眼眶采血收集小鼠全血樣本，使用三分類血球分析儀檢測各樣本淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 小鼠脾指數(shù)測定 小鼠稱重后在無菌環(huán)境中采集脾組織，清除表面結(jié)締組織后稱重。脾指數(shù)（%）= 脾重量（mg）/體重（g）×100 %。

1.2.6 小鼠血清細(xì)胞因子含量測定 收集小鼠血清樣本，根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒說明書測定血清中IL-2和IFN-γ含量。

1.2.7 小鼠脾組織 IL-2 mRNA表達(dá)量的測定使用RNA提取試劑盒提取脾組織樣本總RNA并將其反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。隨后使用 Light-Cycler 96熒光定量PCR儀擴(kuò)增樣本cDNA，評估溶解曲線并記錄各反應(yīng)Ct值。試驗(yàn)結(jié)果以2-△△ct值表示，β-actin為內(nèi)參基因校準(zhǔn)表達(dá)。反應(yīng)條件為 95 ℃持續(xù) 30 s；40 個(gè)循環(huán)：95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s。引物序列為：IL-2 上游：5'-CTGGAGCAGCTGTTGATG-3'，下游：5'-CGA ATTGGCACTCAAATG-3'；β-actin 上游：5'-TGC TGTCCCTGTA TGCCTCT-3'，下游：5'-GGTCTT TACGGATGTCAACG-3'。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較使用 one-way ANOVA分析，并用Tukey's法檢驗(yàn)。P<0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱滅活枯草芽孢桿菌對小鼠肝腎生化指標(biāo)的影響

由表1可見，灌胃7 d與14 d時(shí)活菌組和滅活菌組的血清 ALT、BUN和 CREA含量未出現(xiàn)明顯波動(dòng)，且絕大部分試驗(yàn)組指標(biāo)與 BC組無顯著差異（P>0.05），表明試驗(yàn)周期內(nèi)滅活枯草芽孢桿菌對小鼠肝腎生化指標(biāo)無顯著影響，具有較高的安全性。

表1 熱滅活枯草芽孢桿菌對小鼠血清ALT、BUN、CREA含量的影響（n=4）

2.2 熱滅活枯草芽孢桿菌對小鼠脾指數(shù)的影響

由圖1可見，灌胃7 d時(shí)，IV-M組脾指數(shù)顯著高于 BC組（P<0.05）；灌胃 14 d時(shí)，IV-L和IV-M組脾指數(shù)均高于BC和VC組，但差異不顯著（P>0.05），表明中劑量滅活枯草芽孢桿菌提高小鼠脾指數(shù)效果較明顯。

圖1 各組脾指數(shù)的變化

2.3 熱滅活枯草芽孢桿菌對小鼠全血淋巴細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)的影響

由表2可見，灌胃7 d和14 d時(shí)，IV-M和IV-H組血液淋巴細(xì)胞數(shù)顯著高于 BC組（P<0.05）；滅活菌各組中性粒細(xì)胞數(shù)均高于 BC組，且 IV-H組具有顯著性（P<0.05）。這表明高劑量滅活枯草芽孢桿菌能有效提高小鼠血液中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)。

表2 全血淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)（×109個(gè)/L）（n=4）

2.4 熱滅活枯草芽孢桿菌對小鼠血清 IL-2和IFN-γ含量的影響

由圖2可見，灌胃7 d和14 d時(shí)，IV-H組血清 IL-2含量顯著高于 BC和 VC組（P<0.05）；與BC組相比，灌胃14 d時(shí)IV-L組血清IFN-γ含量顯著升高（P<0.05），說明灌服相應(yīng)濃度的熱滅活枯草芽孢桿菌能顯著促進(jìn)小鼠血清中IL-2和IFN-γ的分泌。

圖2 各組血清IL-2和IFN-γ含量變化

2.5 熱滅活枯草芽孢桿菌對小鼠脾組織 IL-2 mRNA表達(dá)水平的影響

由圖3可見，灌胃7 d時(shí)，與BC組相比，IV-M、IV-H組和VC組IL-2 mRNA表達(dá)水平顯著增加（P<0.05）；灌胃 14 d時(shí)，IV各組和 VC組 IL-2 mRNA水平均顯著高于 BC組（P<0.05），這與血清IL-2含量的檢測結(jié)果基本符合。

圖3 各組小鼠IL-2 mRNA相對表達(dá)量的變化

3 討論

近年來隨著人們對枯草芽孢桿菌研究的深入，其更多的特性進(jìn)入了人們的視野。有研究報(bào)道枯草芽孢桿菌能提高宿主機(jī)體免疫細(xì)胞的數(shù)量和活性，并激發(fā)后續(xù)的體液和細(xì)胞免疫，可作為一種良好的免疫激活劑[5]。益生菌的細(xì)胞壁成分、代謝產(chǎn)物、菌體細(xì)胞等均能刺激動(dòng)物腸道黏膜免疫系統(tǒng)[6]，其中胞壁含有的肽聚糖和外膜蛋白以及菌體代謝產(chǎn)物中游離脂肪酸和細(xì)菌素等能增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞活性，促進(jìn)IL-2和 IFN-γ等免疫活性因子分泌[7]。此外，熱滅活枯草芽孢桿菌還能刺激腸道黏膜中的B細(xì)胞活化，促進(jìn)局部免疫球蛋白的分泌，增強(qiáng)免疫功能[8]。

免疫器官是機(jī)體免疫系統(tǒng)重要的組成部分，評估免疫器官發(fā)育情況可以間接評估機(jī)體免疫機(jī)能。脾臟作為機(jī)體內(nèi)最大的外周免疫器官，是各種淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的聚集地，血液中大部分抗原在此被捕獲和處理[9]。另外，血液中的 T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等淋巴細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，它們在發(fā)揮體液免疫、細(xì)胞免疫、免疫信號傳導(dǎo)和調(diào)控等方面發(fā)揮重要的作用。此外，細(xì)胞因子在機(jī)體免疫反應(yīng)過程中同樣具有重要的作用。研究表明，部分細(xì)胞因子能參與T細(xì)胞的激活，后者又能促進(jìn)多種細(xì)胞因子的分泌，構(gòu)成機(jī)體復(fù)雜的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[10]。在這些細(xì)胞因子中，IL-2能刺激 B細(xì)胞增殖、分化和抗體分泌，誘導(dǎo) NK和 LAK等多種殺傷細(xì)胞活化[11]。IFN-γ 則能提高巨噬細(xì)胞和 NK 細(xì)胞的活性，增強(qiáng)IgG Fc片段受體表達(dá)。檢測這些細(xì)胞因子的分泌和表達(dá)有助于評估機(jī)體的免疫應(yīng)答水平。

本試驗(yàn)首先對熱滅活枯草芽孢桿菌的安全性進(jìn)行了評估，避免后續(xù)試驗(yàn)對宿主產(chǎn)生毒害作用。與先前報(bào)道一致，枯草芽孢桿菌安全性高，對宿主機(jī)體無明顯毒害作用[12]。隨后檢測了多種免疫相關(guān)指標(biāo)，來探究熱滅活枯草芽孢桿菌對小鼠免疫機(jī)能的作用。結(jié)果顯示，熱滅活枯草芽孢桿菌提高了小鼠脾指數(shù)、全血免疫細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞因子表達(dá)分泌量，對小鼠免疫機(jī)能起到有益的調(diào)節(jié)作用。有趣的是，在部分指標(biāo)中，滅活菌相較活菌具有更顯著的益生作用，可能的原因是滅活菌液中枯草芽孢桿菌以芽孢體為主，芽孢體形態(tài)的細(xì)菌表面有更多的抗原位點(diǎn)，能被機(jī)體免疫細(xì)胞更迅速的識(shí)別，從而引起廣泛和高效的免疫反應(yīng)[13]。此外，枯草芽孢桿菌在疫苗佐劑方面同樣具有應(yīng)用價(jià)值。鄧軍發(fā)現(xiàn)傳染性胃腸炎病毒疫苗中加入枯草芽孢桿菌可以使仔豬血清中特異性抗體額外增加[14]。盡管關(guān)于枯草芽孢桿菌是否能用于免疫佐劑和口服疫苗尚無明確定義，但枯草芽孢桿菌及其滅活微生態(tài)制劑具有的免疫調(diào)節(jié)作用值得關(guān)注。

4 結(jié)論

本研究表明，熱滅活枯草芽孢桿菌能通過提高小鼠脾指數(shù)、全血免疫細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞因子表達(dá)分泌量等方式發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用，可能是一種安全有效的免疫增強(qiáng)劑。然而，由于動(dòng)物模型的限制，熱滅活枯草芽孢桿菌免疫增強(qiáng)的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。