德拉馬尼血藥濃度測(cè)定方法的建立及應(yīng)用Δ

丁巧燕，張歡，馬麗華，李思思，張宇，周銘（武漢市肺科醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430030）

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由單一病原體引發(fā)的傳染病，是全球患者十大死亡原因之一，嚴(yán)重危害人類健康[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，2020年全球新發(fā)TB患者達(dá)990萬(wàn)例，發(fā)病率為127/10萬(wàn)，其中耐多藥結(jié)核病（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）和耐利福平TB患者共計(jì)13.22萬(wàn)例，但只有1/3的患者接受了適當(dāng)?shù)闹委?；我?guó)新發(fā)TB患者占全球新發(fā)患者總數(shù)的8.5%，位居世界第二[2]。

MDR-TB是由至少對(duì)異煙肼和利福平這兩種一線用于TB藥物耐藥的結(jié)核分枝桿菌引起的[3]。盡管臨床使用各種組合的強(qiáng)效藥物來(lái)進(jìn)行治療，但結(jié)核分枝桿菌已經(jīng)持續(xù)表現(xiàn)出抵抗抗結(jié)核藥的能力，耐藥TB菌株在全世界范圍內(nèi)以驚人的速度出現(xiàn)，每年約有50萬(wàn)例感染患者[4]。由于MDR-TB的治療成功率較低，臨床迫切需要新型的抗結(jié)核藥[5]。在此背景下，德拉馬尼（delamanid，DLM）于2014年獲得歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）批準(zhǔn)，并于同年被WHO推薦用于MDR-TB成年患者的治療[5]。

治療藥物監(jiān)測(cè)（therapeutic drug monitoring，TDM）是用于指導(dǎo)個(gè)體化診療的手段之一，其旨在通過(guò)血藥濃度來(lái)調(diào)整藥物劑量以提高治療效果、降低不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)最大限度地減少毒性[6]。DLM是一種雙環(huán)硝基咪唑類化合物，為新型抗結(jié)核藥，可通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)生成一氧化氮來(lái)發(fā)揮抗結(jié)核分枝桿菌的作用[7]。研究指出，DLM的療效具有濃度依賴性，血藥濃度過(guò)低可能導(dǎo)致療效不佳，血藥濃度過(guò)高則可能引發(fā)不良反應(yīng)[8]。因此，本文從臨床實(shí)際需求出發(fā)，建立了快速、準(zhǔn)確的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法，并將其用于檢測(cè)TB患者體內(nèi)DLM的血藥濃度，以期為臨床用藥提供指導(dǎo)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括4500MD型LC-MS/MS系統(tǒng)（美國(guó)AB Sciex公司），5810R型臺(tái)式高速大容量離心機(jī)、5424R型微量臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），Milli-Q Reference型超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司），XSR105DU型十萬(wàn)分之一分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]等。

1.2 主要藥品與試劑

DLM片（國(guó)藥準(zhǔn)字J20180086，規(guī)格50 mg）購(gòu)自日本 Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.；DLM 對(duì)照品（批號(hào)C08A11L110842，純度99%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；甲醇、甲酸、二甲基亞砜（DMSO）均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 空白血漿

空白血漿采集于武漢市肺科醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康者。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以 Phenomenex SynergiTMFusion-RP（50 mm×32 mm，4 μm）為色譜柱，以甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～0.5 min，40%A；0.5～0.6 min，40%A→90%A；0.6～2.9 min，90%A；2.9～3.0 min，90%A→40%A；3.0～4.0 min，40%A）；柱溫為40 ℃；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量為1 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multi-reaction monitoring，MRM）模式進(jìn)行正離子掃描；離子化電壓為5 500 V；霧化氣溫度為600 ℃；氣簾氣壓力為25 psi；碰撞氣壓力為6 psi；噴霧氣壓力為45 psi；輔助加熱氣壓力為55 psi；用于定量分析的DLM離子對(duì)為m/z535.0→352.0，碰撞能量為38.1 eV；去簇電壓為124.6 V；用于定性分析的DLM離子對(duì)為m/z535.0→356.9，碰撞能量為26.3 eV，去簇電壓為114.0 V。

2.3 對(duì)照品溶液和質(zhì)控樣品的制備

精密稱取DLM對(duì)照品10 mg，溶于DMSO中，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)備液，置于-20 ℃冰箱中保存。取適量?jī)?chǔ)備液，用DMSO稀釋，得質(zhì)量濃度分別為1、5、10、20、40、80、160 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和1、2、20、120 μg/mL的質(zhì)控溶液。精密量取空白血漿95 μL，分別加入上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各5 μL，制成質(zhì)量濃度分別為0.05、0.25、0.5、1、2、4、8 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品；同法制備質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、1、6 μg/mL的質(zhì)控血漿樣品，備用。

2.4 血漿樣品的處理

精密吸取待測(cè)血漿樣品40 μL，置于1.5 mL離心管中，精密加入甲醇360 μL，振蕩混勻1 min后，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行LC-MS/MS分析。

2.5 方法學(xué)考察

按照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則的相關(guān)要求進(jìn)行方法學(xué)考察[9]。

2.5.1 專屬性考察 取6份不同來(lái)源的空白血漿、空白血漿+DLM對(duì)照品（0.5 μg/mL）和服用DLM患者的血漿樣品，分別按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”“2.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，在上述條件下，DLM的保留時(shí)間約為1.9 min，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不影響DLM的測(cè)定，表明該方法專屬性良好，詳見(jiàn)圖1（空白血漿樣品圖略）。

圖1 DLM專屬性考察的色譜圖

2.5.2 線性關(guān)系和定量下限的考察 取“2.3”項(xiàng)下系列標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.1”“2.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以DLM峰面積為縱坐標(biāo)（y）、DLM質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），用最小加權(quán)法（加權(quán)系數(shù)為1/x2）進(jìn)行線性回歸，得DLM的回歸方程為y=1.745 45×106x+20 346.322 71（r=0.999 5）。結(jié)果表明，DLM檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為0.05～8 μg/mL，定量下限為0.05 μg/mL。

2.5.3 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下定量下限質(zhì)量濃度（0.05 μg/mL）和低、中、高質(zhì)量濃度（0.1、1、6 μg/mL）的質(zhì)控血漿樣品，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.1”“2.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定3 d，考察日間精密度；以實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，考察準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，該方法日內(nèi)和日間精密度的RSD均小于10%，準(zhǔn)確度為92.7%～104.9%，詳見(jiàn)表1。

表1 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.5.4 基質(zhì)效應(yīng)與萃取回收率試驗(yàn) 分別用3種方法制備低、中、高質(zhì)量濃度（0.1、1、6 μg/mL）的待測(cè)樣品——第1組：取DLM對(duì)照品適量，用50%甲醇稀釋，制成低、中、高質(zhì)量濃度的DLM溶液，按照“2.1”“2.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，得峰面積A；第2組：取空白血漿，加9倍體積的甲醇以沉淀蛋白，離心后取上清液（具體操作同“2.4”項(xiàng)），以此上清液作為基質(zhì)，制備低、中、高質(zhì)量濃度的DLM樣品溶液，按照“2.1”“2.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，得峰面積B；第3組：取DLM對(duì)照品適量，用空白血漿稀釋，制成低、中、高質(zhì)量濃度的DLM血漿樣品，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.1”“2.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，得峰面積C。按下式分別計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)和萃取回收率：基質(zhì)效應(yīng)=B/A×100%，萃取回收率=C/B×100%。各質(zhì)量濃度樣品平行操作5份。結(jié)果顯示，各樣品的平均基質(zhì)效應(yīng)為94.3%～107.5%，平均萃取回收率為93.2%～98.1%，詳見(jiàn)表2。

表2 基質(zhì)效應(yīng)與萃取回收率試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）

表2 基質(zhì)效應(yīng)與萃取回收率試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）

理論質(zhì)量濃度/（μg/mL）0.1 1 6基質(zhì)效應(yīng)/%107.5±3.0 98.6±1.0 94.3±2.7萃取回收率/%98.1±2.8 93.2±1.6 96.7±1.4

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照“2.3”項(xiàng)下方法制備低、中、高質(zhì)量濃度（0.1、1、6 μg/mL）的質(zhì)控血漿樣品，分別于室溫下放置2 h、4 ℃放置6 h、-20 ℃下放置7 d、-80 ℃放置15 d、反復(fù)凍融（-80 ℃～室溫）2或3次后，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.1”“2.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，考察各樣品在上述條件下的穩(wěn)定性（各質(zhì)量濃度樣品平行操作5份，結(jié)果以實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度的RSD表示）。結(jié)果顯示，除反復(fù)凍融3次外，各樣品在其余條件下放置的穩(wěn)定性均較好（RSD均小于10%），詳見(jiàn)表3。

表3 血漿樣品的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝5，%）

同時(shí)，按照“2.3”項(xiàng)下方法配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的DLM儲(chǔ)備液和質(zhì)量濃度分別為10、80 μg/mL的DLM標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察上述溶液于室溫下放置6 h、4 ℃放置15 d的穩(wěn)定性（各質(zhì)量濃度樣品平行操作5份，結(jié)果以實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度的RSD表示）。結(jié)果顯示，各樣品在上述條件下放置的穩(wěn)定性均較好（RSD均小于10%），詳見(jiàn)表4。

表4 儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝5，%）

2.5.6 殘留效應(yīng) 取“2.3”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為8 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.1”“2.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，隨后同法測(cè)定空白血漿樣品以考察殘留效應(yīng)。結(jié)果顯示，在DLM相同的保留時(shí)間處，空白血漿樣品對(duì)應(yīng)色譜峰峰面積與定量下限質(zhì)量濃度血漿樣品色譜峰峰面積的比值小于5%，表明殘留效應(yīng)對(duì)DLM的定量分析無(wú)明顯影響。

2.5.7 稀釋可靠性 取“2.3”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為8 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品，用空白血漿稀釋10倍后，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.1”“2.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析以考察稀釋可靠性（樣品平行操作5份）。結(jié)果顯示，稀釋后樣品的精密度RSD小于10%，準(zhǔn)確度為98.9%，表明血漿樣品用空白血漿稀釋10倍對(duì)DLM的定量分析無(wú)明顯影響。

2.6 方法應(yīng)用

2.6.1 患者的納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)包括：（1）年齡18～65歲；（2）臨床確診為MDR-TB患者；（3）規(guī)律服用DLM片1周以上，中途未中斷或未更改劑量；（4）同意參加試驗(yàn)并已簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：（1）不耐受藥物不良反應(yīng)者；（2）1周內(nèi)服用對(duì)DLM藥物濃度有影響的藥物者，如利福平等強(qiáng)細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP）3A4誘導(dǎo)劑[8]；（3）妊娠期或哺乳期婦女。本研究方案經(jīng)武漢市肺科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，批件號(hào)為武肺倫理（2021）20號(hào)。

2.6.2 用藥情況 本研究共納入我院2021年4-10月收治的MTB-TB患者6例。其中，男性2例、女性4例；平均年齡為（28.8±11.7）歲；所有患者均口服DLM片，每次100 mg，每天2次，連續(xù)服用1周以上。

2.6.3 檢測(cè)方法及結(jié)果 使用乙二胺四乙酸抗凝管采集患者末次服藥后4 h的靜脈血，于4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，取上層血漿于離心管中，置于-80 ℃冰箱中保存，備用。取患者血漿樣品，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.1”“2.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并使用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算DLM的血藥濃度。結(jié)果顯示，6例患者體內(nèi)DLM的血藥濃度為0.61～2.76 μg/mL，平均（1.67±0.74）μg/mL。

3 討論

DLM是一種霉菌酸生物合成抑制劑，對(duì)復(fù)制和休眠的結(jié)核分枝桿菌以及細(xì)胞內(nèi)外的結(jié)核桿菌均具有抑制活性[10—11]。有研究指出，DLM聯(lián)合其他活性藥物用于難治性耐藥TB，可實(shí)現(xiàn)較高的培養(yǎng)陰性率，且具有良好的安全性[12]。然而，在DLM上市后不久，臨床出現(xiàn)了耐DLM結(jié)核桿菌感染患者，因此對(duì)該藥的耐藥性進(jìn)行系統(tǒng)監(jiān)測(cè)很有必要[13]。為了最大限度地延緩和減少耐DLM結(jié)核桿菌的出現(xiàn)，選擇綜合治療方案并于治療期間進(jìn)行TDM十分重要，通過(guò)監(jiān)測(cè)DLM血藥濃度，可及時(shí)調(diào)整給藥劑量，有助于實(shí)現(xiàn)個(gè)體化給藥、降低耐藥率、提高臨床療效。

TDM常用的分析技術(shù)主要有光譜法、色譜法和免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)等，從藥物專屬性上推薦采用LC-MS/MS和高效液相色譜（HPLC）技術(shù)[14]。由于DLM在患者體內(nèi)的血藥濃度較低，HPLC技術(shù)已不能滿足臨床監(jiān)測(cè)需求，而LC-MS/MS技術(shù)專屬性強(qiáng)、靈敏度高，可降低內(nèi)源性物質(zhì)和其他藥物的干擾，加之檢測(cè)速度較快，故適用于DLM血藥濃度的大樣本監(jiān)測(cè)?；诖?，本研究建立了檢測(cè)DLM血藥濃度的LC-MS/MS法并將其應(yīng)用于臨床。

在流動(dòng)相的選擇中，為了弱化色譜峰拖尾并提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，本課題組分別考察了流動(dòng)相中加入甲酸或（和）甲酸銨后的出峰情況，結(jié)果顯示，在水相中加入甲酸，所得色譜峰的峰形較好；隨后，本課題組依次以0.1%、0.2%甲酸溶液為水相，考察了兩者的分離效果，最終選擇了0.1%甲酸溶液作為水相，并確定了“2.1”項(xiàng)下色譜條件。

本課題組前期在掃描母離子時(shí)發(fā)現(xiàn)，DLM易形成[M+H]+峰，且在MRM正離子模式下的靈敏度較高；隨后，本課題組對(duì)離子化電壓、霧化氣溫度、氣簾氣壓力、碰撞氣壓力、碰撞能量、去簇電壓等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以進(jìn)一步提高靈敏度并降低基線信噪比，最終得到了“2.2”項(xiàng)下質(zhì)譜條件。

研究指出，以甲醇沉淀蛋白所得樣品的基質(zhì)效應(yīng)明顯[15]。為此，本課題組首先在滿足DLM血藥濃度定量分析的前提下適當(dāng)增加甲醇的體積，以減少基質(zhì)效應(yīng)的影響，最終確定按血漿-甲醇（1∶9，V/V）進(jìn)行蛋白沉淀。隨后，本課題組采用梯度洗脫方式，通過(guò)調(diào)整流速、優(yōu)化水相和有機(jī)相的比例，盡可能地減少內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

本課題組前期分別采用內(nèi)標(biāo)法（以DLM同位素為內(nèi)標(biāo)）和外標(biāo)法進(jìn)行DLM的定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種方法并無(wú)明顯差別。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[16—17]推薦，為縮短臨床大樣本監(jiān)測(cè)時(shí)間并降低檢測(cè)成本，本研究最終選擇了外標(biāo)法，以隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MDR-TB患者體內(nèi)DLM的血藥濃度。

對(duì)比Meng等[18]所建的方法，本研究所建方法需要的樣本量較少，僅需40 μL的血漿即可完成檢測(cè)；同時(shí)，以甲醇沉淀蛋白進(jìn)行血漿樣品前處理，操作較為簡(jiǎn)便；在流動(dòng)相組成方面，本法使用了成本較低且組成簡(jiǎn)單的甲醇-甲酸溶液；此外，DLM的出峰時(shí)間為1.9 min，檢測(cè)時(shí)間不超過(guò)4 min，適用于臨床大樣本的快速檢測(cè)。

綜上所述，本研究成功建立了檢測(cè)人血漿中DLM濃度的LC-MS/MS法，可用于檢測(cè)MDR-TB患者體內(nèi)DLM的血藥濃度。由于目前暫無(wú)明確的DLM有效治療濃度范圍，且本研究的樣本量較小，故后期本課題組將擴(kuò)大樣本量進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)收集該藥有效性和安全性的相關(guān)數(shù)據(jù)，完善臨床藥動(dòng)學(xué)研究。