高濃度氫氧氣治療豚鼠爆震性耳聾的初步研究

李歡于寧

1蘇州市第九人民醫(yī)院耳鼻喉科

2解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部研究所

爆震性聽力損失（explosion-induced hearing loss，EIHL）又稱爆震性聾，是由超過140dB的高聲強(qiáng)噪聲（或壓力波）導(dǎo)致聽覺器傷害造成的。其聽力損失常在很短的時(shí)間內(nèi)即達(dá)高峰。在戰(zhàn)爭(zhēng)和軍事演習(xí)期間，各種槍炮，甚至現(xiàn)代化武器，如導(dǎo)彈等的爆破，極易造成軍人及普通民眾的聽力損失。調(diào)查得出我軍服役2年以上的高炮兵的聽力損失達(dá)48.3%，炮兵為37.5%，裝甲兵為30.6%，艦艇部隊(duì)（0.5-12年）為23.5%的發(fā)病率[1]。日常生活中，爆竹煙花的燃放、采石開礦等施工時(shí)的爆破性作業(yè)，甚至鍋爐、家用電器等的爆炸也成為爆震性耳聾發(fā)生的原因。目前耳聾的氣體治療方法中，以高壓氧治療為主，但此方法存在一定的禁忌癥，如上呼吸道感染、重度肺氣腫、活動(dòng)性內(nèi)出血及出血性疾病、血壓過高等均不適宜行高壓氧治療，故尋找新的氣體治療方法，以期替代高壓氧治療，為臨床治療提供新的選擇。近年氫氧氣成為治療新冠肺炎的治療方法之一，可有效提高患者通氣效率[2]。同時(shí)國內(nèi)外學(xué)者研究證實(shí)，氫氣在預(yù)防噪聲性耳聾方面有良好的效果[3]，但對(duì)噪聲性耳聾的治療研究較少，本文通過研究高濃度氫氧氣治療爆震性耳聾的效果，以期為臨床提供一種新的氣體治療方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)白色紅目、ABR閾值正常、耳廓反射靈敏的Hartley豚鼠15只，體重均為250-300g，雌雄不限，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 動(dòng)物分組

隨機(jī)分成3組，空白對(duì)照組5只、噪聲組5只、氫氧氣治療組5只。治療結(jié)束后每組2只行掃描電鏡檢測(cè)，另3只行琥珀酸脫氫酶染色。

1.3 噪聲暴露

將清醒狀態(tài)的豚鼠放置于特制的籠內(nèi)，將其頭部固定于正中，且脈沖噪聲暴露過程中不會(huì)轉(zhuǎn)動(dòng)，確保雙耳同等的接受脈沖噪聲刺激。在專用的消聲室自由聲場(chǎng)中，將特制的脈沖噪聲激發(fā)裝置置于動(dòng)物頭部前方水平位，距離豚鼠雙耳耳廓前緣約5cm。給予壓力峰值為163 dB SPL，脈寬為0.25ms，間隔時(shí)間為6.5s的脈沖噪聲，分別連續(xù)暴露30次。為排除脈沖噪聲裝置自身物理特性改變所導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差，在每次噪聲暴露前均使用聲級(jí)計(jì)對(duì)裝置進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.4 氫氧混合吸入氣治療

根據(jù)新冠肺炎治療指南給出的數(shù)據(jù)，本實(shí)驗(yàn)使用氫氧霧化機(jī)給予豚鼠高濃度氫氧氣吸入，機(jī)器由上海潓美公司提供。氫氧氣治療組在噪聲暴露后即刻給予高濃度氫氧氣（H2:66.7%,O2:33.3%）吸入治療，每天一次，每次90min，10天為一療程。

1.5 聽力檢測(cè)

于噪聲暴露前、暴露后即刻、氫氧氣治療10次后測(cè)聽性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response,ABR）閾值。本測(cè)試使用美國TDT系統(tǒng)，在隔聲屏蔽室內(nèi)完成，首先將清醒的豚鼠固定在特制的裝置中，然后將記錄電極放在顱頂正中皮下，參考電極放在測(cè)試耳耳廓皮下，接地電極放在對(duì)側(cè)耳耳廓皮下，采 用短聲（click）、短純音（Tone Burst）4000Hz、8000Hz、16000Hz為刺激聲，每次刺激1024次，以能分辨出可重復(fù)的ABR波Ⅲ的最低刺激強(qiáng)度來判斷閾值。

1.6 掃描電鏡檢測(cè)（scanning electron microscopy,SEM）

高濃度氫氧氣治療療程結(jié)束并測(cè)定完ABR閾值后，進(jìn)行掃描電鏡檢測(cè)。麻醉豚鼠，斷頭取耳蝸，在蝸尖打一小孔，將卵圓窗膜和圓窗膜刺破，用2.5%戊二醛固定液反復(fù)灌流3次后浸泡于戊二醛固定液中，于4℃冰箱中過夜。用10%EDTA脫鈣液脫鈣，約20天左右，至用鑷子輕刺骨質(zhì)部分無阻力即可。將脫鈣后的耳蝸浸泡在0.1M PBS中，在解剖顯微鏡下分離基底膜，制作出完整的耳蝸標(biāo)本。將耳蝸標(biāo)本放入1%四氧化鋨固定液中固定2h。用緩沖液充分漂洗后放入2%單寧酸溶液中1h，中間更換一次新液。導(dǎo)電染色后將耳蝸標(biāo)本用0.1M PBS充分漂洗，再用1%四氧化鋨固定液再次固定1h。酒精梯度脫水。使用HCP-2型臨界點(diǎn)干燥儀進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，于解剖顯微鏡下定位。使用E-102型離子濺射儀對(duì)標(biāo)本進(jìn)行鍍膜。最后使用HICATHI S-4800冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡對(duì)耳蝸標(biāo)本進(jìn)行觀察和拍照。

1.7 琥珀酸脫氫酶染色（succinate dehydrogenase,SDH）

高濃度氫氧氣治療療程結(jié)束并測(cè)定完ABR閾值后，進(jìn)行琥珀酸脫氫酶染色。麻醉豚鼠，斷頭取耳蝸，放入裝有琥珀酸脫氫酶染液的培養(yǎng)皿中。在解剖顯微鏡下用鑷子在蝸尖打一小孔，刺破卵圓窗膜和圓窗膜，用一次性塑料吸管將新鮮配制的琥珀酸脫氫酶染液緩慢自蝸頂小孔灌入，使染液經(jīng)前庭階、鼓階從前庭窗和圓窗流出，反復(fù)緩慢灌流3次后置于琥珀酸脫氫酶染液中，37℃恒溫箱中孵育1h。用4%多聚甲醛固定液灌流3次后浸泡于多聚甲醛固定液中，常溫下固定4h。將耳蝸置于盛有0.01M PBS的培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下用鑷子分離出耳蝸基底膜，將基底膜平鋪在載玻片上，用甘油封片。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果均采用表示，使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析數(shù)值資料，使用Sigma Plot 10.0軟件制作統(tǒng)計(jì)圖，統(tǒng)計(jì)方法均采用重復(fù)測(cè)量因素的方差分析，如果P＜0.05,可認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 聽力檢測(cè)結(jié)果

在噪聲暴露前各組的ABR閾值之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。噪聲暴露后即刻氫氧氣治療組與噪聲組在各頻率之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），總體分析，和噪聲組相比，高濃度氫氧氣吸入治療可以降低4kHz的ABR閾值，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.022）。在頻率為4kHz，治療10次后及頻率為8kHz，治療10次后，氫氧氣治療組與噪聲組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.015，P=0.032），其余各頻率各時(shí)間點(diǎn)氫氧氣治療組的ABR閾值與噪聲組之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表1及圖1）

表1 噪聲暴露前后各組豚鼠ABR閾值（click，±s，n=10）dB SPLTable 1 ABR thresholds of guinea pigs in each group before and after noise exposure(click,±s,n=10)dB SPL

表1 噪聲暴露前后各組豚鼠ABR閾值（click，±s，n=10）dB SPLTable 1 ABR thresholds of guinea pigs in each group before and after noise exposure(click,±s,n=10)dB SPL

high-concentration hydrogen and oxygen inhalation in the treatment of explosion-induced hearing loss.the ABR thresholds at each time point after noise exposure were higher in the noise group than in the hydrogen and oxygen treatment group,but there was no statistical difference.Compared between groups,there was no significant difference in ABR threshold between the hydrogen and oxygen treatment group and the noise group(P＞0.05).Note:The maximum sound intensity is 100 dB SPL,and those greater than 100 dB SPL are expressed as 105 d B SPL.

Control group Noise group Before noise exposure Immediately after noise exposure Ten times after hydrogen and oxygen therapy 27.00±2.5826.00±3.94 Hydrogen and oxygen therapy group 26.50±2.42 26.50±4.1272.00±13.5864.00±13.90 28.50±2.4268.00±16.0258.00±12.06

圖1 噪聲暴露前后各組豚鼠ABR閾值的變化。在噪聲暴露前各組的ABR閾值之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。噪聲暴露后即刻氫氧氣治療組與噪聲組在各頻率之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？傮w分析，和噪聲組相比，氫氧氣治療可以減輕4kHz的ABR閾值，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.022）。在頻率為4kHz，治療10次后及頻率為8kHz，治療10次后，氫氧氣治療組ABR閾值均較噪聲組低（P＜0.05），注：TH group：氫氧氣治療組，Noise group：噪聲組，Control group：空白對(duì)照組。**P＜0.01:vs.空白對(duì)照組；#P＜0.05:噪聲組vs.氫氧氣治療組。n=10耳Fig.1 Changes of ABR thresholds of guinea pigs in each group before and after noise exposure.There was no significant difference in ABR thresholds between groups before noise exposure(P＞0.05).Immediately after noise exposure,there was no significant difference between the hydrogen and oxygen therapy group and the noise group in each frequency(P＞0.05).In the overall analysis,compared with the noise group,hydrogen and oxygen therapy could reduce the ABR threshold at 4 kHz,which was statistically significant(P=0.022).At the frequency of 4 kHz,ten times after hydrogen and oxygen therapy and at the frequency of 8 kHz,ten times after hydrogen and oxygen therapy,the ABR threshold of the hydrogen and oxygen therapy group was lower than that of the noise group (P＜0.05).Note:**P＜0.01: vs.control group;#P＜0.05:noise group vs.hydrogen and oxygen therapy group.n=10 ears

2.2 掃描電鏡結(jié)果（SEM）

掃描電鏡均觀察豚鼠耳蝸基底膜的中回，見空白對(duì)照組豚鼠耳蝸基底膜三排外毛細(xì)胞排列整齊，纖毛無缺失。噪聲組豚鼠的耳蝸外毛細(xì)胞纖毛大量缺失、分叉、倒伏。氫氧氣治療組豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞纖毛缺失、倒伏現(xiàn)象較噪聲組少。（見圖2）

圖2 各組豚鼠耳蝸的掃描電鏡結(jié)果（放大倍數(shù)×1500）A：空白對(duì)照組，外毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。B：氫氧氣治療組，可見外毛細(xì)胞纖毛部分缺失、倒伏，但較噪聲組缺失少。C：噪聲組，可見外毛細(xì)胞纖毛大量缺失、分叉、倒伏，第一排外毛細(xì)胞纖毛缺失最嚴(yán)重。注：In：內(nèi)毛細(xì)胞；O1～O3：三排外毛細(xì)胞。Fig.2 Scanning electron microscope results of guinea pig cochlea in each group(magnification×1500)A:control group,the structure of outer hair cells is normal.B:In the hydrogen and oxygen therapy group,the cilia of the outer hair cells were partially missing and lodging,but less than that in the noise group.C:Noise group,it can be seen that the cilia of outer hair cells are largely missing,bifurcated,and lodging,and the first row of outer hair cell is the most serious.

2.3 琥珀酸脫氫酶染色結(jié)果（SDH）

空白對(duì)照組可見三排外毛細(xì)胞排列整齊，毛細(xì)胞內(nèi)充滿深藍(lán)色沉淀物，呈強(qiáng)陽性。噪聲組外毛細(xì)胞著色稍淺，外毛細(xì)胞缺失、腫脹。氫氧氣治療組外毛細(xì)胞著色較深，外毛細(xì)胞部分腫脹，較噪聲組損傷輕。（見圖3）

圖3 各組豚鼠的琥珀酸脫氫酶染色結(jié)果（放大倍數(shù)×400）A：空白對(duì)照組，可見三排外毛細(xì)胞內(nèi)充滿深藍(lán)色沉淀物，呈強(qiáng)陽性。B：氫氧氣治療組，可見外毛細(xì)胞著色較深，外毛細(xì)胞部分腫脹，較噪聲組損傷輕。C：噪聲組，可見外毛細(xì)胞著色稍淺，外毛細(xì)胞缺失、腫脹。注：O1～O3：三排外毛細(xì)胞。Fig.3 The results of succinate dehydrogenase staining of guinea pigs in each group(magnification×400)A:In the control group,three rows of outer hair cells were filled with dark blue precipitates,which were strongly positive.B:In the hydrogen and oxygen therapy group,the outer hair cells were darker in color,and the outer hair cells were partially swollen,and the damage was lighter than that in the noise group.C:Noise group,the outer hair cells are slightly lighter in color,and the outer hair cells are missing and swollen.Note:O1～O3:three rows of outer hair cells.

3 討論

在戰(zhàn)爭(zhēng)和各種爆破作業(yè)時(shí)，急性聲創(chuàng)傷很常見，為一種暴露于一次突然發(fā)生的強(qiáng)烈爆震或聲音后所引起的損害。爆震聲除了引起聽覺器官損傷外，也對(duì)人體其他部位產(chǎn)生不利影響，如煩躁、失眠、多夢(mèng)、易疲勞、情緒抑郁、血壓升高、心動(dòng)過緩或者心動(dòng)過速，還可能出現(xiàn)幻聽等癥狀[4]。爆震對(duì)聽覺器官的損失機(jī)制主要是機(jī)械性破壞和代謝紊亂[5]。爆震可造成鼓膜破裂及內(nèi)耳損傷，如聽小骨骨折或脫位、出血、蝸窗膜破裂、螺旋器、前庭器官甚至聽神經(jīng)損傷。繼之出現(xiàn)代謝異常，主要表現(xiàn)為耳蝸的能量代謝紊亂、相關(guān)酶的代謝障礙和代謝產(chǎn)物如自由基的增加，導(dǎo)致毛細(xì)胞、支持細(xì)胞、螺旋神經(jīng)的變性、溶解和消失。已有學(xué)者證實(shí)氫氣在預(yù)防噪聲性耳聾方面有良好效果[6-8]，給予一次氫氣預(yù)防的有效持續(xù)時(shí)間為2-4小時(shí)[9]，但關(guān)于高濃度氫氣治療噪聲性耳聾方面的文章較少。

本文通過在噪聲暴露后給予豚鼠高濃度氫氧氣治療，來證實(shí)氫氧氣在治療爆震性耳聾方面的作用?？傮w分析，和噪聲組相比，高濃度氫氧氣吸入治療可以降低4kHz的ABR閾值，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療10次后，在頻率4kHz及8kHz，氫氧氣治療組與噪聲組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余各頻率各時(shí)間點(diǎn)氫氧氣治療組的ABR閾值與噪聲組之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明高濃度氫氧氣在治療爆震性耳聾方面有一定的效果。掃描電鏡結(jié)果顯示，噪聲組豚鼠的耳蝸外毛細(xì)胞纖毛缺失、分叉、倒伏等現(xiàn)象較氫氧氣治療組豚鼠嚴(yán)重，說明高濃度氫氧氣治療可以減輕毛細(xì)胞的損傷。琥珀酸脫氫酶的活性可作為評(píng)價(jià)三羧酸循環(huán)運(yùn)行程度的指標(biāo)，已成為評(píng)價(jià)線粒體功能的標(biāo)志酶[10，11]。本實(shí)驗(yàn)采用琥珀酸脫氫酶染色，可見噪聲組外毛細(xì)胞較氫氧氣治療組著色淺，外毛細(xì)胞缺失、腫脹等情況較之嚴(yán)重。說明高濃度氫氧氣可以減輕線粒體的損傷，減輕代謝紊亂對(duì)聽力的損害。

Ohsawa等[12]首先發(fā)現(xiàn)氫氣具有選擇性的抗氧化作用，可以有選擇的減輕羥自由基和過氧亞硝基陰離子誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。氫氣能降低白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α等炎癥因子在組織中的含量[8]，有抑制炎癥反應(yīng)的作用。氫氣可降低8-羥基脫氧鳥苷的免疫活性[13]，減輕DNA的損傷。氫氣可以提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)等的活性，從而清除體內(nèi)的有害物質(zhì)及自由基，減輕氧化應(yīng)激造成的損傷。氫氣還能使Caspase-3的活性下降，下調(diào)Caspase-3等凋亡蛋白的表達(dá)，減少螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡[14]。通過以上研究證明了氫氣具有抗氧化、抗炎、減輕DNA損傷、抗凋亡等作用，可以減輕噪聲引起的機(jī)械性損傷及繼之出現(xiàn)的代謝性損傷，減輕閾移損傷，減少耳蝸外毛細(xì)胞的缺失，減輕線粒體的損傷。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這一觀點(diǎn)。

目前臨床上治療爆震性耳聾主要采用高壓氧治療，李宗華等[15]研究證實(shí)高壓氧綜合治療的總有效率為91.3%(53/58)，療效肯定。但高壓氧治療存在一定的禁忌癥，有一部分患者無法行此種治療。氫氣同樣作為一種氣體，擴(kuò)散速度快，易于通過狹小的孔隙，可進(jìn)入細(xì)胞核和線粒體，易于透過血迷路屏障[16]，可以到達(dá)耳蝸，發(fā)揮作用，且目前尚無明顯禁忌癥。氫氣可在人體的大腸中產(chǎn)生，因此氫氣是人體的內(nèi)源性氣體，可說明氫氣對(duì)人體無害。Yao等[17]研究證實(shí)，氫氣用于人體治療安全且有效。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)高濃度氫氧氣在治療豚鼠爆震性耳聾方面有一定的效果。