• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    聚維酮碘對豚鼠耳毒性的實驗觀察

    2022-12-29 09:47:48廖輝煌金雪玲夏云燕李朝霞陳靜熊園平余蓉涂翔羅五根
    中華耳科學雜志 2022年6期
    關鍵詞:聚維酮毛細胞內(nèi)耳

    廖輝煌金雪玲夏云燕李朝霞陳靜熊園平余蓉涂翔羅五根

    1南昌大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(南昌 330000)

    2中山大學附屬第七醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(深圳 518107)

    慢性化膿性中耳炎是耳科學最常見疾病,其常見的癥狀是反復耳流膿與聽力下降,影響患者的工作與生活,鼓室成形術是目前主要治療方法。鼓室成形術術后患者有1%-11%的概率發(fā)生術區(qū)感染[1],其原因可能是與術前外耳和中耳未充分消毒及術中用生理鹽水沖洗術腔有關。目前,尚未有報道術前可用于中耳黏膜的消毒液。酒精和碘酒對皮膚黏膜有較大的刺激性,如遇面神經(jīng)裸露的患者,在中耳腔使用有致面癱的風險。在更早的研究中,已經(jīng)證明消毒劑氯己定,芐索氯銨和苯扎氯銨對豚鼠的內(nèi)耳具有耳毒性[2-4]。

    聚維酮碘(Povidone Iodine,PVP-I)溶液是一種高效廣譜的殺菌消毒劑,目前已廣泛應用外科手術中皮膚與黏膜的消毒。但有關聚維酮碘能否用于中耳腔黏膜消毒及進入中耳后對中耳黏膜及內(nèi)耳毛細胞有無影響尚不清楚。目前,國內(nèi)外有少量關于聚維酮碘對中耳腔和耳蝸毒性的研究,部分動物實驗結果與臨床實驗結論并不完全一致。本實驗通過鼓室內(nèi)注入聚維酮碘溶液后從聽力學、中-內(nèi)耳解剖、免疫熒光染色及HE染色方面驗證聚維酮碘是否會對內(nèi)耳造成損害,探索聚維酮碘能否用于鼓室成形術中外耳道皮膚與中耳黏膜的消毒及中耳炎合并真菌感染的耳浴治療。

    1 材料和方法

    1.1 實驗動物

    選取26只正常體重成年豚鼠,由湖南太平生物科技有限公司提供(許可證號:SCXK(湘)2020-0005),雌雄不限。入選條件:ABR反應闕<40dB nHL

    1.2 實驗方法

    1.2.1 分組與給藥

    隨機分成4組,一次生理鹽水給藥組(Once saline,OS)4只;一次聚維酮碘給藥組(Once PVP-I,OP)9只;連續(xù)生理鹽水給藥組(Continuous saline,CS)4只;連續(xù)聚維酮碘給藥組Continuous PVP-I,CP)9只。

    1.2.2 動物造模

    用電子分析天平稱取聚維酮碘粉末5.0g置容量瓶中,加生理鹽水定容至100ml,裝入棕色瓶中避光保存。一次給藥組:雙耳經(jīng)鼓室注射藥液0.2ml生理鹽水或聚維酮碘溶液,作用10min后吸出;連續(xù)給藥組:雙耳經(jīng)鼓室注射藥液0.2ml生理鹽水或聚維酮碘溶液,作用10min后吸出,一天一次,連續(xù)7天(圖1)。

    圖1 中耳腔給藥場景Fig.1 Scenario of drug delivery in the middle ear scene

    1.2.3 聽性腦干反應(ABR)測試

    左下腹腔按40mg/kg體重注射,2%戊巴比妥鈉溶液麻醉,記錄電極置于耳后,參考電極置于顱頂,接地電極置于鼻尖,利用誘發(fā)電位系統(tǒng)檢測記錄ABR反應閾(圖2)。以短聲作為刺激聲,以能分辨出可重復III波的最低刺激強度判斷閾值。

    圖2 ABR檢測場景Fig.2 ABR detection scene

    1.2.4 中耳黏膜觀察

    動物在過量麻醉狀態(tài)下,快速斷頭取兩側(cè)聽泡。由2位研究人員在顯微鏡下通過評分系統(tǒng)[5](表1)對中耳腔充血、水腫,黏膜增厚和粘連程度進行評分。最后計算各項總平均分,最低4分,最高20分,分值越高,表示總體損傷越嚴重。

    表1 中耳損傷嚴重程度的定義Table 1 Definitions for Severity of Middle Ear Damage

    1.2.5 耳蝸基底膜免疫熒光染色

    (1)剝離基底膜后用0.01M PBS洗三遍,每次10min;(2)PBST(0.25%Triton-PBS)浸泡 30 min;(3)5%BSA(PBST稀釋)室溫下封閉30min;(4)棄除BSA(5)滴加 PBST稀釋的一抗(1:200)及鬼筆環(huán)肽(1:200),4℃過夜保存 16h;(6)PBS漂洗 3次,每次10min;(7)滴加Alexa488標記的羊抗兔二抗,37℃避光孵育1h;(8)PBS漂洗3次,每次5min;(9)熒光防淬滅劑封片,免疫熒光顯微鏡下觀察,分別截取每組每個樣本耳蝸各回同等部位三排外毛細胞,在視野下記錄正常形態(tài)的細胞個數(shù)。

    1.2.6 HE染色方法

    取樣本置載玻片上,經(jīng)蘇木素染色,鹽酸乙醇分化,氨水反藍,伊紅染色,酒精脫水,二甲苯透明,封片后光鏡下閱片。

    1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

    應用SPSS25軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示,結果用t檢驗和Dunnett檢驗進行統(tǒng)計分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 ABR檢測結果

    實驗前,所有組豚鼠聽力全部正常,均在15-20dB nHL范圍(圖3a)。實驗后,OS和CS有1耳聽力稍有下降,變化范圍不超過10dB nHL(圖3b,c),差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);OP組有2耳聽力無下降,其余16耳有10-65dB nHL聽力下降(圖3d),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);CP組有14耳全聾,90dB nHL未能引出III波(圖3e),其余4耳亦有嚴重聽力損失,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時我們計算出四組間實驗后與實驗前聽力的差值發(fā)現(xiàn),CP組聽力差值最大,OP組聽力差值次之,OS和CS組聽力差值接近于0。對比四組間聽力差值發(fā)現(xiàn),除OS組與CS組聽力差值間差異無統(tǒng)計學意義外(P>0.05),余各組間聽力差值間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),因此CP組聽力下降最明顯,OP組次之,OS和CS組聽力改變最不明顯。統(tǒng)計結果見表2。

    表2 ABR 閾值(±s,n=56)(dB nHL)Table 2 ABR Thereshold(±s,n=56)(dB nHL)

    表2 ABR 閾值(±s,n=56)(dB nHL)Table 2 ABR Thereshold(±s,n=56)(dB nHL)

    Note:a,OS vs OP P<0.05;b,OS vs CP P<0.05;c,OP vs CS P<0.05;d,OP vs CP P<0.05;e,CS vs CP P<0.05

    Group OS OP CS CP Ear 8 18 8 18 Before administration 18.12±2.58 16.94±2.50 15.62±1.76 17.22±2.55 After administration 18.75±3.53 45.55±25.08 16.25±2.31 76.94±21.36 Difference between before and after administration 0.63±1.77a,b 28.61±24.60c,d 0.63±1.77e 59.72±22.3 T 1.00 4.93 1.00 11.34 P*P>0.05*P<0.05*P>0.05*P<0.05

    圖3 a:正常豚鼠閾值在15-20dB nHL之間;b:OS組給藥后有1耳閾值從15dB nHL上升到20dB nHL;c:CS組給藥后有1耳閾值從20dB nHL上升到25 dB nHL;d:OP組給藥后閾值從15dB nHL上升到60 dB nHL;e:CP組給藥后閾值從15dBnHL上升到90dB nHL以上,未能引出有效的III波。Fig.3 a:The threshold of normal guinea pigs was between 15-20dB nHL;b:The threshold of 1 ear in the OS group increased from 15dB nHL to 20dB nHL after administration;c:The threshold of 1 ear in the CS group increased from 20dB nHL to 25 dB nHL after administration 2;d The threshold of OP group increased from 15dB nHL to 60 dB nHL after administration;e:The threshold of CP group increased from 15dB nHL to more than 90dB nHL after administration,and failed to elicit effective wave III after administration.

    2.2 中耳、內(nèi)耳解剖結果

    OS組與正常解剖結構無明顯差異,蝸殼表面覆有一層透明的黏膜,黏膜表面有1-2根微細血管,未出現(xiàn)黏膜充血、增厚、血腫、粘連現(xiàn)象(4a圖);CS組偶見黏膜增厚和充血,無血腫和粘連形成;OP組以黏膜充血和血腫為主要變化,表現(xiàn)為蝸殼周圍黏膜充血的血管增多,中耳腔周圍出現(xiàn)不規(guī)則血腫,擴張的血管與之相連,無黏膜增厚和粘連現(xiàn)象(圖4b);CP組損傷最嚴重,聚維碘酮滲入耳蝸后大多數(shù)整體呈褐色,蝸尖顏色最深,呈深褐色,整個中耳腔增厚的黏膜面積大于90%,血腫及充血面積大于50%,滲出物填滿整個中耳腔(圖4c),中耳腔、前庭池及骨螺旋板上有大量淡黃色絮狀滲出物(圖4d),其余組中耳腔及內(nèi)耳未見絮狀滲出物。中耳腔評分見表3。

    圖4 a:OS組中耳腔黏膜無充血、增厚、血腫、粘連現(xiàn)象;b:OP組充血的血管(黑箭頭)與血腫(紅箭頭)相連;c:CP組中耳腔黏膜增厚(黃箭頭)、充血(紅箭頭),血腫(綠箭頭),滲出物(黑箭頭);d:CP組前庭池和骨螺旋板上大量黃色滲出物(黃色箭頭)。Fig.4 a:OS group middle ear mucosa without hyperemia,thickening,hematoma,or adhesion;b:OP group congested blood vessels(black arrow)connected to hematoma(red arrow);c:CP group middle ear mucosa increased thick(yellow arrow),hyperemia(red arrow),hematoma(green arrow),exudate(black arrow);d:CP group a large amount of yellow exudate on the vestibular cistern and bone spiral plate(yellow arrow).

    表3 中耳腔評分Table 3 Middle ear cavity score

    2.3 HE染色結果

    將CP組中耳腔及內(nèi)耳滲出物在載玻片上涂片,經(jīng)常規(guī)HE染色后可見大量炎癥細胞滲出(圖5)。

    圖5 a CP組中耳腔滲出物HE染色;b:CP組內(nèi)耳滲出物HE染色(10×40)。Fig.5 a:HE staining of exudate from middle ear cavity in CP group 2;b:HE staining of exudate from inner ear in CP group(10×40).

    2.4 耳蝸基底膜免疫熒光染色觀察結果

    OS組和CS組(圖6、圖7)和OP組(圖8)耳蝸基底膜各回三排外毛細胞排列整齊,細胞形態(tài)清晰可辨認,細胞無腫脹,外毛細胞無丟失,三組間不存在明顯差別;CP組(圖9)各回外毛細胞均有不同程度丟失,以第一排丟失最常見,部分細胞腫大、結構模糊。所有組內(nèi)毛細胞均未出現(xiàn)丟失。四組各回三排外毛細胞計數(shù)結果如表4所示,研究發(fā)現(xiàn)各回中CP組毛細胞計數(shù)顯著低于其他三組(P<0.05),其他三組間毛細胞計數(shù)無顯著差異(P>0.05)。

    圖6 OS組的三排外毛細胞排列整齊,細胞無腫脹、無缺失,纖毛呈V或W狀排列;OHC:外毛細胞,IHC:內(nèi)毛細胞;abcd依次為毛細胞第1、2、3、4回,×400Fig.6 In OS group,three rows of outer hair cells were arranged neatly,without swelling or deletion,and cilia were arranged in V or W shape;OHC:outer hair cells,IHC:inner hair cells;abcd is the first,second,third,and fourth circle of the basilar membrane,×400

    圖7 CS組與OS組細胞形態(tài)無差異,×400Fig.7 There was no difference in cell morphology between CS group and OS group,×400

    圖8 OP組基底膜毛細胞排列整齊均無丟失,形態(tài)正常,×400Fig.8 In OP group,basilar membrane hair cells were arranged neatly without loss,and their morphology was normal,×400

    圖9 CP組各回外毛細胞均有不同程度丟失(白圈),部分細胞腫大、結構模糊(黑圈),×400。Fig.9 CP group outer hair cells were lost to varying degrees in each round(white circles),and some cells were swollen and blurred in structure(black circles),×400.

    表4 四組動物耳蝸各回三排外毛細胞統(tǒng)計比較(個/高倍鏡,±s)Table 4 Statistical comparison of four rows of outer hair cells from cochlear each turn in three groups of animals(number/scope,±s)

    表4 四組動物耳蝸各回三排外毛細胞統(tǒng)計比較(個/高倍鏡,±s)Table 4 Statistical comparison of four rows of outer hair cells from cochlear each turn in three groups of animals(number/scope,±s)

    Note:b,OS vs CP P<0.05;d,OP vs CP P<0.05;e,CS vs CPP<0.05.

    Group OS OP CS CP Ear 8 18 8 18 1st turn 109.62±3.70b 109.33±4.67d 113.00±3.29e 84.11±25.06 2nd turn 107.87±3.09b 110.50±4.50d 110.50±3.50e 87.00±17.62 3rd turn 109.25±3.10b 109.77±5.03d 114.25±3.57e 91.50±22.44 4th turn 07.62±4.40b 110.50±4.38d 114.12±3.56e 90.77±13.52

    3 討論

    聚維酮碘是一種抗菌譜廣、效率高、起效迅速、安全性高、理化性質(zhì)穩(wěn)定的常用消毒劑,按化學物質(zhì)急性毒性分級標準屬實際無毒性,使用后10-30秒便能達到滿意效果,在臨床上常用于手術區(qū)域消毒、換藥、含漱、浸泡、術腔沖洗等方面。聚維酮碘系聚乙烯吡咯酮和碘的絡合物,聚乙烯吡咯烷酮作為載體,有助于增強碘的溶解度,在接觸到皮膚、黏膜后,緩慢釋放出游離碘,游離碘可使微生物機體的蛋白質(zhì)變性乃至凝固,導致死亡,而達到消毒殺菌的作用。目前市售碘伏有效碘含量為0.005g/ml,百分濃度為0.5%,多用于皮膚表面消毒;聚維酮碘溶液有效碘為0.05g/ml,百分濃度為5%。由此可見,后者的有效碘含量是前者的10倍,所以后者多用于手術創(chuàng)口的消毒[6-8]。

    聚維酮碘對皮膚黏膜刺激小,可用于黏膜的消毒,但對中耳和內(nèi)耳損害的研究,臨床研究結論與部分動物實驗結果與并不完全一致。周詳、李永等人[7,9]使用5%聚維酮碘治療中耳炎合并真菌感染后通過檢測純音聽閾檢查發(fā)現(xiàn)患者未出現(xiàn)聽力下降。Jaya C等[10]給慢性化膿性中耳炎患者使用5%聚維酮碘滴耳液滴耳,研究結束時未見明顯不良反應。Piromchai[11]報道了一位36歲的女性,她將大約三滴10%聚維酮碘滴入她的左耳道,她立即感到劇痛和眩暈,純音聽閾檢測提示左耳重度感音神經(jīng)性耳聾,磁共振成像顯示左側(cè)前庭輕度強化。因此,即使單次使用聚維酮碘也可能導致嚴重的聽力損失和平衡失調(diào)。

    在動物實驗中研究聚維酮碘溶液研究對內(nèi)耳是否有損害,不同實驗者的研究結果不同。Yagiz R等[12]通以豚鼠為實驗對象在鼓室內(nèi)注入0.1ml的10%聚維酮碘溶液,之后在第10天和第30天進行TEOAE檢測和耳鏡檢查。結果表現(xiàn)為TEOAE不能引出,6耳中發(fā)現(xiàn)2耳外耳道輕度水腫,4耳外耳道重度水腫。待外耳道皮膚消腫后行鼓室圖檢測仍然可以得到“A型”鼓室圖;而所有生理鹽水組耳的TEOAE反應、耳鏡檢查、鼓室圖檢測沒有改變,實驗結果表明聚維碘酮對豚鼠有耳蝸毒性作用;?zkiri?等[13]應用畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射研究不同濃度聚維酮碘溶液對大鼠中耳腔的耳毒性作用發(fā)現(xiàn)7.5%和10%聚維酮碘組在第1天和第10天表現(xiàn)出明顯的耳毒性作用,而5%聚維酮碘組在第10天沒有引起這種毒性作用,根據(jù)實驗結果提出大鼠鼓膜局部給藥可引起明顯的耳毒性作用;Ichibangase T等[14]通過通過測定圓窗膜復合動作電位發(fā)現(xiàn),使用10%濃度的溶液在24小時和7天時輕度聽力損失,但使用5%的溶液在第7天時沒有聽力損失,并提出術中用生理鹽水沖洗中耳腔可使該產(chǎn)品的耳毒性作用降至最低。Perez等[15]在耳內(nèi)應用10%聚維酮碘溶液5天后檢測前庭誘發(fā)電位和聽性腦干反應發(fā)現(xiàn)兩者實驗前后沒有明顯的變化,因此認為在對鼓膜穿孔的耳朵進行消毒時,聚維酮碘可能比其他藥物更好。以上實驗僅觀察了實驗后的人或動物聽力學及電生理的改變,并未從細胞形態(tài)學上進行研究。本實驗通過實驗研究觀察耳蝸毛細胞的變化情況,從形態(tài)學方面提供了最直接的證據(jù)來驗證聚維酮碘對內(nèi)耳的毒性。

    我們推測聚維酮碘溶液致聾可能有以下原因:1.骨迷路和膜迷路之間充滿細胞外液樣的外淋巴液,呈高鈉低鉀狀態(tài),局部使用的聚維酮碘經(jīng)圓窗膜滲入到內(nèi)耳后解離出來的I-擾亂了外淋巴液成分而致聾,且作用時間越久,致聾的可能性越大;2.聚維碘酮溶液進入中耳及內(nèi)耳后產(chǎn)生炎癥反應致聾,根據(jù)滲出物HE染色結果可以加以證實;3.I-在起消毒殺菌的作用時也對毛細胞產(chǎn)生了殺傷作用,我們通過免疫熒光染色可看出,CP組造成了外毛細胞丟失;而OP組可能由于作用時間短,來不及滲入到內(nèi)耳而未造成損害;4.聚維酮碘溶液的濃度可能與聽力損失的嚴重程度有關。另外有研究報道[16]聚維碘酮碘可能具有致突變作用,當?shù)庾饔糜诿毎械哪承┑鞍踪|(zhì)因子,如DNA或核糖體,然后這些因子可通過遺傳密碼中的堿基替換突變而被殺死。

    OP組雖無毛細胞丟失,但此時內(nèi)耳微環(huán)境可能發(fā)生了改變,毛細胞處于部分死亡而未溶解狀態(tài),功能已經(jīng)受到影響,因為ABR閾值提高但仍有殘余聽力。CP組均是造成外毛細胞的丟失,這可能是由于內(nèi)毛細胞對毒性的抵抗力較外毛細胞強,而不同排的外毛細胞受到的損傷程度相同[17]。此時內(nèi)耳微環(huán)境發(fā)生明顯改變,產(chǎn)生了大量炎癥滲出物,大量毛細胞死亡,部分毛細胞溶解,在基底膜上出現(xiàn)缺失,而此時的ABR處于高閾值狀態(tài)。

    從解剖學上講,與嚙齒類動物相比,人類的圓窗很少暴露于中耳腔,并且圓窗膜的厚度明顯更大且具有更多的膠原纖維。另外,臨床上使用的滴耳液通常是在局部炎癥的環(huán)境中進行的,而動物實驗研究通常是在健康的耳朵中進行的,急性炎癥可增加圓窗膜的通透性,而慢性炎癥由于組織纖維化而顯示出相反的效果[18],這可能是不同實驗結果不一致的原因之一。

    實驗從聽力學、中-內(nèi)耳解剖、免疫熒光染色及HE染色方面驗證了5%聚維酮碘溶液是具有耳毒性的。本實驗屬于動物實驗,下一步實驗將設置不同的藥物濃度梯度,探索最佳的藥濃度,即可有效消毒殺菌又不對聽力產(chǎn)生損害。同時,需大量臨床試驗和更有力度的檢測方法研究聚維酮碘的耳毒性,但基于目前的動物實驗結果,我們建議在耳科手術術前消毒時應當避免聚維酮碘溶液進入中耳以免產(chǎn)生損害。在手術消毒時我們可以用稍擠干的聚維酮碘棉片對外耳道及中耳黏膜進行填塞或擦洗,可降低聚維酮碘溶液經(jīng)圓窗膜滲入到內(nèi)耳的可能性。如不慎流入中耳腔應立即用生理鹽水沖洗干凈。另外,在中耳炎鼓膜穿孔合并外耳道真菌感染時也不建議使用聚維酮碘溶液進行耳浴治療,可局部填塞聚維酮碘紗條。

    猜你喜歡
    聚維酮毛細胞內(nèi)耳
    How Do We Hear Sounds我們是怎么聽到聲音的
    聽力下降也要查血脂
    幕上毛細胞星形細胞瘤的MR表現(xiàn)及誤診分析
    恐龍內(nèi)耳的秘密
    讓永久性耳聾患者有望恢復聽力的蛋白質(zhì)
    鳥綱類生物雞用于耳蝸毛細胞再生領域研究進展
    如何認識耳蝸內(nèi)、外毛細胞之間的關系
    交聯(lián)聚維酮在中藥微丸中的應用
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:52
    聚維酮k30在醫(yī)藥中的應用
    內(nèi)耳顯影助力眩暈疾病診斷
    日韩人妻精品一区2区三区| 久久午夜综合久久蜜桃| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 乱人伦中国视频| 国精品久久久久久国模美| 黑丝袜美女国产一区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 制服人妻中文乱码| 大香蕉久久网| 日韩一区二区三区影片| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲精品一区蜜桃| 久久影院123| 国产极品天堂在线| 亚洲中文av在线| 亚洲男人天堂网一区| 大陆偷拍与自拍| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产一区有黄有色的免费视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 飞空精品影院首页| 久久久国产欧美日韩av| 香蕉精品网在线| 国产片特级美女逼逼视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产精品久久久久久久久免| 老汉色∧v一级毛片| 最近中文字幕高清免费大全6| 成人漫画全彩无遮挡| 日本午夜av视频| 日韩一本色道免费dvd| 在线精品无人区一区二区三| 成年女人在线观看亚洲视频| 午夜影院在线不卡| 一级毛片我不卡| 久久精品久久精品一区二区三区| 波多野结衣一区麻豆| 黑丝袜美女国产一区| 波野结衣二区三区在线| 91精品三级在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 韩国精品一区二区三区| 亚洲情色 制服丝袜| 人成视频在线观看免费观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久精品国产综合久久久| av网站在线播放免费| 久久久久精品人妻al黑| 免费观看无遮挡的男女| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美最新免费一区二区三区| 秋霞在线观看毛片| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产毛片在线视频| 免费大片黄手机在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲三区欧美一区| 亚洲国产av新网站| 一级毛片电影观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 日韩制服骚丝袜av| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲av成人精品一二三区| 日韩三级伦理在线观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产成人精品无人区| 18禁国产床啪视频网站| 欧美精品一区二区免费开放| 久久久国产欧美日韩av| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 久久精品久久精品一区二区三区| 一二三四中文在线观看免费高清| av免费观看日本| 日本午夜av视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲四区av| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲人成电影观看| 国产在线免费精品| 日韩视频在线欧美| 久久精品国产综合久久久| 亚洲国产av影院在线观看| 国产精品免费大片| 亚洲熟女精品中文字幕| 香蕉丝袜av| 亚洲男人天堂网一区| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久久a久久爽久久v久久| www.自偷自拍.com| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产日韩欧美在线精品| 丝袜喷水一区| 亚洲国产精品国产精品| videossex国产| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 哪个播放器可以免费观看大片| 伊人亚洲综合成人网| 母亲3免费完整高清在线观看 | 久久久久国产一级毛片高清牌| 男的添女的下面高潮视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产日韩欧美在线精品| 91成人精品电影| 涩涩av久久男人的天堂| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 黄色 视频免费看| 秋霞在线观看毛片| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 色吧在线观看| 成人国语在线视频| 亚洲av成人精品一二三区| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 美女高潮到喷水免费观看| 99久国产av精品国产电影| 美女国产视频在线观看| 人人妻人人澡人人看| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 久久久久视频综合| 精品久久久久久电影网| 日日撸夜夜添| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 欧美成人午夜精品| 日本欧美视频一区| 一区福利在线观看| 五月开心婷婷网| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲内射少妇av| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 精品一区二区免费观看| a级毛片在线看网站| 精品福利永久在线观看| 不卡视频在线观看欧美| a级片在线免费高清观看视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产乱来视频区| 大片免费播放器 马上看| 各种免费的搞黄视频| 久久久久久伊人网av| 国产黄频视频在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产黄色免费在线视频| 人成视频在线观看免费观看| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲av日韩在线播放| 久久人妻熟女aⅴ| 国产熟女欧美一区二区| 99国产综合亚洲精品| 国产精品一区二区在线观看99| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 成人免费观看视频高清| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产成人精品在线电影| 熟女电影av网| 熟女av电影| h视频一区二区三区| 人妻 亚洲 视频| 九草在线视频观看| 久久久久久久久久久免费av| 熟女电影av网| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 又粗又硬又长又爽又黄的视频| av一本久久久久| 久久久久久久久免费视频了| 日日撸夜夜添| 波多野结衣一区麻豆| 婷婷色综合大香蕉| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲色图综合在线观看| av卡一久久| 久久久久网色| 亚洲欧美一区二区三区国产| 激情视频va一区二区三区| 水蜜桃什么品种好| av在线app专区| 国产成人一区二区在线| 欧美激情极品国产一区二区三区| 免费大片黄手机在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产探花极品一区二区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久婷婷青草| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 美女xxoo啪啪120秒动态图| 中文字幕最新亚洲高清| 国产片特级美女逼逼视频| 免费日韩欧美在线观看| 三级国产精品片| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 多毛熟女@视频| 两个人看的免费小视频| 国产97色在线日韩免费| 日本av手机在线免费观看| 97在线视频观看| 最近最新中文字幕免费大全7| 最黄视频免费看| 亚洲天堂av无毛| 免费在线观看黄色视频的| 国产精品无大码| 日本wwww免费看| 精品一区二区免费观看| 十分钟在线观看高清视频www| 777米奇影视久久| 激情五月婷婷亚洲| 国产成人91sexporn| √禁漫天堂资源中文www| 国精品久久久久久国模美| 国产精品嫩草影院av在线观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 免费看av在线观看网站| 久久久久久久国产电影| 精品国产一区二区三区四区第35| 麻豆乱淫一区二区| 美女视频免费永久观看网站| 18禁国产床啪视频网站| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 黑人欧美特级aaaaaa片| 中文字幕av电影在线播放| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 欧美激情 高清一区二区三区| 伊人亚洲综合成人网| 精品一区二区三区四区五区乱码 | av免费观看日本| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 精品一区在线观看国产| 男女高潮啪啪啪动态图| 中文字幕av电影在线播放| 卡戴珊不雅视频在线播放| av天堂久久9| 国产成人a∨麻豆精品| 一区二区三区四区激情视频| 中国国产av一级| 午夜日韩欧美国产| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久久久久久国产电影| 精品人妻在线不人妻| 午夜福利一区二区在线看| 国产又色又爽无遮挡免| 国产福利在线免费观看视频| 老鸭窝网址在线观看| 一级毛片 在线播放| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产男人的电影天堂91| 男女国产视频网站| 亚洲精品av麻豆狂野| 色播在线永久视频| 麻豆乱淫一区二区| 熟妇人妻不卡中文字幕| 新久久久久国产一级毛片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲经典国产精华液单| 国产精品 国内视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 水蜜桃什么品种好| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久久欧美国产精品| 热99久久久久精品小说推荐| 成人午夜精彩视频在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 国产福利在线免费观看视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 日韩一本色道免费dvd| 国产97色在线日韩免费| 精品第一国产精品| 9色porny在线观看| 免费观看无遮挡的男女| 色婷婷久久久亚洲欧美| 18禁观看日本| 免费看不卡的av| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲成色77777| 久久鲁丝午夜福利片| 一边摸一边做爽爽视频免费| 热re99久久国产66热| 久久免费观看电影| 超色免费av| 五月伊人婷婷丁香| 国产麻豆69| 国产黄色免费在线视频| 日本午夜av视频| 午夜久久久在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 99久久综合免费| 男男h啪啪无遮挡| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲欧美一区二区三区久久| 午夜免费鲁丝| 男女边摸边吃奶| 国产在线免费精品| 在线观看一区二区三区激情| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产伦理片在线播放av一区| 人妻一区二区av| 亚洲久久久国产精品| 1024香蕉在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| www.自偷自拍.com| 欧美日韩亚洲高清精品| 啦啦啦在线免费观看视频4| 精品第一国产精品| 国产精品一区二区在线不卡| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 热99国产精品久久久久久7| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 蜜桃在线观看..| 波野结衣二区三区在线| 纵有疾风起免费观看全集完整版| av.在线天堂| 香蕉国产在线看| 国产97色在线日韩免费| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产成人精品一,二区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产精品无大码| 日韩av免费高清视频| 亚洲av免费高清在线观看| 黄片小视频在线播放| 亚洲av国产av综合av卡| 久久ye,这里只有精品| 国产老妇伦熟女老妇高清| 人妻人人澡人人爽人人| 韩国av在线不卡| 亚洲欧美色中文字幕在线| 成年美女黄网站色视频大全免费| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲精品国产av成人精品| www.自偷自拍.com| 亚洲第一青青草原| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 校园人妻丝袜中文字幕| 9热在线视频观看99| 精品一品国产午夜福利视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久久久久久精品精品| 18禁观看日本| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 老女人水多毛片| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲av福利一区| 日日啪夜夜爽| 日本午夜av视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲国产精品999| 中文字幕最新亚洲高清| 日韩视频在线欧美| 久久久精品94久久精品| av视频免费观看在线观看| 亚洲av.av天堂| 伊人久久国产一区二区| 日本午夜av视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 香蕉丝袜av| 欧美人与性动交α欧美软件| 久久鲁丝午夜福利片| 国产av国产精品国产| 日韩,欧美,国产一区二区三区| √禁漫天堂资源中文www| 成人午夜精彩视频在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 免费在线观看黄色视频的| 18禁动态无遮挡网站| 大香蕉久久成人网| 国产精品99久久99久久久不卡 | 超色免费av| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产成人精品无人区| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 久久免费观看电影| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久久欧美国产精品| av免费观看日本| a 毛片基地| 国产有黄有色有爽视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲av日韩在线播放| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲在久久综合| 97在线视频观看| 国产精品不卡视频一区二区| 女人精品久久久久毛片| 国产一区有黄有色的免费视频| 一级片免费观看大全| 一级黄片播放器| 男女免费视频国产| 9191精品国产免费久久| 高清视频免费观看一区二区| 男男h啪啪无遮挡| 成人午夜精彩视频在线观看| 综合色丁香网| 黄色配什么色好看| 午夜激情久久久久久久| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲av男天堂| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 久久精品夜色国产| 欧美日韩综合久久久久久| 99久国产av精品国产电影| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 欧美成人午夜精品| 国产精品.久久久| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 亚洲精品第二区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产精品成人在线| 国产1区2区3区精品| 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲三级黄色毛片| 日韩一本色道免费dvd| 久久综合国产亚洲精品| 爱豆传媒免费全集在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 熟女av电影| 精品国产一区二区久久| 一本久久精品| 在线精品无人区一区二区三| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲,欧美,日韩| 日日撸夜夜添| 高清不卡的av网站| 午夜免费观看性视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 宅男免费午夜| 桃花免费在线播放| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲av福利一区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 女性生殖器流出的白浆| 精品第一国产精品| 久久人人爽人人片av| 久久女婷五月综合色啪小说| 性少妇av在线| a 毛片基地| 大话2 男鬼变身卡| 国产人伦9x9x在线观看 | 欧美激情高清一区二区三区 | 丰满饥渴人妻一区二区三| 九草在线视频观看| 人人澡人人妻人| 国产精品.久久久| 久久久久久久久免费视频了| 午夜福利乱码中文字幕| 国产人伦9x9x在线观看 | 制服丝袜香蕉在线| 国产视频首页在线观看| 国产精品二区激情视频| 日韩av免费高清视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 性少妇av在线| 男女午夜视频在线观看| 有码 亚洲区| 午夜影院在线不卡| 色婷婷av一区二区三区视频| 考比视频在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 不卡视频在线观看欧美| 色视频在线一区二区三区| 欧美人与善性xxx| 精品久久久精品久久久| 色网站视频免费| 一级a爱视频在线免费观看| 天堂中文最新版在线下载| 春色校园在线视频观看| 亚洲人成电影观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久精品久久久久久久性| 亚洲av中文av极速乱| 久久人人97超碰香蕉20202| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 亚洲五月色婷婷综合| av福利片在线| 欧美成人午夜免费资源| 精品国产一区二区久久| videos熟女内射| 亚洲久久久国产精品| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产爽快片一区二区三区| 欧美bdsm另类| 中文字幕亚洲精品专区| 大片电影免费在线观看免费| 秋霞伦理黄片| 亚洲精品av麻豆狂野| 女性生殖器流出的白浆| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| av福利片在线| 天堂俺去俺来也www色官网| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 9191精品国产免费久久| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲精品第二区| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产在线一区二区三区精| 久久精品国产自在天天线| 免费黄网站久久成人精品| 久久这里只有精品19| 热99久久久久精品小说推荐| 久久久久人妻精品一区果冻| 欧美变态另类bdsm刘玥| videossex国产| 夫妻性生交免费视频一级片| 最近的中文字幕免费完整| 超色免费av| 午夜福利视频在线观看免费| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产有黄有色有爽视频| 一本久久精品| 黄片无遮挡物在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产成人一区二区在线| 国产精品久久久久久av不卡| 国产精品国产av在线观看| 国产成人av激情在线播放| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲综合精品二区| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久久久久人人人人人| 精品久久久久久电影网| 精品人妻在线不人妻| 国产精品免费大片| 美女高潮到喷水免费观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲成国产人片在线观看| 深夜精品福利| 91精品国产国语对白视频| 美女大奶头黄色视频| 丰满少妇做爰视频| 日本av免费视频播放| 中文字幕亚洲精品专区| 日韩av免费高清视频| 伦理电影大哥的女人| 我要看黄色一级片免费的| 五月伊人婷婷丁香| 高清在线视频一区二区三区| 国产精品 欧美亚洲| 久久av网站| av不卡在线播放| 交换朋友夫妻互换小说| 欧美亚洲日本最大视频资源| 777米奇影视久久| 18禁国产床啪视频网站| 国产精品熟女久久久久浪| 91午夜精品亚洲一区二区三区| av在线app专区| 日韩av免费高清视频| 亚洲av电影在线进入| 中文字幕精品免费在线观看视频| av在线观看视频网站免费| 亚洲精品日本国产第一区| 国产成人精品久久久久久| 日日爽夜夜爽网站| 伦精品一区二区三区| 国产高清国产精品国产三级| 久久狼人影院| 男女国产视频网站| 久久这里有精品视频免费| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲av福利一区| 国产xxxxx性猛交| 青春草亚洲视频在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 |