免疫細胞在黃體發(fā)育及退化過程中的作用

趙久華，鄭舒婷，林鳳屏，王正朝

1福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點實驗室，福州 350007 2皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，安徽六安 237005

1968年，Lobel等[1]首先發(fā)現(xiàn)在牛黃體中存在白細胞，隨后研究還發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)淋巴細胞減少可以導(dǎo)致黃體功能障礙[2-4]。目前，越來越多的證據(jù)表明多種類型的免疫細胞存在于黃體中，如T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和樹突狀細胞等，參與黃體功能的調(diào)節(jié)，且在黃體的整個生命周期中發(fā)揮著重要作用[1-4]。

在哺乳動物黃體中，不僅存在不同類型的黃體細胞，而且還存在著不同類型的T細胞，這些T細胞均來源于骨髓造血干細胞[5-6]。在胸腺中，造血祖細胞通過分裂生成未成熟的胸腺細胞，成熟的胸腺細胞被釋放到外周組織。另外，胸腺功能是維持小鼠卵巢正常功能所必需的，先天性的或后天切除的無胸腺動物是不孕的且卵巢功能異常[6]。先天性免疫系統(tǒng)細胞起源于骨髓干細胞，如巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和樹突狀細胞。這些細胞進入卵巢后，參與卵巢排卵和黃體功能的調(diào)節(jié)過程[7-9]。Kizuka等[10]用小鼠骨髓移植模型演示了綠色熒光蛋白(green fluorescrent protein，GFP)標(biāo)記的骨髓細胞被轉(zhuǎn)移到黃體中的過程，這些GFP+細胞是巨噬細胞，表明巨噬細胞是在黃體成形過程中從骨髓被轉(zhuǎn)移到卵巢的。脾臟是卵巢的另一種免疫細胞儲存庫，Swirski等[11]發(fā)現(xiàn)脾臟是單核細胞儲存和快速分布部位，機體可以利用脾臟單核細胞調(diào)節(jié)炎癥。另外，Oakley等[12]發(fā)現(xiàn)卵巢中的白細胞數(shù)量與脾臟中的白細胞數(shù)量呈反比關(guān)系。脾切除的大鼠卵巢中白細胞的浸潤明顯減少，表明脾臟可以作為卵巢白細胞的直接儲庫。此外，在切除脾的假孕兔子中，白細胞數(shù)量和孕酮濃度顯著降低。

由此可見，免疫細胞在黃體形成及其功能調(diào)節(jié)中具有非常重要的作用。因此，在本實驗室先前關(guān)于哺乳動物卵巢黃體發(fā)育及其功能調(diào)節(jié)的工作基礎(chǔ)上[13-17]，本文綜述了不同類型的免疫細胞在哺乳動物黃體功能維持及其退化過程中的作用，旨在進一步了解黃體生物學(xué)功能，為臨床操控黃體功能提供重要的參考。

免疫細胞在黃體發(fā)育過程中的作用

在哺乳動物黃體中，T淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、多形核白細胞和樹突狀細胞是研究相對較多的免疫細胞。因此，我們分別概述這些免疫細胞在黃體發(fā)育及其功能維持中的作用。

T淋巴細胞在牛黃體中，T淋巴細胞的類型和CD4+/CD8+T細胞的數(shù)量從早期黃體階段到晚期黃體階段均沒有發(fā)生明顯變化，而且Poole等[18]發(fā)現(xiàn)牛黃體中T淋巴細胞的比例為：25% CD4+T細胞、45% CD8+T細胞和30% γδ+T細胞。研究發(fā)現(xiàn)女性外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)可以刺激體外培養(yǎng)的黃體細胞產(chǎn)生孕酮，且中期黃體細胞主要誘導(dǎo)γδ+T細胞的增殖，同時白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)的表達增加[19-21]。由此可見，功能性黃體可以通過產(chǎn)生免疫抑制性細胞因子IL-10對黃體中T淋巴細胞的增殖發(fā)揮免疫抑制作用。孕酮可以誘導(dǎo)小鼠γδ+T細胞合成IL-10和其他的Th2相關(guān)因子[21]，表明在功能性黃體中，黃體細胞和淋巴細胞之間可以通過孕酮相互影響。另外，黃體細胞雖然可以調(diào)節(jié)T淋巴細胞的增殖，但這些細胞沒有核孕酮受體，只表達膜孕酮受體。因此，孕酮對T淋巴細胞的作用表現(xiàn)為快速且特異性方式。

單核細胞和巨噬細胞單核細胞起源于骨髓干細胞，通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)移到特定組織，并根據(jù)組織微環(huán)境的情況分化為巨噬細胞，從而參與多種生理過程。在人、牛和豬的早期黃體中，巨噬細胞的數(shù)量顯著增多。Turner等[22]發(fā)現(xiàn)巨噬細胞在維持黃體血管完整性過程中具有非常重要的作用，巨噬細胞漸進性消除與卵巢出血有關(guān)，從而導(dǎo)致黃體內(nèi)皮細胞耗竭和紅細胞增多。Care等[23]發(fā)現(xiàn)由于妊娠黃體微血管網(wǎng)的破壞，引起巨噬細胞耗竭，血漿孕酮下降，導(dǎo)致胚胎植入停滯。另外，與顆粒細胞共同培養(yǎng)的外周血巨噬細胞具有促黃體形成作用。人單核細胞與黃體細胞共培養(yǎng)可增加白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)的釋放，而單核細胞有IL-8受體，所以黃體細胞條件性培養(yǎng)基可以通過IL-8刺激單核細胞的遷移[24]。黃體細胞與單核細胞之間的相互作用有助于黃體早期趨化因子釋放和白細胞募集的增加[25]?？梢?，巨噬細胞在維持卵巢血管完整性中起著非常重要的作用。

多形核白細胞在一些物種黃體中發(fā)現(xiàn)了多形核白細胞(polymorphonuclear leukocytes，PMN)，如中性粒細胞和嗜酸性粒細胞[24-27]。人血循環(huán)白細胞的60%是中性粒細胞，在急性炎癥反應(yīng)初期的非特異性階段起重要作用。在牛黃體早期階段，中性粒細胞數(shù)量和IL-8濃度相當(dāng)高，人黃體中中性粒細胞數(shù)量也相當(dāng)高，且大鼠妊娠黃體早期階段，中性粒細胞數(shù)量同樣很高。早期黃體的形成可以誘導(dǎo)PMN遷移，且IL-8可以刺激黃體內(nèi)皮細胞毛細管樣結(jié)構(gòu)的形成[26]。重要的是，IL-8可以有效地刺激黃體細胞產(chǎn)生孕酮，這與血管內(nèi)皮生長因子(vascular epithelial growth factor，VEGF)和纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2)的體外作用一樣[26-27]?？梢?，IL-8和中性粒細胞可以刺激黃體的形成與發(fā)育。PMN和IL-8在體內(nèi)和體外均可以誘導(dǎo)血管的增生，表明PMN和IL-8不僅在組織炎癥誘導(dǎo)和傷口愈合中起作用，而且在黃體血管增生調(diào)節(jié)中起作用[27]。在小鼠子宮內(nèi)膜微血管中檢測到了表達VEGF的中性粒細胞，且在中性粒細胞耗竭的小鼠中，內(nèi)皮細胞的增殖顯著降低[26]。Miyamoto等[27]發(fā)現(xiàn)VEGF對人中性粒白細胞具有趨化性作用，且可以被VEGF抗體的中和作用所阻斷。另外，F(xiàn)GF2也可以增加大鼠中性粒細胞的募集。在黃體發(fā)育過程中，檢測到了高表達的VEGF和FGF2[29]，表明IL-8、VEGF和FGF2作為PMN募集的刺激因子，在黃體早期階段發(fā)揮著協(xié)同作用。

嗜酸性粒細胞通常參與由寄生蟲感染、哮喘和過敏性疾病引起的免疫應(yīng)答，在人、牛和綿羊排卵后不久嗜酸性粒細胞就會滲透進入黃體，通過內(nèi)皮細胞表達的P選擇蛋白被募集到正在發(fā)育的黃體中[34]。在人黃體發(fā)育早期階段，黃體細胞表達嗜酸性粒細胞趨化因子RANTES(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，受激活調(diào)節(jié)正常T細胞表達和分泌因子)，表明它們在血管增生和類固醇激素合成中的重要調(diào)控作用[34]。另外，地塞米松可以誘導(dǎo)嗜酸性粒細胞數(shù)量減少，并導(dǎo)致孕酮濃度變低。

樹突狀細胞樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是先天性免疫和適應(yīng)性免疫所必需的細胞，可以引發(fā)T細胞特異性抗原呈遞[30]。越來越多的證據(jù)表明DC參與了抗原免疫反應(yīng)和抗原免疫耐受的誘導(dǎo)[30-31]。例如，在胚胎第4.5天，短暫消融DC將導(dǎo)致胚胎完全被吸收，表明DC在胎兒免疫耐受中起至關(guān)重要的作用。盡管牛黃體中是否存在DC尚未得到證實，但在小鼠卵巢中存在DC，且在黃體形成過程中不斷累積[31]。另外，條件性消除DC可以阻斷人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)誘導(dǎo)的排卵，干擾淋巴管的發(fā)育，并顯著抑制孕酮分泌[32]。由此可見，在黃體發(fā)育過程中，DC主要位于新形成的早期階段黃體，并參與孕酮合成和淋巴管生成的過程。

其他血小板是在凝血系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的血細胞，能夠產(chǎn)生誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞遷移的化學(xué)引誘物，參與傷口愈合和組織重塑的過程。Furukawa等[33]發(fā)現(xiàn)位于人早期黃體中的血小板，參與黃體發(fā)育，上調(diào)孕酮合成。

雖然免疫細胞在黃體發(fā)育過程中的作用已經(jīng)取得了一些進展，但其調(diào)控機制還有待進一步深入研究，如黃體免疫系統(tǒng)與妊娠識別和妊娠建立之間的關(guān)系尚不清楚。值得關(guān)注的是，目前的資料已經(jīng)表明免疫細胞不僅參與了黃體的形成及發(fā)育過程，而且還參與卵巢黃體功能的調(diào)節(jié)。

免疫細胞在黃體退化過程中的作用

子宮來源的或者外源的前列腺素F2α(prostaglandin F2α，PGF2α)啟動黃體退化，并迅速減少黃體孕酮分泌。在人、牛、豬、馬和小鼠等黃體退化過程中，巨噬細胞和T淋巴細胞數(shù)量顯著增加，表明這兩種類型的細胞在黃體退化過程中具有重要作用[35-37]。

T淋巴細胞在黃體退化過程中，發(fā)現(xiàn)了大量的CD4+和CD8+T細胞，表明這兩種類型的T細胞在黃體退化過程中起重要作用[20]。在體外，激活的PBMC可以抑制黃體生成素(luteinizing hormone，LH)刺激黃體細胞分泌孕酮。Cannon等[38]發(fā)現(xiàn)PGF2α給藥后分離的黃體細胞比PGF2α給藥前分離的黃體細胞對T細胞增殖的刺激作用更強，外源孕酮可以抑制T細胞增殖。在反芻動物循環(huán)T淋巴細胞中，γδ+T細胞占大部分，如γδ+T細胞占牛黃體T淋巴細胞的35%。Walusimbi等[39]發(fā)現(xiàn)退化的黃體細胞主要誘導(dǎo)γδ+WCl+T細胞的增殖，而功能性黃體細胞主要誘導(dǎo)γδ+WCl-T細胞的增殖。另外，功能性的黃體細胞增加了表達抗炎細胞因子IL-10的γδ+T細胞比例，但降低了表達黃體退化因子IFN-γ(interferon gamma，干擾素-γ)的γδ+T細胞比例[39]。因此，功能性黃體的微環(huán)境抑制了固有T細胞活性，而退化的黃體微環(huán)境則恢復(fù)了這些T細胞活性，促進了黃體組織結(jié)構(gòu)的消亡。在胚胎植入期間，調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+CD25+Foxp3+T細胞)對免疫耐受調(diào)節(jié)至關(guān)重要[40]。牛黃體中CD4+Foxp3+T細胞比外周血中更多，但使用PGF2α后退化黃體中Foxp3+T細胞數(shù)量大大減少[18]。由此可見，F(xiàn)oxp3+T細胞可以調(diào)節(jié)固有T細胞的功能，防止黃體開始退化。因此，F(xiàn)oxp3+T細胞數(shù)量的減少直接與黃體退化有關(guān)。

巨噬細胞巨噬細胞是功能性黃體所必需的，但在黃體退化早期階段也出現(xiàn)了大量的巨噬細胞[23-25]。在牛黃體退化過程中，70%的增殖細胞是CD14+巨噬細胞。在兔黃體退化過程中，X4+和D68+巨噬細胞數(shù)量顯著增加。另外，炎性細胞因子(如TNF-α，IL-1b和IFN-γ)和趨化因子(如CCL2)也參與了黃體退化。這些因子可以誘導(dǎo)巨噬細胞和T淋巴細胞積聚在黃體中，產(chǎn)生炎癥和免疫應(yīng)答，促進黃體退化的級聯(lián)反應(yīng)[41-43]。因此，黃體主要通過凋亡損失細胞，發(fā)生退化，且凋亡的黃體細胞會被巨噬細胞吞噬。一般來說，巨噬細胞和T淋巴細胞可以根據(jù)外部刺激條件產(chǎn)生多種細胞因子，增加免疫炎癥反應(yīng)，并與外周固有細胞進行交流，如IL-1s、IL-2、IL-4、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、IFN-α、IFN-γ和前列腺素[23-25]。關(guān)于巨噬細胞和T淋巴細胞與這些細胞因子之間的關(guān)系已有許多研究，如TNF-α蛋白存在于牛黃體細胞、內(nèi)皮細胞和免疫細胞中，可以增加天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性、抑制孕酮分泌、誘導(dǎo)IFN-γ和Fas介導(dǎo)的細胞死亡[44]。另外，IFN-γ還可以抑制LH刺激黃體細胞合成孕酮，增加前列腺素的合成，誘導(dǎo)細胞死亡。

中性粒細胞中性粒細胞是最早被募集到炎癥部位的細胞，從而提供細胞因子和蛋白水解酶。在PGF2α誘導(dǎo)牛黃體退化過程中，中性粒細胞被迅速募集到黃體中，這個過程大約5 min[45-46]。同樣，PGF2α給藥后中性粒細胞迅速在馬黃體中積累。為了產(chǎn)生這種快速反應(yīng)，PGF2α直接刺激P選擇蛋白表達，并通過P選擇蛋白增強中性粒細胞黏附在黃體內(nèi)皮細胞中[45-46]。急性炎癥的特征在于中性粒細胞在幾分鐘內(nèi)迅速滲透并且持續(xù)出現(xiàn)T淋巴細胞和巨噬細胞遷移。中性粒細胞可產(chǎn)生多種炎性細胞因子來募集T淋巴細胞和巨噬細胞，如IL-8，TNF-α和IFN-γ[41-43]。PGF2α使用后6～24 h的牛黃體中，發(fā)現(xiàn)了大量的T淋巴細胞和巨噬細胞，這些免疫細胞被認為是黃體組織快速消亡所必需的[45-46]。由此可見，PGF2α誘導(dǎo)的黃體退化與急性炎癥反應(yīng)有關(guān)，伴隨著急性遷移的中性粒細胞，這些細胞招募其他免疫細胞到正在退化的黃體中。CD18抗體預(yù)處理不僅可以顯著抑制PGF2α誘導(dǎo)的中性粒細胞積累，而且還可以顯著抑制血清孕酮濃度的降低[23-25]。N-甲?；?甲硫氨酰-L-亮氨酰苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine，fMLP)激活大鼠中性粒細胞后，與黃體細胞共同孵育，可以顯著減少LH刺激黃體細胞積累cAMP和分泌孕酮，這取決于中性粒細胞的數(shù)量[41-43]。然而，Talbott等[47-49]利用IL-8和PMA激活中性粒細胞，然后再與牛黃體細胞共培養(yǎng)，并沒有減少孕酮分泌。因此，滲入牛黃體中的中性粒細胞可能是黃體功能性退化的啟動因子，而不是誘導(dǎo)因子。

目前的資料已經(jīng)表明免疫細胞除了參與黃體發(fā)育的過程外，還直接參與黃體退化的過程，但這些不同類型的免疫細胞在黃體退化過程中作用方式及其分子調(diào)控尚有待進一步研究。

總結(jié)與展望

在哺乳動物，黃體的生理功能是合成并分泌大量的孕酮，在胚胎的命運中起著至關(guān)重要的作用。在卵巢排卵之后，黃體細胞分泌各種趨化因子和細胞因子，募集免疫細胞到正在發(fā)育的黃體中，如中性粒細胞、巨噬細胞、T細胞和樹突狀細胞。在黃體早期發(fā)育階段，這些免疫細胞通過釋放IL-8、PGE2、VEGF和FGF2，增加孕酮分泌。這些招募的免疫細胞和黃體細胞釋放的細胞因子可以刺激血管增生和淋巴管生成。另外，子宮PGF2α是黃體退化的起始信號，募集各種免疫細胞進入黃體，如巨噬細胞、T淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞。PGF2α可以促進各種炎性細胞因子(TNF-α，IL-1和IFN-γ)和趨化因子(如CCL2和IL-8)的產(chǎn)生，這些因子可以募集巨噬細胞、中性粒細胞和T淋巴細胞進入黃體，并通過炎癥和免疫反應(yīng)增強黃體退化的級聯(lián)反應(yīng)。此外，抑制血管增生和誘導(dǎo)血管收縮可以誘發(fā)炎癥免疫反應(yīng)，導(dǎo)致孕酮分泌減少、細胞凋亡與細胞吞噬。進一步研究黃體血管病學(xué)和免疫學(xué)的功能調(diào)控機制，將有助于豐富我們對生殖生理學(xué)與卵巢生物學(xué)的認識。